PLoS ONE: Nutriënten Differentieel Regulate Nucleobindin-2 /Nesfatin-1 in vitro in gekweekte Maag Ghrelinoma (MGN3-1) cellen en in vivo in Male Mice

Abstract

Nesfatin-1 wordt afgescheiden, maaltijd-responsieve anorexigenic peptide gecodeerd in de voorloper nucleobindin-2 [NUCB2]. Circulerende nesfatin-1 verhoogt post-prandiaal, maar de voedingscomponenten die moduleren NUCB2 /nesfatin-1 blijven onbekend. Onze hypothese was dat koolhydraten, vetten en eiwitten differentieel reguleren weefsel specifieke expressie van nesfatin-1. NUCB2, prohormoon convertases en nesfatin-1 werden gedetecteerd in de muis maag ghrelinoma [MGN3-1] cellen. NUCB2 mRNA en eiwit werden ook gedetecteerd in muizenlever en dunne en dikke darm. MGN3-1 cellen werden behandeld met glucose, vetzuren of aminozuren. Mannelijke C57BL /6 muizen werden gevoed chronisch hoog vet, veel koolhydraten en eiwitrijk dieet gedurende 17 weken. Kwantitatieve PCR en nesfatin-1 assays werden gebruikt voor nesfatin-1 bepalen in mRNA en eiwitniveaus. Glucose gestimuleerd NUCB2 mRNA expressie in MGN3-1 cellen. L-tryptofaan ook toegenomen NUCB2 mRNA expressie en ghreline mRNA expressie, en nesfatin-1 secretie. Oliezuur remde NUCB2 mRNA expressie, terwijl ghreline mRNA expressie en uitscheiding werd versterkt. NUCB2 mRNA expressie was significant lager in de lever van muizen gevoed een eiwitrijk dieet in vergelijking met muizen gevoed andere diëten. Chronische inname van vetrijke voeding veroorzaakte een significante vermindering NUCB2 mRNA in de maag, terwijl hoog eiwit en hoog vet dieet soortgelijke onderdrukking van NUCB2 mRNA veroorzaakte in de dikke darm. Geen verschillen in serum nesfatin-1 bleken bij muizen 7 a.m, bij het begin van de lichtperiode. Koolhydraatrijk dieet gevoed muizen vertoonden significant verhoogde nesfatin-1 niveaus 13:00 Serum nesfatin-1 was significant lager bij muizen gevoed hoog vet, eiwit of koolhydraat vergelijking met de controles op 7 pp m, net voor de donkere fase. Muizen die een bolus van vetrijke ontvangst significant verhoogd nesfatin-1 /NUCB2 bij alle geteste na gavage tijdstippen vergeleken met controlemuizen en muizen gevoed andere diëten. Onze resultaten voor de eerste keer aan te geven dat nesfatin-1 wordt gemoduleerd door voedingsstoffen

Visum:. Mohan H, Ramesh N, Mortazavi S, Le A, Iwakura H, Unniappan S (2014) Nutriënten Differentieel Regulate Nucleobindin-2 /Nesfatin-1 in Vitro
in gekweekte Maag Ghrelinoma (MGN3-1) Cellen en in Vivo
bij mannelijke muizen. PLoS ONE 9 (12): e115102. doi: 10.1371 /journal.pone.0115102

Editor: Yvette Tache, University of California, Los Angeles, Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 1 mei 2014; Aanvaard: 18 november 2014; Gepubliceerd: 15 december 2014

Copyright: © 2014 Mohan et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Availability:. De auteurs bevestigen dat alle gegevens waarop de bevindingen zijn volledig beschikbaar zonder beperking. Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering: Dit onderzoek wordt gefinancierd door een open exploitatiesubsidie ​​van de Canadese Insitutes of Health Research (CIHR; http:. //www.cihr-irsc. gc.ca/e/193.html) en een vestiging Subsidie ​​van de Saskatchewan Health Research Foundation (http://shrf.ca/). SU is een CIHR New Investigator. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript. Financiers hebben geen rol in het onderzoek of manuscript voorbereiding

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Nesfatin-1 [NEFA /NUCB2 gecodeerde verzadiging en vet beïnvloeden proteïne-1] is een krachtige eetlustremmende peptide betrokken bij de regulering van energiebalans en glucose homeostase [1], [30]. Het is een 82 aminozuur peptide afgeleid van het precursoreiwit, nucleobindin-2 (NUCB2) [1]. NUCB2 bestaat uit 396 aminozuren, bestaande uit twee EF kant motieven en een DNA bindend domein [1], [3]. Posttranslationele verwerking door prohormoon convertases (PC 1/3 en PC 2) oorzaken NUCB2 te splitsen in drie peptiden, nesfatin-1 (1-82 aminozuren), nesfatin-2 (aminozuren 85-163) en nesfatin- 3 (aminozuren 166-396). NUCB2 /nesfatin-1 aminozuursequentie is sterk geconserveerd in vertebraten [6], [7], [31]. NUCB2 /nesfatin-1 wordt gevonden in verschillende hypothalamische kernen die betrokken zijn bij de energiestofwisseling, zoals de boogvormige nucleus, paraventriculaire nucleus, supraoptische nucleus, laterale hypothalamus en zona increta [8], [9]. Insuline producerende beta-cellen co-express nesfatin-1 in de pancreatische eilandjes van ratten en muizen [2], [4], [11], wat suggereert dat nesfatin-1 een belangrijke rol spelen in insulinesecretie en glucose homeostase [4], [29]. Ghrelin en NUCB /nesfatin-1 worden colocalized in de maag oxyntic mucosale klieren in knaagdieren [13] en mens [16]. NUCB2 mRNA expressie in maagslijmvlies gezuiverde endocrine cellen bleek hoger dan in de hersenen van ratten [13] zijn. De volledige lengte NUCB2 eiwit werd waargenomen in de dunne en dikke darm en lever van mannelijke ratten en muizen ICR [5]. De brede verspreiding van NUCB2 /nesfatin-1 in de centrale en perifere weefsels wijst op een rol voor nesfatin-1 in het reguleren van de stofwisseling.

Dagelijkse toediening van nesfatin-1 veroorzaakte uitgebreide vermindering van de voedselinname en het lichaamsgewicht [1] . Intracerebroventriculaire toediening van NUCB2 onderdrukt voedselinname, lichaamsgewicht en subcutane, mesenterische en epididymale vetmassa bij volwassen ratten in een dosis afhankelijke wijze. Bovendien NUCB2 knockdown in ratten door infusie morfolino antisense oligonucleotide (als-MON) geleid tot een verhoogde eetlust en lichaamsgewicht [1]. Intra-paraventricular kern injectie van nesfatin-1 vermindert de cumulatieve voedselinname bij 1 en 3 uur [9]. Intraperitoneale injecties van nesfatin-1 resulteerde in een vermindering van voedselinname bij leptine resistent db /db muizen en
vetrijke dieet gevoerd muizen [8]. Nesfatin-1 bestaat uit 3 structurele fragmenten en alleen de mid-fragment (resten 24-53, M30) van nesfatin-1 is betrokken bij de productie anorectische reacties [15], [28]. Samen vormen deze resultaten tonen duidelijk dat de effecten van verzadiging nesfatin-1 ondersteunen.

Nesfatin-1 is een maaltijd reageert glucoregulatoire hormonen [12], [13] en pancreaseilandjes ratten vrij NUCB2 reactie op glucose [14]. In humane studies, glucose behandelde patiënten hadden hogere basale nesfatin 1-niveaus in vergelijking met controle-individuen [10]. In MIN6 cellen, een 4-voudige toename in nesfatin-1 niveaus werd waargenomen wanneer de cellen in hoog glucosegehalte (16,7 mM) geïncubeerd vergeleken met laag glucose (2,0 mM) [4]. Nesfatin-1 verbeterde glucose gestimuleerde insulinesecretie uit gekweekte MIN6 cellen die in hoge glucose geïncubeerd dan in lage glucose in een dosis afhankelijke wijze [4]. In de pancreas van streptozotocine (STZ) -injected muizen met type 1 diabetes, bleek dat zowel NUCB2 en prepro mRNA expressie was significant lager [4]. Daarentegen versterkte nesfatin-1 co-lokalisatie met insuline werd gevonden in de eilandjes beta cellen van vetrijk dieet-geïnduceerde zwaarlijvige muizen met type 2 diabetes. Nesfatin-1 heeft weefselspecifiek effect op glucoseopname in adipocyten rat en spier [30]. Overall, nesfatin-1 oefent een belangrijke rol bij het reguleren van de totale glucose en energie homeostase.

Hoewel nesfatin-1 is in opkomst als een belangrijke maaltijd reagerende peptide [1], [12], [13], [30] , wat triggers de afscheiding blijft onduidelijk. Wat dieet componenten leiden tot de post-maaltijd afscheiding van nesfatin-1? Deze vraag blijft ongeadresseerde. De belangrijkste focus van dit onderzoek is om te bepalen hoe verschillende voedingsstoffen NUCB2 /nesfatin-1 In vitro
in gekweekte maag ghrelinoma (MGN3-1) cellen kunnen moduleren van muizen en In vivo
bij mannelijke muizen. Onze resultaten van onze in vitro
studies geven aan dat MGN3-1 cellen verschillend reageren op voedingsstoffen in afscheidende NUCB2 /nesfatin-1 en ghreline. Op dezelfde manier, acute of chronische inname van voedingsstoffen heeft invloed NUCB2 mRNA expressie en NUCB2 /nesfatin-1 release in een dieet specifieke manier.

Materialen en methoden

Verklaring Ethiek

Alle studies met dieren voldoet aan de Canadese Raad van Animal Care richtlijnen, en werden goedgekeurd door de Animal Research Ethics van Bestuur van de Universiteit van Saskatchewan (Protocol Number 2012-0033).

In Vitro
studies

Mouse maag ghrelinoma (MGN3-1) cellen [17] werden gekweekt in DMEM (Invitrogen, Ontario, Canada; catalogus.995-040) dat werd aangevuld met 10% foetaal runderserum (Invitrogen, Catalogus|84 ) en 1% penicilline (100 U /ml) en streptomycine (100 ug /ml) (Invitrogen, Catalogus.140-122) bij 37 ° C in 10% CO _{2. Bij 80% confluentie werden cellen gezaaid op MGN3-1 6 x 10 ^{6 cellen /putje in een 12-wells plaat en de studies werden uitgevoerd bij cellen 80-90% confluent. Elke studie werd driemaal herhaald en de gegevens van drie studies werden samengevoegd tot een n = 9-12 putjes /behandeling te verkrijgen. Vaststellen of glucose werking in een dosering en tijd afhankelijke manier had, werden cellen geïncubeerd gedurende 1 uur en 2 uur met 5,6, 25, 50 en 100 mM glucose DMEM media. De complete groeimedium van MGN3-1 cellen vereist dat ze worden steeds op een hoog glucosegehalte, dat is 25 mm. Met betrekking tot de onderzoeken met vetzuren en aminozuren, voerden we deze studies gebruikt DMEM bij lage glucosegehalten (5,6 mM), aangezien onder toepassing van een hoge glucose medium (25 mM) kan het effect van de respectievelijke nutriënten op NUCB2 /nesfatin maskeren -1 secretie en synthese. , Octaanzuur (Sigma-Aldrich, Artikel # C2875) en oliezuur (Sigma, ten opzichte van langketenige vetzuren, het effect van drie verschillende vetzuren middels linoleenzuur (Product # L2376 Sigma-Aldrich, Ontario, Canada) getest -Aldrich; Artikel # O1383). De cellen werden gedurende 4 uur bij elke vetzuren op 0, 1, 10, 100 pM. We gebruikten L-tryptofaan (Sigma-Aldrich, Artikel # T8941) om het effect van een aminozuur op NUCB2 secretie en synthese te testen. De cellen werden gedurende 4 uur met L-tryptofaan op 0,7, 1, 10 mM. L-tryptofaan aanwezig in de controle medium (5,6 mM glucose DMEM) met een minimale dosis van 0,7 mM, wat essentieel is voor hun groei aandoening.}}

In vivo studies

voor de chronische voeding diëten die variërende hoeveelheden specifieke voedingsstoffen, leeftijd en gewicht aangepast (5 weken oud, gemiddeld lichaamsgewicht: 20 g) mannelijke C57BL /6 muizen (Charles River Laboratories, Quebec, Canada) werden afzonderlijk gehuisvest 17 weken in een 12 uur licht: 12 uur donker cyclus (lichten uit om 19:00 en om 07:00), temperatuur en vochtigheid terrarium. Muizen werden verdeeld in vier groepen gevoed met een controle (n = 6), veel koolhydraten (n = 7), hoog eiwit (n = 7), en een hoog vetgehalte (n = 7) dieet met ad libitum
toegang tot water en de specifiek dieet. Alle diëten werden verkregen van Research Diets (New Brunswick, NJ). De calorie-inhoud van diëten waren: controle (product # D12451): 4,73 kcal /g met 20% energie uit eiwit, 35% energie uit koolhydraten en 45% energie uit vet; koolhydraatrijke (Product # D12450J) was 3,8 kcal /g met 20% energie uit eiwit, 70% energie uit koolhydraten en 10% vet ontleende energie; hoog eiwit (Product # D08091802) was 3,8 kcal /g met 60% energie uit eiwit, 30% energie uit koolhydraten en 10% vet ontleende energie en een hoog vetgehalte (Product # D12492) was 5,2 kcal /g met 20% energie uit eiwit, 20% energie uit koolhydraten en 60% vet ontleende energie. Alle muizen werden gevoed met het controle dieet gedurende één week voor het begin van hun specifieke diëten. Voedselinname, lichaamsgewicht en bloedglucoseaflezingen onderbrengen 4 uur vasten werden eenmaal per week gemeten gedurende 17 weken

Voor de acute toediening van voedingsstoffen, leeftijd en gewicht aangepast (5 weken oud, gemiddeld lichaamsgewicht.: 20 g) mannelijke C57BL /6 muizen (Charles River Laboratories, St. Constant, QU, Canada) werden individueel gehuisvest 1 week en 2 dagen in een 12 uur licht: 12 uur donker cyclus (lichten uit om 19:00 en om 07:00 ), temperatuur en vochtigheid terrarium. Muizen werden geacclimatiseerd gedurende 1 week bij aankomst en hadden ad libitum toegang tot water en normale muis chow voor 11 dagen. Aangezien we het uitvoeren van een acute dieet studie, moesten we de dieren om te acclimatiseren aan de orale sondevoeding procedure. Geacclimatiseerd wij de muizen in deze procedure te gavaging met leidingwater gedurende 2 dagen voor de experimentele dag. Op het 12 ^{e dag werden de muizen 4 uur gevast en werden gavaged met een specifiek vloeibaar dieet. De muizen werden verdeeld in 4 groepen: Eiwitrijk (Isopure Protein Drink, Zero Carb - Mango perziksmaakstof; Nature's Best, Clifton Park, New York; n = 7), High vet (Splendido; koudgeperste Extra Vergine olijfolie; President's Choice , Canada; n = 7), High koolhydraten (D-Glucose, BioShop; Catlogue # GLU501.500; n = 7), en water (kraanwater; n = 7). Op de dag van de studie, 200 microliter van de bovenstaande voedingsmiddelen /water werd toegediend aan de muizen door orale gavage. Bloedglucosewaarden werd genomen bij 0, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90 en 120 minuten, en bloed werd verzameld op 15, 30, 60 en 120 minuten ELISA analyse om te bepalen circulerende niveaus van NUCB2 /nesfatin -1. Weefsels (maag, dunne darm [duodenum], dikke darm en lever) werden verzameld van elke muis na afloop van het onderzoek (diepe isofluraan euthanasie gevolgd door cervicale dislocatie). Om consistentie te behouden, het tijdstip en de duur van elk experiment, operaties en sample collectie werden constant voor alle studies gehouden.}

Total RNA-extractie en cDNA Synthesis

De cellen of weefsels werden verzameld van elke studie te vergelijken NUCB2 mRNA expressie. Van de muizen die de chronische voeding onderzoek weefsels (maag, dunne darm, dikke darm en lever) werden onmiddellijk geoogst na euthanasie ondergaan. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit de MGN3-1 cellen en weefsels met behulp van de RNA-isolatie TRIzol reagens (Invitrogen). RNA zuiverheid werd bevestigd met optische dichtheid (OD) absorptieverhouding (OD 260 nm /OD 280 nm) met een NanoDrop 2000c (Thermo, Vantaa, Finland). Alleen monsters met een absorptie verhouding groter is dan 1,8 werden gebruikt voor cDNA synthese. Synthese van cDNA werd uitgevoerd met behulp iScript cDNA-synthese kit volgens de instructies van de fabrikant (BioRad, Canada).

RT-PCR en kwantitatieve Real Time-PCR

RT-PCR en qRT-PCR voor NUCB2 ghreline en RT-PCR voor PC 1/3 en PC 2 werden uitgevoerd zoals in aangegeven in Tabel 1 omstandigheden, met de CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). Voor qRT-PCR analyse van mRNA expressie van NUCB2 werd genormaliseerd met behulp van beta-actine als huishoudgen. PCR producten NUCB2 in de maag, lever en dikke darm en deze genen (NUCB2, ghreline, PC PC 1/3 en 2) in de MGN3-1 cellen werden geëlektroforeerd in 1% agarose gel om transcripten geamplificeerd verifiëren. Op basis van eerdere studies [4], gebruikten we beta-actine als een interne controle om het signaal van NUCB2 mRNA normaliseren. Bij gebruik van totaal RNA waarbij mRNA kwantificering zeer nauwkeurig, de kritische drempelwaarden voor beta-actine vertoonden geen variatie. Relatieve NUCB2 mRNA expressie werd genormaliseerd met beta-actine uit hetzelfde monster volgens de Livak methode [31].

immunocytochemie Microscopie

MGN3-1 cellen werden gekweekt in een kamer LabTek geleidingssysteem (Nalge Nunc International, Rochester, NY) en liet men groeien tot bijna confluentie. Cellen werden gewassen met 1X fosfaatbufferoplossing (PBS, 2 x 5 minuten, 25 ° C) en gefixeerd in een 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing in 1X PBS gedurende 10 minuten bij 25 ° C, gevolgd door nog een was met 1X PBS ( 3 x 5 minuten, 25 ° C). De gefixeerde cellen werden gepermeabiliseerd in een oplossing van 0,3% Triton-X (Bioshop, Burlington, Ontario, Canada) in 1X PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Glaasjes werden geïncubeerd in blokkerende buffer die 10% geit serum in 1X PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. De cellen werden vervolgens geïncubeerd in primair antilichaam (tabel 2) bij 4 ° C overnacht. Objectglaasjes werden gewassen met PBS (3 x 5 min, 25 ° C) en geïncubeerd met secundair antilichaam (Tabel 2, de PC1 /3-antilichaam was een gulle gift van Dr. Iris Lindberg, Universiteit van Maryland School of Medicine) gedurende 4 uur bij kamertemperatuur. Tenslotte werden objectglaasjes gewassen met PBS (3 x 5 min, 25 ° C) en aangebracht met Vectashield montage medium met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Vector Laboratories, Burlington, Ontario, Canada).

De cellen werden bekeken met behulp van een Nikon Eclipse-Ti omgekeerde fluorescentiemicroscoop (Nikon, Mississauga, Ontario, Canada) en de beelden werden opgenomen met een Nikon DS-Qi1 MC camera (Nikon). Beelden werden geanalyseerd met behulp van NIS-Elementen basisonderzoek software (Nikon) op een Dell HP Workstation. De getoonde afbeeldingen zijn representatief cellen gekleurd voor ghreline, NUCB2, PC 1/3 en PC2. Voor hoge resolutie beeldvorming werden de cellen bekeken, geanalyseerd en afbeeldingen opgenomen met een Leica TCS SP5 confocale microscoop.

Western blotanalyse, immunohistochemie en fluorescentiemicroscopie

Ter controle van de aanwezigheid van nucleobindin-2 (NUCB2) in de darm en lever, drie, 3 maanden oud C57BL /6 mannelijke muizen werden gebruikt. In het kort werden lever en dunne en dikke darm verzameld en gescheiden voor Western-analyse en immunohistochemie. Doekjes voor Western Blot gehomogeniseerd in T-PER weefsel eiwit-extractie reagens (Thermo Scientific,̑10), gevolgd eiwitconcentratie bepaling door Bradford assay. De monsters werden bereid in 1 x Laemmli buffer die 0,2% 2-mercaptoethanol (Bio-Rad,¡-0737 en -0710) en vervolgens werden gekookt bij 95 ° C gedurende 5 min gevolgd door vortexen. De gehele monstervolume (20 ui) die elk 50 ug eiwit of synthetisch rat nesfatin-1 (ABGENT, 1 ug /ul, eerder in 4, 29) werd geladen op een gel en uitgevoerd in een Mini-PROTEAN TGX 8-16 % gradiënt gel (Bio-Rad,Lj-1104). Na scheiding werden de eiwitten overgebracht naar een 0,2 urn BioTrace nitrocellulosemembraan (PALL Life Sciences,.377-000) en vervolgens werd het membraan geblokkeerd in 1X RapidBlock oplossing (Amresco, # M325). NUCB2 eiwit detectie werd uitgevoerd onder toepassing van konijnen anti-nesfatin-1 (Catalogusnummer H-003-22, 1:500 verdunning; Phoenix Pharmaceuticals, California) en GAPDH-eiwit werd gedetecteerd met behulp van konijnen antiserum gericht tegen muizen GAPDH (AbDSerotec, # AHP1628 ) verdund 1:1000. Als tweede antilichaam, geit-anti-konijn IgG (H + L) HRP conjugaat (Bio-Rad,ª-6515) verdund 1:3000 gebruikt. Voor eiwit visualisatie werd het membraan gedurende 5 min in helderheid ECL Western substraat (Bio-Rad,ª-5061) en afgebeeld met behulp ChemiDoc MP beeldsysteem (Bio-Rad,ª-8280) met chemiluminescentiedetectie. Membraan strippen tussen eiwit detectie werd uitgevoerd met behulp van Restore PLUS western blot strippen buffer (Thermo Scientific,ǐ30). Nauwkeurigheid plus eiwit dual xtra standaarden (Bio-Rad,¡-0377) werden als molecuulgewichtmerkers.

Voor immunohistochemische studies, de verzamelde werden in 4% formaldehyde gefixeerd gedurende 24 uur bij 4 ° C weefsels. Fixatief werd vervangen door ethanol (70% ethanol drie), elk gevolgd door een 10 minuten incubatie bij 4 ° C. Weefsels werden vervolgens opgeslagen in 70% ethanol bij 4 ° C en werden verwerkt en coupes op de Prairie Diagnostic Services Inc. (PDS Inc., West-College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan). Paraffine secties van 4 urn dikte werden voor immunokleuring. Deze secties werden van paraffine ontdaan door xyleen (tweemaal geïncubeerd in 100% xyleen, 5 minuten, 25 ° C) en gerehydrateerd in een ethanolreeks (tweemaal geïncubeerd in 100% ethanol en eenmaal per 95% ethanol, 70% ethanol, 50% ethanol, 2 minuten elk, 25 ° C). De coupes werden vervolgens geïncubeerd met 3% waterstofperoxide in gedestilleerd water om endogene peroxidase activiteit (30 minuten bij kamertemperatuur) blokkeren. De coupes werden vervolgens geblokkeerd met serum-vrij proteïne block reagens (DAKO Corporation, Californië) gedurende 10 minuten voordat geïncubeerd met primaire antilichamen. Deze secties werden vervolgens geïncubeerd met konijn anti-nesfatin-1 (Catalogusnummer H-003-22, 1:500 verdunning; Phoenix Pharmaceuticals, Californië) gedurende 24 uur bij kamertemperatuur geroerd. Alle objectglaasjes werden vervolgens drie keer gewassen met 1x PBS en geïncubeerd met geit anti-konijn IgG Texas Red (Red-Nesfatin-1; Catalogusnummer TI-1000, 1:100 verdunning; Vector Laboratories, California) secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur temperatuur. Alle primaire en secundaire antilichamen werden verdund in antilichaam verdunreagens (DakoCytomation, Mississauga, Ontario). De objectglaasjes werden driemaal met 1x PBS en zeven maal met gedestilleerd water gewassen. Tenslotte werden de glaasjes aangebracht met Vectashield middel dat nucleaire kleurstof DAPI bevatten (blauw, Vector Laboratories, Burlingame, Californië). Secties werden bekeken onder een Nikon Eclipse Ti-E omgekeerde fluorescentiemicroscoop (Nikon Canada, Mississauga, Canada). Beelden werden vastgelegd met behulp van een Nikon DS-Qi1 MC gekoelde monochrome camera is aangesloten op een Dell HP Workstation computer en NIS elementen fundamenteel onderzoek imaging software (Nikon Canada, Mississauga, Canada). Enige vertegenwoordiger beelden van de dunne en dikke darm kleuring voor NUCB2 /nesfatin-1 met DAPI worden getoond in de sectie resultaten.

Nesfatin-1 /NUCB2 Levels in serum en Media

Om voedingsstoffen afhankelijk te onderzoeken veranderingen in NUCB2 /nesfatin-1-uitscheiding van MGN3-1 cellen, werd de media verzameld na bepaalde incubatietijd. Teneinde celafval te voorkomen, werden monsters gecentrifugeerd (13.000 rpm gedurende 10 minuten bij 4 ° C) en boven 700 pi werd bewaard bij -20 ° C tot nesfatin-1 meting. Voor het meten van circulerende NUCB2 /nesfatin-1, werd bloed verzameld op 7 a.m (kort na de lichte fase begint), 13:00 (in het midden van de lichte fase) en 7 p.m (vóór de aanvang van de donkere fase). Bloedmonsters werden stollen op ijs, en serum werd afgescheiden door centrifugeren (7000 rpm gedurende 9 minuten bij 4 ° C) en opgeslagen bij -20 ° C, totdat assays werden uitgevoerd. NUCB2 /Nesfatin-1 secretie niveaus in de media werd gemeten met de Nesfatin-1 (1-82) (Rat) ELISA kit (Catalogusnr EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., Californië). De grens van gevoeligheid van de test was 1,2 ng /ml voor nesfatin-1, met detecteerbare bereik 0,1-1000 ng /mL. De hoeveelheid immuunreactief materiaal werd bepaald met een niet-lineaire regressie kromme-fit, die werd gebruikt om te kwantificeren en vergelijk de concentratie van NUCB2 /nesfatin-1 secretie in het serum en mediavoorbeelden.

NUCB2 /Nesfatin- 1 niveaus in serum en media en Total ghreline niveaus in de media

Om voedingsstof afhankelijke veranderingen in NUCB2 /nesfatin-1 en de totale ghrelinesecretie onderzoeken van MGN3-1 cellen, werd de media verzameld na bepaalde incubatietijd. Teneinde celafval te voorkomen, werden monsters gecentrifugeerd (13.000 rpm gedurende 10 minuten bij 4 ° C) en boven 700 pi werd bewaard bij -20 ° C tot NUCB2 /Nesfatin-1 en totaal ghreline meting. Bloedmonsters werden stollen op ijs, en serum werd afgescheiden door centrifugeren (7000 rpm gedurende 9 minuten bij 4 ° C) en opgeslagen bij -20 ° C, totdat assays werden uitgevoerd. NUCB2 /Nesfatin-1 secretie niveaus in serum en medium werd gemeten met de Nesfatin-1 (1-82) (Rat) ELISA kit (Catalogusnr EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., Californië). De grens van gevoeligheid van de test was 1,2 ng /ml voor nesfatin-1, met detecteerbare bereik 0,1-1000 ng /mL. Ook de totale ghrelinesecretie niveaus in de media werd gemeten met de Ghreline (rat, muis) EIA kit (Catalogusnr EK-031-31, Phoenix Pharmaceuticals Inc, California). De grens van gevoeligheid van de test was 1,16 ng /ml voor volledige ghreline, met detecteerbare bereik van 0-100 ng /ml. De hoeveelheid immuunreactief materiaal werd bepaald met een niet-lineaire regressie kromme-fit, die werd gebruikt om te kwantificeren en vergelijk de concentratie van NUCB2 /nesfatin-1 secretie in het serum en mediavoorbeelden.

Statistische analyse

Analyses van de gekwantificeerde qRT-PCR en ELISA-gegevens werden uitgevoerd met behulp van One-Way ANOVA gevolgd door meerdere vergelijkingstest Tukey's. GraphPad Prism versie 5 (GraphPad Software Incorporated, San Diego, CA, USA) werd gebruikt voor statistische analyse en grafieken. Significantie werd toegekend wanneer p < 0,05. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM.

Resultaten

NUCB2, PC 1/3 en PC 2 mRNA expressie in cellen en MGN3-1 NUCB2 mRNA tot expressie wordt gebracht in de maag, lever, dunne darm en dikke darm van de mannelijke muizen

We identificeerden uitdrukking van NUCB2 (202 bp), prohormoon convertase 1/3 (400 bp), en prohormoon convertase 2 (406 bp) mRNA in MGN3-1 cellen (Fig. 1A). NUCB2 (202 bp) mRNA expressie werd ook gedetecteerd in de maag, lever, dunne darm en dikke darm van mannelijke C57 /BL6 muizen (fig. 1B). Het absoluut NUCB2 mRNA expressie in de maag hoger dan NUCB2 mRNA expressie in de lever, dunne darm en dikke darm (Fig. 1C).

MGN3-1 cellen immunopositive voor ghreline NUCB2 /Nesfatin-1 , 1/3 en PC PC 2

Fluorescentiemicroscopie weergegeven MGN3-1 cellen gekleurd met anti-nesfatin-1 antilichaam (Texas-rood, fig. 2B) en anti-ghreline-antilichaam (FITC-groen; Fig. 2A) vertoonden duidelijke co-lokalisatie (Geel; fig. 2C) van nesfatin-1 en ghreline immunoreactiviteit. Sommige ghreline positieve cellen niet immuunreactief voor nesfatin-1 (fig. 2C). MGN3-1 cellen vertoonden PC 1/3 immunoreactiviteit (Texas Red; fig. 2D) en PC 2 immunoreactiviteit (Texas Red, figuur 2E.). DAPI (blauw) gekleurd de kern van alle cellen, waaronder cellen die niet positief voor de eiwitten bestudeerd. Controleglaasjes gekleurd met secundair antilichaam alleen (Fig. 2F) had geen immunoreactiviteit. Confocale beeldvorming toonde MGN3-1 cellen gekleurd met anti-nesfatin-1 antilichaam (Texas-rood, figuur 3A.) En anti-ghreline-antilichaam (FITC-groen; fig. 3B) toonde duidelijke co-lokalisatie (Geel, fig. 3C) van nesfatin-1 en ghreline immunoreactiviteit. Negatieve controle is gekleurd met alleen secundaire antilichamen alleen (fig. 3D).

NUCB2 eiwitexpressie in dikke darm, dunne darm en lever van mannelijke muizen

NUCB2 eiwit tot expressie in de dikke darm, dunne darm en lever van mannelijke muizen tonen duidelijke band voor NUCB2 overeenkomend met ongeveer 50 KDa. Nesfatin rat-1 peptide gebruikt als een positieve controle getoond als een afzonderlijke band die overeenkomt met ongeveer 10 kDa (figuur 4A;. Linker afbeelding). Echter geen banden met de volledig verwerkte nesfatin-1 waren zichtbaar bij 10 kDa in de weefselmonsters (figuur 4A;. Linker afbeelding). We vonden ook banden van ongeveer 47 kDa onder de 50 kDa band in de dunne darm en de lever, maar niet in de dikke darm (Figuur 4A;. Linker afbeelding). Een afzonderlijke band van GAPDH die als controle huishouding gen wordt waargenomen bij 37 kDa getoond in alle weefsels (figuur 4A;. Rechterbeeld). NUCB2 /nesfatin-1 immunoreactiviteit wordt gevonden in de mucosale cellen van de dunne darm (Figuur 4B;. Left image) en de dikke darm (Figuur 4B;. Rechterbeeld).

Effecten van glucose en L-tryptofaan op NUCB2 mRNA expressie in en NUCB2 /nesfatin 1-uitscheiding van MGN3-1 cellen

cellen geïncubeerd in 100 mM glucose DMEM een hogere NUCB2 mRNA expressie dan cellen geïncubeerd bij 5,6, 25 en 50 mM glucose DMEM concentraties op 1 uur na incubatie (Fig. 5A). Op 2 uur na incubatie cellen geïncubeerd in 100 mM DMEM waren significant hoger bij NUCB2 mRNA expressie dan cellen geïncubeerd in 5,6 en 50 mM glucose DMEM (fig. 5C). Op 1 uur (Fig. 5B) en 2 uur (Fig. 5D), waren er geen significante verschillen in NUCB2 /nesfatin-1 secretie. NUCB2 mRNA expressie was significant hoger in cellen geïncubeerd bij 10 mM L-tryptofaan (fig. 5E) in vergelijking met cellen geïncubeerd bij 0,07 en 1,0 mM L-tryptofaan. NUCB2 /nesfatin-1 uitscheiding uit cellen geïncubeerd bij 1,0 en 10,0 mM L-tryptofaan aanzienlijk hoger dan cellen geïncubeerd in 0,7 mM L-tryptofaan (fig. 5F).

Effect linoleenzuur, octaanzuur en oliezuur zuur op NUCB2 mRNA expressie in en NUCB2 /nesfatin-1 uitscheiding van MGN3-1 cellen

We hebben NUCB2 mRNA expressie significant verminderd in cellen behandeld met 1, 10 en 100 pM oliezuur (fig. 6E) in vergelijking met de controle. Geen wijzigingen in NUCB2 mRNA waargenomen in cellen behandeld met linoleenzuur (fig. 6A) en octaanzuur (fig. 6C). Verder NUCB2 /nesfatin-1 uitscheiding was onveranderd in cellen behandeld met verschillende doses linoleenzuur (fig. 6B), octaanzuur (fig. 6D) en oliezuur (fig. 6F).

Effect L-tryptofaan, linoleenzuur, octaanzuur en oliezuur zelfstandig op ghreline mRNA expressie en secretie van ghreline totale MGN3-1 cellen

Geen veranderingen in ghreline mRNA (S1A figuur) en totale ghrelinesecretie (Figuur S1B ) werden waargenomen wanneer de cellen werden behandeld met verschillende doses van glucose na 1 uur incubatie. Ghreline mRNA expressie was significant hoger in cellen geïncubeerd in 1 mM L-tryptofaan (fig. 7A) in vergelijking met cellen geïncubeerd bij 0,07 en 10 mM L-tryptofaan. Geen significant verschil in de totale ghreline secretie uit cellen behandeld met verschillende doseringen van L-tryptofaan (fig. 7B). We vonden geen verandering in ghreline mRNA expressie (Fig. 7C), maar de totale ghrelinesecretie was hoog uit cellen geïncubeerd bij 100 pM linoleenzuur (fig. 7D) in vergelijking met controle, 1 en 10 uM doses. Geen veranderingen in ghreline mRNA (fig. 7E) en totale ghrelinesecretie (fig. 7F) werden waargenomen wanneer de cellen werden behandeld met verschillende doseringen van octaanzuur. Ondertussen ghreline mRNA (fig. 7H), en de totale ghrelinesecretie (fig. 7I) waren significant hoger in cellen behandeld met 100 uM oliezuur, vergeleken met de controle, 1 en 10 uM oliezuur.

Chronic effecten van nutriënten op NUCB2 mRNA expressie en serum NUCB2 /nesfatin-1 bij muizen

Het lichaamsgewicht, voedselinname en bloedglucose profiel van muizen gevoed op verschillende diëten zijn weergegeven in figuur S2. Muizen gevoed op een hoog vet dieet significant lage expressie van NUCB2 mRNA in de maag ten opzichte van die toegevoerd aan een controle, hoog eiwit of hoge koolhydraat diëten (Fig. 8A). Er was geen significant verschil in de expressie van mRNA NUCB2 in de dunne darm tussen muizen die een controle, hoog eiwit, hoog koolhydraat of vetrijke diëten (Fig. 8B). Muizen gevoed op de eiwitrijke en vetrijke diëten relatief lage expressie van mRNA NUCB2 in de dikke darm dan muizen gevoed met controle of hoge koolhydraat diëten (Fig. 8C). Muizen gevoed op een eiwitrijk dieet een significant lage expressie van NUCB2 mRNA in de lever dan muizen die anderzijds diëten (Fig. 8D). Bij 7 a.m, waren er geen verschillen in serum nesfatin-1 /NUCB2 niveaus in muizen die verschillende diëten (Fig. 9A). Op 1 p.m, de hoge koolhydraten dieet gevoed muizen hadden significant hogere serum nesfatin-1 /NUCB2 in omloop (Fig. 9B). Serum nesfatin-1 /NUCB2 was significant lager bij muizen gevoed veel koolhydraten, hoog eiwit en hoog vet, in vergelijking met dieet gevoed controlemuizen om 7:00 (Fig. 9C).

Acute effecten van nutriënten op NUCB2 mRNA bloedglucose en serum NUCB2 /nesfatin-1 bij muizen

Er werden geen significante veranderingen in de expressie van mRNA NUCB2 in de maag (fig. 10A), dunne darm (Fig. 10B), dikke darm (Fig . 10C) en de lever (figuur 10D.) tussen muizen gevoed op een hoog eiwit, veel koolhydraten, veel vet of water.

• PLoS ONE: Wat voor soort capsule endoscoop is geschikt voor een Controleerbaar zelfrijdende Capsule endoscoop? Experimentele studie Met behulp van een Varkens Maag Model for Clinical Application (met …
• PLoS ONE: Maag Temperatuur Records Reveal Nursing Gedrag en Overgang naar Solid Verbruik Eten in een niet-gespeende Zoogdier, de Harbour Seal Pup (Phoca vitulina)