PLoS ONE: Nährstoffe Regulate Differen Nucleobindin-2 /Nesfatin-1 in vitro in Cultured Magen Ghrelinoma (MGN3-1) Zellen und in vivo in Male Mice

Abstrakt

Nesfatin-1 sezerniert, Mahlzeit-responsive anorexigenic Peptid in dem Vorläufer codiert Nucleobindin-2 [NUCB2]. Zirkulierende nesfatin-1 steigt nach prandially, aber die Nahrungsbestandteile, die NUCB2 /nesfatin-1 bleiben unbekannt modulieren. Wir vermuten, dass Kohlenhydrate, Fett und Protein unterschiedlich gewebespezifische Expression von nesfatin-1 regulieren. NUCB2, Prohormonkonvertasen und nesfatin-1 wurden in der Maus Magen ghrelinoma nachgewiesen [MGN3-1] Zellen. NUCB2 mRNA und Protein wurden in Mäuseleber detektiert und Dünn- und Dickdarm. MGN3-1 Zellen wurden mit Glucose, Fettsäuren oder Aminosäuren behandelt. Männliche C57BL /6-Mäuse wurden chronisch hohem Fett-, Kohlenhydrat- und hoher Protein-Diät 17 Wochen gefüttert. Quantitative PCR und nesfatin-1-Tests wurden verwendet nesfatin-1 an mRNA und Protein-Ebene zu bestimmen. Glucose stimuliert NUCB2 mRNA-Expression in MGN3-1 Zellen. L-Tryptophan erhöht auch NUCB2 mRNA-Expression und Ghrelin-mRNA-Expression, und nesfatin-1-Sekretion. Oleinsäure gehemmt NUCB2 mRNA-Expression, während Ghrelin-mRNA-Expression und Sekretion verstärkt wurde. NUCB2 mRNA-Expression signifikant niedriger in der Leber von Mäusen eine proteinreiche Diät gefüttert worden im Vergleich zu Mäusen gefüttert anderen Diäten. Chronische Aufnahme von hohen Fett-Diät führte zu einer signifikanten Reduktion der NUCB2 mRNA im Magen, während eine hohe Protein und fettreiche Ernährung ähnliche Unterdrückung der NUCB2 mRNA im Dickdarm verursacht. Keine Unterschiede in Serum nesfatin-1-Mengen wurden in Mäusen bei 7 a.m, bei Beginn der Lichtphase gefunden. Kohlenhydratreiche Diät gefütterten Mäusen zeigten signifikant nesfatin-1-Spiegel in Serum 01.00 nesfatin-1 wurde erhöht signifikant niedriger in Mäusen hohen Fett, Eiweiß oder Kohlenhydrat im Vergleich zu den Kontrollen auf 7 p.m zugeführt, unmittelbar vor der Dunkelphase. Mäuse, die einen Bolus von hohem Fett erhalten hatte nesfatin-1 /NUCB2 zu allen Zeitpunkten getestet post-Schlundsonde signifikant erhöht im Vergleich zu Kontrollmäusen und Mäusen, gefüttert anderen Diäten. Unsere Ergebnisse zum ersten Mal zeigen, dass nesfatin-1 von Nährstoffen moduliert wird

Citation. Mohan H, Ramesh N, Mortazavi S, Le A, Iwakura H, Unniappan S (2014) Nutrients Differen Regulate Nucleobindin-2 /Nesfatin-1 in-vitro-Hotels in Cultured Magen Ghrelinoma (MGN3-1) Zellen und in Vivo
bei männlichen Mäusen. PLoS ONE 9 (12): e115102. doi: 10.1371 /journal.pone.0115102

Editor: Yvette Tache, University of California, Los Angeles, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 1. Mai 2014; Akzeptiert: 18. November 2014; Veröffentlicht: 15. Dezember 2014

Copyright: © 2014 Mohan et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Datenverfügbarkeit. Die Autoren bestätigen, dass alle Daten, die Ergebnisse sind in vollem Umfang zur Verfügung, ohne Einschränkung zu Grunde liegen. Alle relevanten Daten sind in der Papier und seine Hintergrundinformationen Dateien

Finanzierung: Diese Arbeit wurde von einem offenen Betriebskostenzuschuss von der kanadischen Insitutes of Health Research (CIHR finanziert wird; http:. //www.cihr-irsc. gc.ca/e/193.html) und eine Einrichtung Grant von der Saskatchewan Health Research Foundation (http://shrf.ca/). SU ist ein CIHR New Investigator. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zu veröffentlichen. Funders haben keine Rolle in der Forschung oder Manuskripterstellung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Nesfatin-1 [NEFA /NUCB2 -encoded Sättigung und Fett beeinflussenden Protein-1] ist ein potenter anorexigenic Peptid in der Regulation der Energiebilanz und Glukose-Homöostase beteiligt [1], [30]. Es ist ein 82-Aminosäure-Peptid aus dem Vorläuferprotein abgeleitet ist, Nucleobindin-2 (NUCB2) [1]. NUCB2 ist aus 396 Aminosäuren zusammengesetzt ist, bestehend aus zwei EF-Hand Motive und eine DNA-Bindungsdomäne [1], [3]. Post-translationale Prozessierung von Prohormonkonvertasen (PC 1/3 und PC 2) bewirkt NUCB2 in drei Peptide gespalten wird, nesfatin-1 (1-82 Aminosäuren), nesfatin-2 (85 bis 163 Aminosäuren) und nesfatin- 3 (166 bis 396 Aminosäuren). NUCB2 /nesfatin-1-Aminosäuresequenz ist hoch über Vertebraten konserviert [6], [7], [31]. NUCB2 /nesfatin-1 wird in verschiedenen Hypothalamuskernen gefunden, die im Energiestoffwechsel, beispielsweise den bogenförmigen Kern, Nucleus paraventricularis, Nucleus Supraopticus, lateralen Hypothalamus Bereich und zona increta beteiligt sind [8], [9]. Insulin produzierenden Beta-Zellen co-express nesfatin-1 in den pankreatischen Inseln von Ratten und Mäusen [2], [4], [11], was darauf hindeutet, dass nesfatin-1 könnte eine wichtige Rolle bei der Insulinsekretion und Glukose-Homöostase spielen [4], [29]. Ghrelin und NUCB /nesfatin-1 sind in den Magen-Schleimhaut oxyntic Drüsen bei Nagetieren [13] und Menschen [16] colocalized. NUCB2 mRNA-Expression in gereinigten Magenschleimhaut endokrinen Zellen wurde als im Gehirn von Ratten, höher zu sein, gefunden [13]. Die volle Länge NUCB2 Protein wurde in den Dünn- und Dickdarm und in der Leber von männlichen Ratten und ICR-Mäuse [5] beobachtet. Die weite Verbreitung von NUCB2 /nesfatin-1 in den zentralen und peripheren Geweben deutet auf eine Rolle für nesfatin-1 in den Stoffwechsel zu regulieren.

Die tägliche Verabreichung von nesfatin-1 verursacht erweiterten Verringerung der Nahrungsaufnahme und das Körpergewicht [1] . Intracerebroventricular Verabreichung von NUCB2 unterdrückt die Nahrungsaufnahme, Körpergewicht und subkutan, mesenterialen und epididymal Fettmasse bei erwachsenen Ratten in einer dosisabhängigen Weise. Darüber hinaus verursacht NUCB2 Knockdown in Ratten durch Antisense-Morpholino-Oligonucleotid Infundieren (as-MON) eine Zunahme des Appetits und des Körpergewichts [1]. Intra-Nucleus paraventricularis Injektion von nesfatin-1 reduziert kumulative Nahrungsaufnahme bei 1 und 3 Stunden [9]. Intraperitoneale Injektionen von nesfatin-1 führte zu einer Verringerung der Nahrungsaufnahme in Leptin resistent db /db
Mäuse und fettreiche Diät gefütterten Mäusen [8]. Nesfatin-1 besteht aus drei Strukturfragmenten zusammengesetzt und nur die Mitte-Fragment (Reste 24-53; M30) von nesfatin-1 in der Herstellung von anorektischen Reaktionen beteiligt [15], [28]. Zusammen bieten diese Ergebnisse klar belegen, dass Sättigungseffekte von nesfatin-1 unterstützen.

Nesfatin-1 ist eine Mahlzeit in Reaktion glucoregulatory Hormon [12], [13], und Pankreas-Inseln von Ratten NUCB2 in Reaktion auf Glukose freisetzen [14]. In Studien am Menschen, hatte Glucose behandelten Patienten höher basalen nesfatin-1-Spiegel im Vergleich zu der Kontrollgruppe [10]. In MIN6-Zellen, eine 4-fache Zunahme in nesfatin-1-Spiegel beobachtet wurde, wenn die Zellen in hohen Glucose (16,7 mM) im Vergleich zu niedrigen Glukose (2,0 mM) inkubiert wurden [4]. Nesfatin-1 verstärkte Glucose stimulierte Insulinsekretion aus kultivierten MIN6-Zellen, die als in einer dosisabhängigen Weise bei niedrigen Glucose in hoher Glucose inkubiert wurden [4]. In der Bauchspeicheldrüse von Streptozotocin (STZ) -injected Mäusen mit Typ-1-Diabetes wurde festgestellt, dass sowohl NUCB2 und Präproinsulin-mRNA-Expression signifikant niedriger waren [4]. Im Gegensatz dazu verbesserte nesfatin-1 Co-Lokalisation mit Insulin wurde in den Beta-Inselzellen von hohen Fett-Diät-induzierten adipösen Mäusen mit Typ-2-Diabetes gefunden. Nesfatin-1 hat gewebespezifische Wirkungen auf die Glukoseaufnahme in Rattenadipocyten und Muskel [30]. Insgesamt nesfatin-1 übt eine wichtige Rolle im ganzen Körper Glukose und Energie-Homöostase regulieren.

Während nesfatin-1 wird als eine wichtige Mahlzeit ansprechende Peptid Schwellen [1], [12], [13], [30] , was löst ihre Sekretion bleibt unklar. Welche Diät Komponenten lösen die postprandiale Sekretion von nesfatin-1? Diese Frage bleibt unadressierte. Der Schwerpunkt dieser Studie ist es zu bestimmen, wie verschiedene Nährstoffe NUCB2 /nesfatin-1 In-vitro-
in kultivierten Magen ghrelinoma (MGN3-1) Zellen von Mäusen und in vivo
bei männlichen modulieren kann Mäusen. Unsere Ergebnisse aus unserem In-vitro-Studien zeigen, dass
MGN3-1 Zellen reagieren unterschiedlich auf die Nährstoffe in sezerniere NUCB2 /nesfatin-1 und Ghrelin. In ähnlicher Weise akute oder chronische Aufnahme von Nährstoffen beeinflusst NUCB2 mRNA-Expression und NUCB2 /nesfatin-1-Freisetzung in einer Diät spezifische Art und Weise.

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Alle Studien Tiere erfüllt mit dem Canadian Council of Animal Care Richtlinien und wurden von der Animal Research Ethics Board der University of Saskatchewan (Protokollnummer 2012-0033) zugelassen.

In-vitro-Studien mit

Maus Magen ghrelinoma (MGN3-1) Zellen [17] wurden in DMEM (Invitrogen, Ontario, Kanada, Katalogw95-040), das mit 10% fötalem Rinderserum (Invitrogen ergänzt wurde; 12484 Catalogue # ) und 1% Penicillin (100 U /ml) und Streptomycin (100 ug /ml) (Invitrogen, Katalog.140-122) bei 37 ° C in 10% CO _{2. Bei 80% Konfluenz wurden MGN3-1 Zellen ausgesät bei 6 × 10 ^{6 Zellen /Well in einer 12-Well-Platte und die Studien durchgeführt wurden, wenn die Zellen 80-90% konfluent waren. Jede Studie wurde dreimal wiederholt und die Daten aus drei Studien wurden gepoolt, um eine n = 9-12 erhalten Wells /Behandlung. Um zu bestimmen, ob Glucose eine Wirkung in einer dosis- und zeitabhängigen Weise hatten, wurden die Zellen für 1 Stunde und 2 Stunden inkubiert mit 5,6, 25, 50 und 100 mM Glucose DMEM Medien. Das vollständige Wachstumsmedium von MGN3-1 Zellen verlangt, dass sie auf einem hohen Glucosespiegel zu wachsen, die 25 mM ist. In Bezug auf die Studien mit Fettsäuren und Aminosäuren durchgeführt, führten wir diese Studien DMEM bei niedrigem Glukosespiegel (5,6 mM) unter Verwendung, da eine hohe Glucosemedium (25 mM) auf NUCB2 /nesfatin die Wirkung der jeweiligen Nährstoffe maskieren könnten -1 Sekretion und Synthese. Bezüglich langkettiger Fettsäuren, testeten wir die Wirkung von drei verschiedenen Fettsäuren unter Verwendung von Linolensäure (Sigma-Aldrich, Ontario, Canada; Produkt # L2376), Octansäure (Sigma-Aldrich, Produkt # C2875) und Ölsäure (Sigma -Aldrich; Produkt # O1383). Die Zellen wurden für 4 Stunden mit je Fettsäuren inkubiert bei 0, 1, 10, 100 uM. Wir verwendeten L-Tryptophan (Sigma-Aldrich, Produkt # T8941) die Wirkung einer Aminosäure auf NUCB2 Sekretion und Synthese zu testen. Die Zellen wurden 0,7, für 4 Stunden mit L-Tryptophan bei 1, 10 mM inkubiert. L-Tryptophan ist in dem Kontrollmedium (5,6 mM Glucose DMEM) bei einer Mindestdosis von 0,7 mm, die für ihre Wachstumsbedingungen wesentlich ist.}}

In Vivo Studies

für die chronische Fütterung von Diäten unterschiedlichen Mengen an bestimmten Nährstoffen, Alter und Gewicht abgestimmt, die (5 Wochen alt, durchschnittliches Körpergewicht: 20 Gramm) männliche C57BL /6-Mäuse (Charles River Laboratories, Quebec, Kanada) wurden einzeln untergebracht für 17 Wochen in einem 12 Stunden Licht: 12 Stunden dunkel-Zyklus (Licht an 19.00 Uhr und auf um 7 Uhr aus), Temperatur und Feuchtigkeit kontrolliert Vivarium. Die Mäuse wurden in vier Gruppen unterteilt auf einer Steuer gespeist (n = 6), kohlenhydratreiche (n = 7), hohe Protein (n = 7) und mit hohem Fettgehalt (n = 7) Diät mit ad libitum
Zugang zu Wasser und ihre spezielle Diät. Alle Diäten wurden von Research Diets (New Brunswick, NJ) erworben. Der Kaloriengehalt von Diäten waren: Kontrolle (Product # D12451): 4,73 kcal /g mit 20% Energie aus Eiweiß stammen, 35% Energie aus Kohlenhydraten und 45% Energie aus Fett abgeleitet sind; hohen Kohlenhydrat (Produkt # D12450J) hatten 3,8 kcal /g mit 20% Energie aus Eiweiß stammen, 70% Energie aus Kohlenhydraten und 10% Energie aus Fett abgeleitet sind; High-Protein (Produkt # D08091802) hatten 3,8 kcal /g mit 60% Energie aus Eiweiß stammen, 30% Energie, die aus Kohlenhydraten und 10% Energie aus Fett und fettreiche (Produkt # D12492) hatten 5,2 kcal /g mit 20% Energie aus Eiweiß stammen, 20% Energie aus Kohlenhydraten und 60% Energie aus Fett abgeleitet ist. Alle Mäuse wurden für eine Woche mit der Kontrolldiät gefüttert vor ihrer spezifischen Diäten beginnen. Die Nahrungsaufnahme, Körpergewicht und Blutzuckerwerte Post 4 Stunden schnell gemessen wurden einmal pro Woche für 17 Wochen

Für die akute Verabreichung von Nährstoffen, Alter und Gewicht abgestimmt (5 Wochen alt, durchschnittliches Körpergewicht.: 20 Gramm) männliche C57BL /6-Mäuse (Charles River Laboratories, St. Constant, QU, Kanada) wurden einzeln für 1 Woche und 2 Tage in einem 12 h Licht untergebracht: 12 h dunkel-Zyklus (Licht an 19.00 Uhr und auf um 7 Uhr ab ), Temperatur und Feuchtigkeit kontrollierten Vivarium. Die Mäuse wurden für 1 Woche bei der Ankunft akklimatisiert und hatten freien Zugang zu Wasser und regelmäßige Mäusefutter für 11 Tage. Da wir eine akute Diätstudie durchführen, mussten wir die Tiere auf die orale Gabe Verfahren zu akklimatisieren. Wir akklimatisiert die Mäuse auf dieses Verfahren, indem sie mit Leitungswasser für 2 Tage vor dem Versuchstag gavaging. Auf der 12 ^{th Tag wurden die Mäuse für 4 Stunden gefastet und wurden mit einem spezifischen flüssigen Nahrung zwangsernährt. Die Mäuse wurden in vier Gruppen unterteilt: High-Protein (Isopure Protein Drink, Zero Carb - Mango Pfirsich-Aroma, das Beste der Natur, Clifton Park, New York; n = 7), Hoch Fett (Splendido, Präsident 's Choice, Kalte Extra Virgin Olivenöl gepresst Kanada, n = 7), hohe Kohlenhydrat (D-Glucose; BioShop; Catlogue # GLU501.500; n = 7) und Wasser (Leitungswasser; n = 7). Am Tag der Untersuchung wurden 200 ul der obigen Nährstoffe /Wasser wurde den Mäusen durch orale Gabe verabreicht. Blutzuckerwerte wurden nach 0, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90 und 120 Minuten, und das Blut wurde bei 15 gesammelt, 30, 60 und 120 Minuten für die ELISA-Analyse Ebenen NUCB2 /nesfatin zu bestimmen zirkulierende -1. Gewebe (Magen, Dünndarm [Duodenum], Dickdarm und Leber) wurden von jeder Maus nach Beendigung der Studie (tiefe Isofluran Euthanasie gefolgt von Zervikaldislokation) gesammelt. Zur Aufrechterhaltung der Konsistenz, der Zeitpunkt und die Dauer jedes Experiment, Operationen und Probenentnahme konstant gehalten wurden für alle Studien.}

Gesamt-RNA-Extraktion und cDNA-Synthese

Die Zellen oder Gewebe aus jeder Studie gesammelt wurden, NUCB2 mRNA-Expression zu vergleichen. Von den Mäusen, die wurden die chronische Diätstudie, Gewebe (Magen, Dünndarm, Dickdarm und der Leber) wurden unmittelbar nach der Euthanasie geerntet. Gesamt-RNA wurde aus den Zellen und Geweben MGN3-1 extrahiert, unter Verwendung des TRIzol RNA Isolation Reagenz (Invitrogen). RNA Reinheit wurde durch die optische Dichte (OD) Absorptionsverhältnis (OD 260 nm /OD 280 nm) unter Verwendung eines ND-2000C (Thermo, Vantaa, Finnland) validiert. Nur Proben mit einem Absorptionsverhältnis von mehr als 1,8 wurden für die cDNA-Synthese verwendet. Synthese von cDNAs wurde mit iScript cDNA-Synthese-Kits durchgeführt, wie vom Hersteller gerichtet (BioRad, Kanada).

RT-PCR und quantitative Echtzeit-PCR

RT-PCR und qRT-PCR für NUCB2, Ghrelin und RT-PCR für PC 1/3 und PC 2 wurden gemäß Bedingungen durchgeführt in Tabelle 1 dargelegt, die CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) verwendet wird. Für die qRT-PCR-Analyse der mRNA-Expression von NUCB2 wurde unter Verwendung von Beta-Actin als Housekeeping-Gen normalisiert. PCR-Produkte für NUCB2 im Magen, Leber und Dickdarm und dieser Gene (NUCB2, Ghrelin, PC 1/3 und PC 2) in den MGN3-1 Zellen wurden in 1% Agarosegel elektrophoretisiert amplifizierten Transkripte zu verifizieren. Basierend auf früheren Studien [4] verwendeten wir beta-Aktin als interne Kontrolle das Signal NUCB2 mRNA zu normieren. Wenn die Gesamt-RNA unter Verwendung von in dem mRNA Quantifizierung sehr genau war, zeigten die kritische Schwellwerte für beta-Actin keine Variabilität. Relative NUCB2 mRNA-Expression wurde mit beta-Actin aus derselben Probe normiert, entsprechend dem Livak Methode [31].

Immuncytochemie und Mikroskopie

MGN3-1 Zellen wurden in einer Kammer Labtek Gleitsystem (Nalge Nunc international, Rochester, NY) und wurden in der Nähe der Konfluenz wachsen gelassen. Zellen wurden mit 1 × Phosphatpufferlösung gewaschen (PBS, 2 × 5 Minuten, 25 ° C) und bei 25 ° C für 10 Minuten in 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung in 1X PBS fixiert, gefolgt von einem weiteren Waschschritt mit 1X PBS ( 3 × 5 Minuten, 25 ° C). Die fixierten Zellen wurden in einer Lösung von 0,3% Triton-X (Bioshop, Burlington, Ontario, Canada) in 1X PBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur permeabilisiert. Die Objektträger wurden in Blockierungspuffer, enthaltend 10% Ziegenserum in 1X PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden dann über Nacht in primärem Antikörper (Tabelle 2) bei 4 ° C inkubiert. Die Objektträger wurden mit PBS (3 × 5 Minuten, 25 ° C) gewaschen und mit sekundärem Antikörper (Tabelle 2, der PC1 /3-Antikörper war ein großzügiges Geschenk von Dr. Iris Lindberg, University of Maryland School of Medicine) für 4 Stunden bei Zimmertemperatur. Schließlich wurden die Objektträger mit PBS (3 × 5 Minuten, 25 ° C) gewaschen und montiert mit Vectashield Eindeckmediums 4 'enthält, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Vector Laboratories, Burlington, Ontario, Kanada).

Die Zellen wurden mit einem Nikon Eclipse Ti invertierten Fluoreszenzmikroskop (Nikon, Mississauga, Ontario, Kanada) und Bilder betrachtet wurden eine Nikon DS-Qi1 MC-Kamera (Nikon) erfasst werden. Die Bilder wurden mit analysiert NIS-Elements der Grundlagenforschung Software (Nikon) auf einem Dell HP Workstation. Die Abbildungen zeigen repräsentative gefärbten Zellen für Ghrelin, NUCB2, PC 1/3 und PC2. Für hochauflösende Bildgebung wurden die Zellen betrachtet, analysiert und Bilder mit einem Leica TCS SP5 konfokalen Mikroskop erfasst.

Western-Blot-Analyse, Immunhistochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie

Für das Vorhandensein von Nucleobindin-2 bestätigt (NUCB2) im Darm und in der Leber, drei, 3 Monate alte C57BL /6 männliche Mäuse wurden verwendet. Kurz gesagt, der Leber und der Dünn- und Dickdarm wurden gesammelt, und für die Western-Analyse oder Immunhistochemie getrennt. Gewebe für Western-Blot homogenisiert in T-PER Gewebe Proteinextraktion Reagenz (Thermo Scientific,̑10), gefolgt Proteinkonzentationsbestimmung von Bradford-Test. Die Proben wurden in 1X Laemmli-Puffer, enthaltend 0,2% 2-Mercaptoethanol (Bio-Rad¡-0737 und -0710) hergestellt und wurden für 5 min, gefolgt von Vortexen bei 95 ° C anschließend gekocht. Die gesamte Probenvolumen (20 ul) jeweils 50 &mgr; g Protein oder synthetischen Ratten nesfatin-1 (ABGENT, 1 ug /ul; verwendet, die zuvor in 4, 29) auf ein Gel aufgetragen, und 8-16 in einer Mini-PROTEAN TGX laufen % Gradientengel (Bio-Rad,Lj-1104). Nach der Trennung wurden die Proteine ​​auf eine 0,2 um BioTrace Nitrocellulosemembran (Pall Life Sciences,.377-000) überführt und dann wurde Membran in 1X RapidBlock Lösung (AMRESCO, # M325) blockiert. NUCB2 Proteinnachweis wurde unter Verwendung von Kaninchen-anti-nesfatin-1 (Katalognummer H-003-22; 1:500 Verdünnung; Phoenix Pharmaceuticals, California) und GAPDH-Protein wurde unter Verwendung von Kaninchen-Antiserum gegen Maus-GAPDH (AbDSerotec, # AHP1628 ) verdünnt 1:1000. Als sekundärer Antikörper, Ziege-anti-Kaninchen-IgG (H + L) HRP-Konjugat (Bio-Radª-6515) verdünnt 1:3000 verwendet. Zur Proteinvisualisierung wurde die Membran für 5 min in Clarity ECL Western-Substrat (Bio-Radª-5061) inkubiert und abgebildet ChemiDoc MP-Abbildungssystem (Bio-Radª-8280) mit Chemilumineszenz-Detektion. Membran Strippen zwischen Proteinnachweis wurde mit geführt Restore Plus Western-Blot-Stripping-Puffer (Thermo Scientific,ǐ30). Precision Plus Protein Dual xtra-Standards (Bio-Rad,¡-0377) wurden als Molekulargewichtsmarker verwendet.

Für immunhistochemischen Untersuchungen, die gesammelten Gewebe wurden für 24 Stunden bei 4 ° C in 4% Formaldehyd fixiert. Fixativ wurde mit Ethanol (drei 70% Ethanol) ersetzt wird, jeweils gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 4 ° C. Die Gewebe wurden dann bei 4 ° C in 70% Ethanol gelagert und verarbeitet wurden und auf der Prairie Diagnostic Services Inc. (PDS Inc., Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan) geschnitten. Paraffinschnitte von 4 &mgr; m Dicke wurden für die Immunfärbung vorbereitet. und rehydriert in einer abgestuften Ethanolreihe (inkubiert zweimal in 100% Ethanol und einmal in jedem 95% Ethanol, 70% Ethanol, 50%; Diese Schnitte wurden mit Xylol (5 Minuten, 25 ° C inkubiert, zweimal in 100% Xylol) entparaffiniert Ethanol, jeweils 2 Minuten, 25 ° C). Die Schnitte wurden dann mit 3% Wasserstoffperoxid in destilliertem Wasser inkubiert endogene Peroxidase-Aktivität (30 Minuten bei Raumtemperatur) zu blockieren. Die Schnitte wurden dann mit Serum-freiem Protein Block Reagenz (DAKO Corporation, Kalifornien) für 10 Minuten blockiert, bevor mit primären Antikörpern inkubiert wird. Diese Abschnitte wurden dann mit Kaninchen-Anti-nesfatin-1 inkubiert (Katalognummer H-003-22; 1:500 Verdünnung; Phoenix Pharmaceuticals, Kalifornien) für 24 Stunden bei Raumtemperatur. Alle Objektträger wurden gewaschen, anschließend dreimal mit 1x PBS gewaschen und mit Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Texas Red (Red-Nesfatin-1; Katalognummer TI-1000; 1:100 Verdünnung; Vector Laboratories, California) Sekundärantikörper für 1 Stunde bei Raum Temperatur. Alle primären und sekundären Antikörper wurden in Antikörper-Verdünnungsmittel-Reagenz (DakoCytomation, Mississauga, Ontario) verdünnt. Die Objektträger wurden dreimal mit 1x PBS und sieben Mal mit destilliertem Wasser gewaschen. Schließlich wurden die Objektträger mit Vectashield Medium angebracht, die Kernfarbstoff DAPI enthalten (blau, Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornien). Die Schnitte wurden unter einem Nikon Eclipse-Ti-E invertierten Fluoreszenzmikroskop (Nikon Kanada, Mississauga, Kanada) angesehen. Die Bilder wurden mit einem Dell HP Workstation-Computer und NIS Elemente der Grundlagenforschung Imaging-Software (Nikon Kanada, Mississauga, Kanada) verbunden mit einer Nikon DS-QI1 MC gekühlt Monochrom-Kamera eingefangen. Nur repräsentative Bilder von Dünn- und Dickdarm-Färbung für NUCB2 /nesfatin-1 mit DAPI sind im Ergebnisteil dargestellt.

Nesfatin-1 /NUCB2 Spiegel im Serum und Medien

Um Nährstoff abhängig untersuchen Änderungen in NUCB2 /aus MGN3-1 Zellen nesfatin-1-Sekretion, Medien wurde nach bestimmten Inkubationszeiten gesammelt. Um Zelltrümmer zu verhindern, wurden zentrifugiert Proben (13000 rpm für 10 Minuten bei 4 ° C) und der oberen 700 &mgr; l wurde bis zur Messung nesfatin-1 bei -20 ° C gelagert. Zur Messung der zirkulierenden NUCB2 /nesfatin-1 wurde Blut bei 7 a.m gesammelt (kurz nach der Lichtphase beginnt), 13.00 Uhr (Mitte der Lichtphase) und bei 7 p.m (vor Beginn der Dunkelphase). Blutproben wurden erlaubt auf Eis gerinnen und das Serum durch Zentrifugation (7000 rpm, für 9 Minuten bei 4 ° C) und bei -20 ° C wurde abgetrennt, bis Assays durchgeführt wurden. NUCB2 /Nesfatin-1-Sekretion Ebenen in den Medien wurden gemessen, um die Nesfatin-1 unter Verwendung von (1-82) (Rat) ELISA-Kit (Katalognummer EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., Kalifornien). Die Grenze der Empfindlichkeit des Assays betrug 1,2 ng /ml für nesfatin-1, mit detektierbaren Bereich von 0,1 bis 1000 ng /mL. Die Menge an immunoreaktiven Materials wurde eine nicht-lineare Regressionskurvenanpassung ermittelt, die verwendet wurde, um die Konzentration von NUCB2 /nesfatin-1-Sekretion im Serum und Medienproben.

NUCB2 /Nesfatin- zu quantifizieren und zu vergleichen 1 Spiegel im Serum und Medien und total Ghrelin Ebenen in Medien

Um Nährstoffabhängige Veränderungen in NUCB2 /nesfatin-1 und insgesamt Ghrelin-Sekretion aus MGN3-1 Zellen zu untersuchen, Medien wurde nach bestimmten Inkubationszeiten gesammelt. Um Zelltrümmer zu verhindern, wurden zentrifugiert Proben (13000 rpm für 10 Minuten bei 4 ° C) und der oberen 700 &mgr; l wurde bei -20 ° C bis NUCB2 /Nesfatin-1 und die Gesamt Ghrelin Messung gespeichert. Blutproben wurden erlaubt auf Eis gerinnen und das Serum durch Zentrifugation (7000 rpm, für 9 Minuten bei 4 ° C) und bei -20 ° C wurde abgetrennt, bis Assays durchgeführt wurden. NUCB2 /Nesfatin-1-Sekretion Spiegel im Serum und Medien wurden gemessen, um die Nesfatin-1 unter Verwendung von (1-82) (Rat) ELISA-Kit (Katalognummer EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., Kalifornien). Die Grenze der Empfindlichkeit des Assays betrug 1,2 ng /ml für nesfatin-1, mit detektierbaren Bereich von 0,1 bis 1000 ng /mL. In ähnlicher Weise wurde die Gesamt Ghrelin Sekretionsmengen in den Medien gemessen, um die Ghrelin mit (Ratte, Maus) EIA-Kit (Katalognummer EK-031-31, Phoenix Pharmaceuticals Inc, Kalifornien). Die Grenze der Assay-Sensitivität betrug 1,16 ng /ml für insgesamt Ghrelin, mit detektierbaren Bereich von 0-100 ng /mL. Die Menge an immunoreaktiven Materials bestimmt wurde eine nicht-lineare Regressionskurvenanpassung verwenden, die benutzt wurde, um die Konzentration von NUCB2 /nesfatin-1-Sekretion im Serum und Medienproben.

Statistische Analyse

die Analysen der quantifizierten qRT-PCR und ELISA-Daten wurden von Tukey-Mehrfachvergleichstest gefolgt One-Way ANOVA durchgeführt werden. GraphPad Prism Version 5 (GraphPad Software Incorporated, San Diego, CA, USA) wurde für statistische Auswertungen und Grafiken verwendet. Die Signifikanz wurde zugewiesen, wenn p < 0,05. Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt.

Ergebnisse |

NUCB2, PC 1/3 und PC 2 mRNAs exprimiert in Zellen und MGN3-1 NUCB2 mRNA wird im Magen, Leber exprimiert, kleine Darm und Dickdarm von männlichen Mäusen

Wir identifizierten die Expression von NUCB2 (202 bp), Prohormonkonvertase 1/3 (400 bp) und Prohormonkonvertase 2 (406 bp) mRNAs in MGN3-1 Zellen (Abb. 1A). NUCB2 (202 bp) mRNA-Expression wurde auch in den Magen, Leber, Dünndarm und Dickdarm von männlichen C57 /BL6-Mäusen (Fig. 1B) detektiert. Absolute Mengen an NUCB2 mRNA-Expression in den Magen waren höher als NUCB2 mRNA-Expression in der Leber, Dünndarm und Dickdarm (Fig. 1C).

MGN3-1 Zellen immunopositive sind Ghrelin, NUCB2 /Nesfatin-1 , PC 1/3 und PC 2

Fluoreszenzmikroskopie dargestellt MGN3-1 Zellen, gefärbt mit Anti-nesfatin-1-Antikörper (Texas-Rot; Fig. 2B) und Anti-Ghrelin-Antikörper (FITC-Grün; Fig. 2A) zeigte deutliche Kolokalisation (Gelb, Fig. 2C) von nesfatin-1 und Ghrelin Immunreaktivität. Es wurden jedoch einige Ghrelin positive Zellen nicht immunoreaktiv für nesfatin-1 (Fig. 2C). MGN3-1 Zellen zeigten PC 1/3 Immunreaktivität (Texas Red, Fig. 2D) und PC 2 Immunreaktivität (Texas Red, Fig 2E.). DAPI (blau) gefärbt, um die Kern aller dieser Zellen nicht positiv für die untersuchten Proteine, einschließlich Zellen. Kontroll-Objektträger gefärbt mit sekundären Antikörper allein (Abb. 2F) hatte keine Immunreaktivität. Die konfokale Bildgebung zeigte MGN3-1 Zellen mit anti-nesfatin-1-Antikörper (Texas-Rot; Fig. 3A) und anti-Ghrelin-Antikörper (FITC-Grün; Fig. 3B) zeigte deutliche Kolokalisation (Gelb, Fig. 3C) von nesfatin-1 und Ghrelin Immunreaktivität. Die Negativkontrolle gefärbt mit nur sekundären Antikörper allein (Abb. 3D).

NUCB2 Protein-Expression in Dickdarm, Dünndarm und Leber von männlichen Mäusen

NUCB2 Protein wird im Dickdarm ausgedrückt, Dünndarm und in der Leber von männlichen Mäusen zeigt deutliche Bande für NUCB2 KDa auf ca. 50 entspricht. Ratte nesfatin-1-Peptid als eine positive Kontrolle verwendet wird, dargestellt als eine deutliche Bande auf etwa 10 kDa entspricht (Fig 4a;. Linkes Bild). Allerdings zeigt verarbeitet keine Banden der vollständig nesfatin-1 bei 10 kDa in den Gewebeproben sichtbar wurden (4A;. Linkes Bild). Wir fanden auch Banden von etwa 47 kDa unter der 50 kDa Bande im Dünndarm und in der Leber, aber nicht in den Dickdarm (4A;. Linkes Bild). Eine deutliche Bande für GAPDH verwendet als Steuer Housekeeping-Gen wird bei 37 kDa in allen Geweben gezeigt beobachtet (4A;. Bild rechts). und Dickdarms (Fig. 4B; rechtes Bild).

Effekte von Glukose und L-Tryptophan auf NUCB2; NUCB2 /nesfatin-1-Immunreaktivität in den Schleimhautzellen des Dünndarms (. linkes Bild 4B) gefunden mRNA-Expression in und NUCB2 /nesfatin-1-Sekretion aus Zellen MGN3-1

Zellen mit 100 mM Glucose DMEM inkubiert hatte eine höhere NUCB2 mRNA-Expression als inkubierten Zellen bei 5,6, 25 und 50 mM DMEM Glucosekonzentrationen bei 1 Stunden nach der Inkubation (Abb. 5A). Bei 2 Stunden nach der Inkubation inkubierten Zellen bei 100 mM DMEM waren signifikant höher in NUCB2 mRNA-Expression als inkubierten Zellen bei 5,6 und 50 mM Glucose DMEM (Fig. 5C). Bei 1 Stunde (Fig. 5B) und 2 Stunden (Fig. 5D), gab es keine signifikanten Unterschiede in NUCB2 /nesfatin-1 Sekretion. NUCB2 mRNA-Expression war signifikant höher in Zellen in 10 mM inkubiert L-Tryptophan (Fig. 5E) im Vergleich zu Zellen mit 0,07 und 1,0 mM L-Tryptophan inkubiert. NUCB2 /nesfatin-1-Sekretion aus Zellen, inkubiert bei 1,0 und 10,0 mM L-Tryptophan waren signifikant höher als bei 0,7 mM inkubierten Zellen L-Tryptophan (Fig. 5F).

Wirkung von Linolensäure, Octansäure und Öl Säure auf NUCB2 mRNA-Expression in und NUCB2 /nesfatin-1-Sekretion aus Zellen MGN3-1

NUCB2 mRNA Expression signifikant in Zellen, die mit 1, 10 und 100 uM Ölsäure (Fig. 6E) behandelt reduziert gefunden im Vergleich zur Kontrolle. Keine Änderungen in NUCB2 mRNA wurden in Zellen, behandelt mit Linolensäure (Fig. 6A) und Octansäure (Fig. 6C) beobachtet. Weiterhin war NUCB2 /nesfatin-1-Sekretion in Zellen unverändert mit verschiedenen Dosierungen von Linolensäure behandelt (Fig. 6B), Octansäure (Fig. 6D) und Ölsäure (Fig. 6F).

Wirkung von L-Tryptophan, Linolensäure, Octansäure und Ölsäure unabhängig auf Ghrelin-mRNA-Expression in und insgesamt Ghrelin-Sekretion aus MGN3-1 Zellen

Keine Änderungen in Ghrelin mRNA (S1A Bild) und insgesamt Ghrelin-Sekretion (S1B Abbildung ) wurden gefunden, wenn die Zellen mit verschiedenen Dosen von Glucose post 1-stündigen Inkubation behandelt wurden. Ghrelin mRNA-Expression signifikant höher bei 1 mM L-Tryptophan inkubierten Zellen (Fig. 7A) im Vergleich zu Zellen, inkubiert mit 0,07 und 10 mM L-Tryptophan. Kein signifikanter Unterschied in Gesamt-Ghrelin-Sekretion aus Zellen, die mit verschiedenen Dosen von L-Tryptophan behandelt (Fig. 7B). Wir fanden keine Veränderung in Ghrelin-mRNA-Expression (Fig. 7C), aber insgesamt Ghrelin-Sekretion war hoch bei 100 uM von Linolensäure inkubierten Zellen (Fig. 7D) im Vergleich zur Kontrolle, 1 und 10 uM Dosen. Keine Änderungen in Ghrelin mRNA (Fig. 7E) und Gesamt-Ghrelin-Sekretion (Fig. 7F) gefunden wurden, wenn die Zellen mit verschiedenen Dosen von Octansäure behandelt wurden. Inzwischen Ghrelin mRNA (Fig. 7H), und die Gesamt Ghrelin-Sekretion (Fig. 7I) waren signifikant höher in mit 100 uM Ölsäure behandelten Zellen, verglichen mit der Kontrolle, 1 und 10 uM Ölsäure.

Chronic Wirkung von Nährstoffen auf NUCB2 mRNA-Expression und Serum NUCB2 /nesfatin-1 bei Mäusen

Das Körpergewicht, Nahrungsaufnahme und Blutzuckerprofil von Mäusen auf verschiedenen Diäten gefüttert werden in S2 dargestellt. Mäuse auf einer fettreichen Diät gefüttert hatten signifikant niedriger Expression von NUCB2 mRNA im Magen im Vergleich zu denen auf einem Steuerzugeführt, protein oder kohlenhydratreiche Diäten (Abb. 8A). Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Expression von mRNA NUCB2 in den Dünndarm zwischen Mäusen auf einem Steuer gespeist, hoher Proteingehalt, hohem Kohlenhydrat oder fettreichen Diäten (Fig. 8B). Gefütterte Mäuse auf dem hohen Protein-und fettreichen Diäten haben vergleichsweise geringe Expression von NUCB2 mRNA im Dickdarm als Mäuse auf Kontrolle oder kohlenhydratreiche Diäten gefüttert (Abb. 8C). Mäuse auf einem hohen Protein-Diät gefüttert hatte einen signifikanten niedrige Expression von NUCB2 mRNA in der Leber als Mäuse auf den anderen Diäten gefüttert (Fig. 8D). Bei 7 a.m, gab es keine Unterschiede im Serum nesfatin-1 /NUCB2 Spiegel in Mäusen gefüttert unterschiedlichen Diäten (Fig. 9A). Bei 1 p.m, die hohen Kohlenhydrat-Diät gefüttert Mäuse hatten signifikant höhere Serum nesfatin-1 /NUCB2 Umlauf (Fig. 9B). Serum nesfatin-1 /NUCB2 war signifikant niedriger bei Mäusen hohe Kohlenhydrat, Protein oder hohem Fettgehalt, verglichen gefüttert Diät gefütterten Mäusen zu steuern, um 7 Uhr (Abb. 9C).

Akute Wirkungen von Nährstoffen auf NUCB2 mRNA-Expression Blutglukose und Serum NUCB2 /nesfatin-1 in Mäusen

Es gab keine signifikanten Veränderungen in der Expression von mRNA NUCB2 in den Magen (Fig. 10A), des Dünndarms (Fig. 10B), Dickdarm (Fig . 10C) und Leber (Abb. 10D) zwischen auf einem hohen Proteingehalt, hoher Kohlenhydrat, Fett oder Wasser gefütterten Mäusen.

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