PLoS ONE: Ravinteet Differentially Regulate Nucleobindin-2 /Nesfatin-1 in vitro viljellyissä Maha Ghrelinoma (MGN3-1) Solut ja In vivo uroshiirillä

tiivistelmä

Nesfatin-1 erittyy, ateria-reagoiva anoreksigeeninen peptidi koodattu esiaste nucleobindin-2 [NUCB2]. Kiertävä nesfatin-1 lisääntyy aterian jälkeen, mutta ravinnon komponentteja, jotka moduloivat NUCB2 /nesfatin-1 ei vielä tunneta. Oletimme, että hiilihydraattien, rasvan ja proteiinin erilaisesti säätelevät kudoksen erityinen ilmaisu nesfatin-1. NUCB2, prohormone-kon- ja nesfatin-1 havaittiin hiiren vatsassa ghrelinoma [MGN3-1] soluja. NUCB2 mRNA ja proteiini havaittiin myös hiiren maksassa, ja pienten ja suurten suolet. MGN3-1 soluja käsiteltiin glukoosin, rasvahappojen tai aminohappoja. C57BL /6-hiiriä kroonisesti ruokittu runsaasti rasvaa, korkea hiilihydraatteja ja runsaasti proteiinia sisältäviä ruokia 17 viikon ajan. Kvantitatiivinen PCR ja nesfatin-1 määrityksiä käytettiin määrittämään nesfatin-1-mRNA: n ja proteiinin tasot. Glukoosi stimuloi NUCB2 mRNA: n ekspression MGN3-1 soluissa. L-tryptofaani lisääntynyt NUCB2 mRNA: n ilmentymisen ja greliini mRNA ilmaisun, ja nesfatin-1 eritystä. Öljyhappo esti NUCB2 mRNA ilmaisu, kun taas greliini mRNA ilmaisun ja eritys oli parannettu. NUCB2 mRNA ilmentyminen oli merkitsevästi pienempi maksassa hiirten ruokitaan proteiinipitoista ravintoa verrattuna hiiriin ruokittu muille ruokavalioita. Krooninen saanti runsasrasvainen ruokavalio aiheutti merkittävä väheneminen NUCB2 mRNA mahalaukussa, kun taas korkea proteiinia ja runsaasti rasvaa ruokavalioon aiheutti samanlaisia ​​tukahduttaminen NUCB2 mRNA paksusuolessa. Mitään eroja seerumin nesfatin-1-tasot havaittiin hiirillä 7 a.m, alkaessa kevyen faasin. Korkea hiilihydraatti ruokavalio syötetään hiiret osoittivat merkittävästi kohonnut nesfatin-1 tasot kolmetoista Seerumin nesfatin-1 oli merkitsevästi pienempi hiirillä ruokittu runsaasti rasvaa, proteiinia tai hiilihydraattia verrattuna kontrolleihin 7 p.m, juuri ennen pimeän ajan. Hiirillä, jotka saivat bolusinjektiona rasvaisten oli merkittävästi kohonnut nesfatin-1 /NUCB2 kaikkina ajankohtina testattu post-letkulla, verrattuna kontrollihiiriin ja hiirille syötettiin muita ruokavalioita. Tuloksemme ensimmäistä kertaa osoittaa, että nesfatin-1 moduloidaan ravinteita.

Citation: Mohan H, Ramesh N Mortazavi S, Le A Iwakura H, Unniappan S (2014) Ravinteet Differentially säädellä Nucleobindin-2 /Nesfatin-1 in vitro
viljellyissä Maha Ghrelinoma (MGN3-1) Solut ja in vivo
uroshiirillä. PLoS ONE 9 (12): e115102. doi: 10,1371 /journal.pone.0115102

Editor: Yvette Tache, University of California, Los Angeles, Yhdysvallat

vastaanotettu: May 1, 2014; Hyväksytty: 18 marraskuu 2014; Julkaistu 15 joulukuuta 2014

Copyright: © 2014 Mohan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä rahoittajaorganisaatio avoin toiminta-avustusta Kanadan Insitutes of Health Research (CIHR; http: //www.cihr-irsc. gc.ca/e/193.html) ja perustaminen Avustusta Saskatchewanin Health Research Foundation (http://shrf.ca/). SU on CIHR New tutkija. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Rahoittajia ei ole roolia tutkimus- tai käsikirjoitus valmisteilla.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Nesfatin-1 [NEFA /NUCB2 -koodattua kylläisyyden ja rasva-vaikuttaminen proteiini-1] on voimakas anoreksigeeninen peptidi osallinen sääntelyn energiatasapainon ja glukoosihomeostaasiin [1], [30]. Se on 82 aminohapon peptidi on johdettu prekursoriproteiinin, nucleobindin-2 (NUCB2) [1]. NUCB2 koostuu 396 aminohaposta, joka koostuu kahdesta EF käden motiivia ja DNA: ta sitovan domeenin [1], [3]. Translaation jälkeinen käsittely prohormoni-kon- (PC 1/3 ja PC 2) aiheuttaa NUCB2 voidaan lohkaista kolme peptidiä, nesfatin-1 (1-82 aminohappoa), nesfatin-2 (85-163 aminohappoa), ja nesfatin- 3 (166-396 aminohappoa). NUCB2 /nesfatin-1 aminohapposekvenssi on erittäin konservoitunut eri puolilla selkärankaisten [6], [7], [31]. NUCB2 /nesfatin-1 on löydetty eri hypotalamuksen ytimet, jotka ovat mukana energia-aineenvaihduntaan, kuten kaarevan ydin, paraventrikulaarisista tuma, supraoptic tuma, sivusuunnassa hypotalamuksen ulkopuolelle ja zona increta [8], [9]. Insuliinia tuottavien beetasolujen co-express nesfatin-1 haiman saarekkeiden rottien ja hiirien [2], [4], [11], mikä viittaa siihen, että nesfatin-1 voisi olla tärkeä rooli insuliinin eritystä ja glukoosihomeostaasiin [4], [29]. Greliini ja NUCB /nesfatin-1 colocalized mahalaukun oxyntic limakalvon rauhaset jyrsijöillä [13] ja ihmisissä [16]. NUCB2 mRNA: n ekspression puhdistettua mahalaukun limakalvon endokriinisten solujen havaittiin olevan suurempi kuin rottien aivoissa [13]. Täyspitkä NUCB2 proteiini havaittiin pienten ja suurten suolet ja maksa urosrottien, ja ICR [5]. Leveä jakauma NUCB2 /nesfatin-1 Keski- ja perifeerisissä kudoksissa viittaa rooli nesfatin-1 aineenvaihdunnan säätelyyn.

Annostusta nesfatin-1 aiheutti laajennettu laski ruoan saannin ja kehon paino [1] . Intraserebroventrikulaarinen antaminen NUCB2 estää ruoan saanti, kehon painon ja ihonalaisen, suoliliepeen ja lisäkiveksen rasvamassaa aikuisilla rotilla annoksesta riippuvaisella tavalla. Lisäksi, NUCB2 pudotus rotilla infusoimalla antisense morfolino oligonukleotidi (as-MON) aiheutti ruokahalun lisääntyminen ja painon [1]. Sisäiset paraventrikulaarinen ydin injektion nesfatin-1 vähentää kumulatiivinen ravinnonotto 1 ja 3 tuntia [9]. Vatsaontelonsisäisiä nesfatin-1 vähensi ruoan saanti leptiini kestävä db /db
hiirien ja rasvaisen ruokavalion syötettiin hiirille [8]. Nesfatin-1 koostuu 3 rakenteellisia fragmentteja ja vasta puolivälissä (tähteet 24-53, M30) ja nesfatin-1 on mukana tuottamassa ruokahalua hillitseviä vastausten [15], [28]. Yhdessä nämä tulokset osoittavat selvästi, että tukea kylläisyyden vaikutukset nesfatin-1.

Nesfatin-1 on aterian reagoiva glucoregulatory hormoni [12], [13], ja haiman saarekkeiden rottien vapauttaa NUCB2 vastauksena glukoosi [14]. Ihmisillä tehdyissä tutkimuksissa, glukoosi hoitoa saaneista oli korkeampi pohjapinta nesfatin-1 tasot verrattuna verrokkeihin [10]. Vuonna MIN6 soluja, 4-kertainen nousu nesfatin-1-tasot havaittiin, kun soluja inkuboitiin korkean glukoosin (16,7 mM) verrattuna alhaisen glukoosin (2,0 mM) [4]. Nesfatin-1 tehostaa glukoosin stimuloimaa insuliinin eritystä viljellyissä MIN6 soluja, jotka inkuboitiin runsaasti glukoosia kuin matalan glukoosin annoksesta riippuvaisella tavalla [4]. Haimassa streptotsosiinia (STZ): itä hiirten tyypin 1 diabetes, todettiin, että sekä NUCB2 ja preproinsuliini mRNA ilmaisun olivat merkittävästi alhaisemmat [4]. Sen sijaan parannettu nesfatin-1 kolokalisaation insuliinin löydettiin saarekesolujen beetasolujen rasvaisen ruokavalion aiheuttama lihavilla hiirillä on tyypin 2 diabetes. Nesfatin-1 on kudosspesifisiä vaikutuksia glukoosin ottoon rotan adiposyyttien ja lihasten [30]. Kaiken nesfatin-1 kykenee tärkeä rooli säätelyssä koko kehon glukoosin ja energian homeostaasiin.

Vaikka nesfatin-1 on nousemassa tärkeä ateria reagoiva peptidi [1], [12], [13], [30] , mitä laukaisee sen eritystä jää epäselväksi. Mikä ruokavalio komponenttien laukaista aterian jälkeinen eritystä nesfatin-1? Tämä kysymys on edelleen osoitteeton. Pääpaino Tämän tutkimuksen tarkoituksena on selvittää, miten eri ravintoaineiden voi moduloida NUCB2 /nesfatin-1 in vitro
viljellyissä vatsassa ghrelinoma (MGN3-1) soluja hiiriltä ja in vivo
uros- hiirillä. Tuloksemme meidän in vitro
tutkimukset osoittavat, että MGN3-1 solut reagoivat eri ravintoaineiden erittävät NUCB2 /nesfatin-1 ja greliini. Vastaavasti akuutti tai krooninen ravintoaineiden saanti tekee vaikutuksen NUCB2 mRNA ilmaisun ja NUCB2 /nesfatin-1 vapautumista ruokavalio erityisellä tavalla.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki tutkimukset, joissa käytetään eläimiä noudattanut Kanadan neuvoston Animal Care suuntaviivoja, ja hyväksyi Animal tutkimuseettiseltä yliopiston Saskatchewanin (Protocol Number 2012-0033).

In vitro
Studies

Mouse mahan ghrelinoma (MGN3-1) soluihin [17] viljeltiin DMEM (Invitrogen, Ontario, Canada, Cataloguew95-040), joka oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen, Catalogue|84 ) ja 1% penisilliiniä (100 U /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml) (Invitrogen, Catalogue—40-122) 37 ° C: ssa 10% CO _{2. 80% konfluenssiin, MGN3-1 solut ympättiin 6 x 10 ^{6 solua /kuoppa 12-kuoppalevylle ja tutkimukset suoritettiin kun solut olivat 80-90% konfluentteja. Kukin tutkimus toistettiin kolmesti ja tietoja kolmesta tutkimuksesta yhdistettiin saamiseksi n = 9-12 kuoppiin /hoitoa. Sen määrittämiseksi, onko glukoosi oli vaikutusta annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla, soluja inkuboitiin 1 tunnin ajan ja 2 tunnin ajan 5,6, 25, 50, ja 100 mM glukoosia DMEM. Täydellinen kasvualustassa MGN3-1 solujen mukaan on kasvanut nopeasti glukoosin taso, joka on 25 mM. Suhteessa tutkimuksista, joissa rasvahappoja ja aminohappoja, teimme nämä tutkimukset käyttäen DMEM alhaisilla glukoositasot (5,6 mM), koska käyttämällä korkean glukoosin väliaineen (25 mM) voi peittää vaikutusta kunkin ravintoaineiden NUCB2 /nesfatin -1 eritystä ja synteesi. Suhteen pitkäketjuisia rasvahappoja, testasimme vaikutus kolmen eri rasvahappojen käyttäen linoleenihappo (Sigma-Aldrich, Ontario, Canada, Product # L2376), oktaanihappo (Sigma-Aldrich; tuote # C2875) ja öljyhappoa (Sigma -Aldrich; tuote # O1383). Soluja inkuboitiin 4 tunnin ajan kunkin rasvahappojen 0, 1, 10, 100 uM. Käytimme L-tryptofaani (Sigma-Aldrich; tuote # T8941) vaikutuksen testaamiseksi aminohapon on NUCB2 eritystä ja synteesi. Soluja inkuboitiin 4 tunnin ajan L-tryptofaanin 0,7, 1, 10 mM. L-tryptofaani on läsnä vertailualustassa (5,6 mM glukoosia DMEM) vähintään annoksella 0,7 mM, joka on välttämätön niiden kasvulle kunnossa.}}

In vivo
Studies

krooninen ruokintaan ruokavalion, jotka sisältävät vaihtelevia määriä tiettyjä ravintoaineita, ikä ja paino-täsmäsi (5 viikkoa vanhoja, keskimääräinen paino: 20 g) C57BL /6-hiiriä (Charles River Laboratories, Quebec, Kanada) pidettiin yksittäin 17 viikkoa on 12 tuntia valoa: 12 tuntia pimeää sykli (valot pois yhdeksäntoista ja 7 AM), lämpötila ja kosteus ohjataan vivariums. Hiiret jaettiin neljään ryhmään ruokittu ohjaus (n = 6), korkea hiilihydraatti (n = 7), proteiinipitoista (n = 7), ja runsaasti rasvaa (n = 7) ruokavaliota ad libitum
vesi- ja niiden erityiset ruokavalio. Kaikki ruokavaliot hankittiin Research ruokavaliot (New Brunswick, NJ). Kaloripitoisuus ruokavalion olivat: ohjaus (Product # D12451): 4,73 kcal /g 20% ​​energiaa johdettu proteiini, 35% energiaa johdettu hiilihydraatin ja 45% energiaa peräisin rasvasta; korkea hiilihydraatti (Product # D12450J) oli 3,8 kcal /g 20% ​​energiaa johdettu proteiini, 70% energiaa johdettu hiilihydraatin ja 10% energiaa peräisin rasvasta; proteiinipitoista (Product # D08091802) oli 3,8 kcal /g 60% energiaa johdettu proteiini, 30% energiaa johdettu hiilihydraatin ja 10% energiaa peräisin rasvasta, ja runsaasti rasvaa (Product # D12492) oli 5,2 kcal /g 20% energia johdettu proteiini, 20% energiaa johdettu hiilihydraatin ja 60% energiaa peräisin rasvasta. Kaikki hiiret, joille oli syötetty kontrolliruokavaliota yhden viikon ajan ennen aloittamista niiden erityisiä ruokavalioita. Ravinnonotto, kehon paino, ja verensokeriarvo post 4 tuntia nopea mitattiin kerran viikossa 17 viikon ajan.

lyhytaikaisen antamisen ravinteiden, ikä ja paino-haun (5 viikkoa vanhoja, keskimääräinen paino: 20 grammaa) C57BL /6-hiiret (Charles River Laboratories, St. Constant, QU, Kanada) sijoitettiin yksittäin 1 viikon ja 2 päivän ajan 12 tunnin valo: 12 h pimeä sykli (valot pois yhdeksäntoista ja 7 AM ), lämpötila ja kosteus ohjataan vivariums. Hiiriä sopeutunut 1 viikko saapumisen ja oli ad libitum pääsy veden ja säännöllinen hiiri Chow 11 päivää. Koska olemme suorittaa akuuttia ruokavalio tutkimus, tarvitsimme eläimet totuttautua letkulla suun kautta menettelyssä. Me sopeutunut hiiret tähän menettelyyn gavaging ne vesijohtovedellä 2 päivää ennen koepäivänä. On 12 ^{päivänä hiiret pidettiin paastolla 4 tuntia ja tehtiin letkulla tietyn nestemäistä ravintoa. Hiiret jaettiin 4 ryhmään: proteiinipitoista (Isopure Protein Drink, Zero Carb - Mango persikkamakuaineista; Luonnon Best, Clifton Park, New York; n = 7), korkea rasva (Splendido; kylmäpuristettu ekstraneitsytoliiviöljy; presidentin valinta , Kanada; n = 7), High hiilihydraatti (D-glukoosi, BioShop; Catlogue # GLU501.500; n = 7), ja vettä (vesijohtovettä; n = 7). Päivänä tutkimuksen, 200 mikrolitraa edellä ravinteita /vettä annettiin hiirille suun kautta letkuruokinnalla. Verensokerilukemat otettiin 0, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90 ja 120 minuuttia, ja verta kerättiin 15, 30, 60, ja 120 minuuttia ELISA-analyysi määrittää veressä NUCB2 /nesfatin -1. Kudokset (mahalaukun, ohutsuolen [pohjukaissuolen], paksusuoli ja maksa) kerättiin kunkin hiiren päätyttyä tutkimuksen (syvä isofluraani eutanasia seurasi niskanmurrolla). Säilyttää johdonmukaisuus, ajoitus ja kesto kunkin kokeen, leikkauksia ja näytteen kerääminen pidettiin vakiona kaikissa tutkimuksissa.}

Yhteensä RNA Extraction ja cDNA Synthesis

Soluja tai kudoksia kerättiin kunkin tutkimuksen vertailla NUCB2 mRNA ilmaisun. Hiiristä, jotka tehtiin krooninen ruokavalio tutkimuksessa, kudokset (maha, ohutsuoli, paksusuoli ja maksa) otettiin talteen heti eutanasia. Kokonais-RNA uutettiin MGN3-1 soluja ja kudoksia, käyttäen TRIzol RNA: n eristämistä reagenssia (Invitrogen). RNA puhtaus vahvistanut optinen tiheys (OD) imeytyminen suhde (OD 260 nm /OD 280 nm) käyttäen NanoDrop 2000c (Thermo, Vantaa, Suomi). Vain näytteet, joiden imeytyminen on suurempi kuin 1,8 käytettiin cDNA-synteesi. Synteesi cDNA suoritettiin käyttäen iScript cDNA synteesikitti ohjeiden valmistajan (BioRad, Kanada).

RT-PCR ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

RT-PCR ja qRT-PCR NUCB2, greliini, ja RT-PCR PC 1/3 ja PC 2 tehtiin kohti olosuhteet esitetään taulukossa 1, käyttäen CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). Sillä qRT-PCR-analyysi, mRNA ilmentyminen NUCB2 normalisoitiin käyttäen beeta-aktiini kuin taloudenhoito geeni. PCR-tuotteet NUCB2 vatsassa, maksassa ja paksusuolessa, ja nämä geenit (NUCB2, greliini, PC 1/3 ja PC 2) MGN3-1 solut elektroforeesilla 1% agaroosigeelillä sen varmistamiseksi, selostukset monistettiin. Perustuen aiempiin tutkimuksiin [4], käytimme beeta-aktiini sisäisenä kontrollina normalisoida signaalin NUCB2 mRNA. Käytettäessä kokonais-RNA: missä mRNA kvantifiointi oli hyvin tarkka, kriittiset raja-arvot beeta-aktiini ei osoittanut vaihtelua. Suhteellinen NUCB2 mRNA: n ekspressio oli normalisoitunut beeta-aktiini samasta näytteestä mukaisesti Livak menetelmällä [31].

Immunosytokemia ja Mikroskopia

MGN3-1 soluja viljeltiin roksilla Labtek jaosto Slide System (Nalge Nunc International, Rochester, NY) ja annettiin kasvaa lähes konfluenssiin. Solut pestiin 1 x fosfaattipuskuriliuoksella (PBS; 2 x 5 minuuttia, 25 ° C) ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (PFA) liuos 1X PBS: ssä 10 minuutin ajan 25 ° C: ssa, mitä seurasi toinen pesu 1 X PBS: llä ( 3 x 5 minuuttia, 25 ° C). Kiinnitetyt solut läpäiseviksi liuokseen, joka sisälsi 0,3% Triton-X (BioShop, Burlington, Ontario, Canada) 1X PBS: ssä 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Laseja inkuboitiin esto- puskurissa, joka sisälsi 10% vuohen seerumia 1X PBS: ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten soluja inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen (taulukko 2) 4 ° C: ssa yön yli. Objektilasit pestiin PBS: llä (3 x 5 minuuttia, 25 ° C) ja inkuboitiin sekundaarisella vasta-aineella (taulukko 2, vaan PC1 /3-vasta-aine oli antelias lahja tri Iris Lindberg, University of Maryland School of Medicine) 4 tuntia huonelämpötila. Lopuksi levyjä pestiin PBS: llä (3 x 5 minuuttia, 25 ° C) ja asennettu Vectashield asennus väliaineessa, joka sisälsi 4 ', 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) (Vector Laboratories, Burlington, Ontario, Canada).

Soluja tarkasteltiin käyttämällä Nikon Eclipse-Ti käänteinen fluoresenssi mikroskooppi (Nikon, Mississauga, Ontario, Kanada) ja kuvien otettiin käyttäen Nikon DS-Qi1 MC kamera (Nikon). Kuvat analysoitiin käyttäen NIS-elementit perustutkimus ohjelmisto (Nikon) Dell HP Workstation. Kuvissa edustavat soluja värjättiin greliinin, NUCB2, PC 1/3 ja PC2. Korkean resoluution kuvantaminen, solut katsottuna, analysoitiin ja otetut kuvat käyttämällä Leica TCS SP5 -konfokaalimikroskoopilla.

Western Blot analyysi, immunohistokemia ja fluoresenssimikroskopiaa

läsnäolon vahvistamiseksi nucleobindin-2 (NUCB2) suolistossa ja maksassa, kolme, 3 kuukautta vanha C57BL /6 uros hiiriä käytettiin. Lyhyesti, maksa, sekä pienten ja suurten suolet kerättiin, ja erottaa Western-analyysillä tai immunohistokemia. Kudosten Western blot homogenoitiin T-PER kudosproteiini- uuttoreagenssi (Thermo Scientific,̑10) ja sen jälkeen proteiinin pitoisuus määritystä Bradfordin menetelmällä. Näytteet valmistettiin 1 x Laemmli-puskuria, joka sisältää 0,2% 2-merkaptoetanolia (Bio-Rad,¡-0737 ja -0710) ja sen jälkeen keitettiin 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi vorteksointi. Koko näytteen tilavuus (20 ui), joista kukin sisältää 50 ug proteiinia tai synteettistä rotan nesfatin-1 (ABGENT, 1 ug /ul; aiemmin käytetty 4, 29) ladattiin geeliin, ja ajaa Mini-PROTEAN TGX 8-16 % gradienttigeelissä (Bio-Rad,Lj-1104). Erottamisen jälkeen proteiinit siirrettiin 0,2 um BIOTRACE nitroselluloosamembraanille (PALL Life Sciences,đ77-000), ja sitten membraani blokattiin 1X RapidBlock liuokseen (Amresco, # M325). NUCB2 proteiini havaitseminen suoritettiin käyttäen kaniinin anti-nesfatin-1 (Luettelonumero H-003-22, 1:500 laimennus, Phoenix Pharmaceuticals, Kalifornia) ja GAPDH proteiini havaittiin käyttämällä kanin antiseerumilla hiiren GAPDH (AbDSerotec, # AHP1628 ) laimennettuna 1:1000. Kuten sekundääristä vasta-ainetta, vuohen anti-kani-IgG (H + L) HRP-konjugaattia (Bio-Rad,ª-6515) laimennettuna 1:3000 käytettiin. Proteiinin visualisointi kaivoa inkuboitiin 5 min Clarity Länsi ECL alustan (Bio-Rad,ª-5061) ja kuvataan useilla ChemiDoc MP kuvantamisjärjestelmä (Bio-Rad,ª-8280) kanssa kemiluminesenssidetektiolla. Kalvo strippaus välillä proteiinin havaitsemisen suoritettiin käyttäen palautus PLUS western blot strippaus puskuri (Thermo Scientific,ǐ30). Precision plus proteiini dual xtra standardit (Bio-Rad,¡-0377) käytettiin molekyylipainon merkkiaineita.

immunohistokemiallista tutkimuksissa kudosnäytteiden fiksoitiin 4% formaldehydiä 24 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Fiksatiivi korvattiin etanolilla (kolme 70% etanolia), kukin seurasi 10 minuutin inkubointi 4 ° C: ssa. Kudokset säilytettiin sitten 70% etanolia 4 ° C: ssa ja käsiteltiin ja leikattiin preerialla Diagnostic Services Inc. (PDS Inc., Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan). Parafiinisektioista 4 um paksuus valmistettiin immunovärjäämistä. Jaksoissa poistettiin parafiini ksyleenillä (inkuboitu kahdesti 100% ksyleeni; 5 minuuttia, 25 ° C) ja niihin lisätään asteittaisella etanolisarjassa (inkuboitu kahdesti 100% etanolilla, ja kerran kussakin 95% etanolia, 70% etanolia, 50% etanoli, 2 minuuttia kussakin, 25 ° C). Sitten leikkeitä inkuboitiin 3% vetyperoksidia tislatussa vedessä estää endogeenisen peroksidaasin (30 minuuttia huoneenlämpötilassa). Leikkeitä blokattiin sitten seerumittomalla proteiini lohkon reagenssia (DAKO Corporation, Kalifornia) 10 minuuttia ennen kuin inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla. Nämä kohdat inkuboitiin sitten kanin anti-nesfatin-1 (Luettelonumero H-003-22, 1:500 laimennus, Phoenix Pharmaceuticals, Kalifornia) 24 tuntia huoneenlämpötilassa. Kaikki objektilasit pestiin sen jälkeen kolme kertaa 1x PBS: lla ja inkuboitiin vuohen anti-kani-Texas Red-IgG (Red-Nesfatin-1; Luettelonumero TI-1000, 1:100 laimentamista; Vector Laboratories, Kalifornia) sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunti huoneen lämpötila. Kaikissa ensimmäisen ja toisen vasta-aineet laimennettiin vasta-laimentimeen reagenssia (DakoCytomation, Mississauga, Ontario). Levyjä pestiin kolme kertaa 1x PBS: lla ja seitsemän kertaa tislatulla vedellä. Lopuksi objektilasit asennettu Vectashield väliaineen sisältäviä ydinaseiden väriainetta DAPI (Blue, Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornia). Leikkeitä tarkasteltiin Nikonin Eclipse Ti-E käänteinen fluoresenssi mikroskooppi (Nikon Kanada, Mississauga, Kanada). Kuvat otettiin käyttäen Nikon DS-QI1 MC jäähdytetty yksivärinen kamera kytketään Dell HP Workstation tietokone ja NIS elementtejä perustutkimuksen kuvankäsittelyohjelma (Nikon Kanada, Mississauga, Kanada). Vain edustavat kuvat pienten ja paksusuoli värjäytyminen NUCB2 /nesfatin-1 DAPI näkyvät tuloksissa osiossa.

Nesfatin-1 /NUCB2 seerumissa ja Media

tutkia ravinteiden riippuvainen muutokset NUCB2 /nesfatin-1 eritystä MGN3-1 soluista, media kerättiin jälkeen erityisiä itämisaika. Estämiseksi solujäte, näytteitä sentrifugoitiin (13000 rpm 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa), ja yläosa 700 ui säilytettiin -20 ° C: ssa, kunnes nesfatin-1 mittaus. Mittaamiseksi verenkierrossa NUCB2 /nesfatin-1, verta kerättiin 7 a.m (pian valon vaihe alkaa), kolmetoista (keskellä valon vaiheessa) ja 7 p.m (ennen alkamista tumma vaihe). Verinäytteet annettiin hyytyä jäällä, ja seerumi erotettiin sentrifugoimalla (7000 rpm 9 minuutin ajan 4 ° C: ssa) ja säilytettiin -20 ° C: ssa, kunnes määritykset tehtiin. NUCB2 /Nesfatin-1 sekreetiotasot media mitattiin käyttäen Nesfatin-1 (1-82) (Rotta) ELISA Kit (Luettelonumero EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., Kalifornia). Raja määrityksen herkkyyden oli 1,2 ng /ml nesfatin-1, jossa havaittavalla alueella ,1-1000 ng /ml. Määrä immunoreaktiivisen materiaalin määritettiin käyttäen ei-lineaarista regressiokäyrän-fit, jota käytettiin määrittämään ja vertaa pitoisuus NUCB2 /nesfatin-1 eritystä seerumissa ja median näytteitä.

NUCB2 /Nesfatin- 1 seerumissa ja Media ja Total greliini- tasoilla mediassa

tutkia ravinteiden riippuvat muutokset NUCB2 /nesfatin-1 ja yhteensä greliinin eritystä MGN3-1 soluista, media kerättiin jälkeen erityisiä itämisaika. Estämiseksi solujäte, näytteitä sentrifugoitiin (13000 rpm 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa), ja yläosa 700 ui säilytettiin -20 ° C: ssa, kunnes NUCB2 /Nesfatin-1 ja yhteensä greliinin mittaus. Verinäytteet annettiin hyytyä jäällä, ja seerumi erotettiin sentrifugoimalla (7000 rpm 9 minuutin ajan 4 ° C: ssa) ja säilytettiin -20 ° C: ssa, kunnes määritykset tehtiin. NUCB2 /Nesfatin-1 erityksen tasoja seerumissa ja median mitattiin käyttäen Nesfatin-1 (1-82) (Rotta) ELISA Kit (Luettelonumero EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., Kalifornia). Raja määrityksen herkkyyden oli 1,2 ng /ml nesfatin-1, jossa havaittavalla alueella ,1-1000 ng /ml. Samoin koko greliinin sekreetiotasot media mitattiin käyttämällä Ghrelin (Rotta, hiiri) EIA Kit (Luettelonumero EK-031-31, Phoenix Pharmaceuticals Inc, Kalifornia). Raja määrityksen herkkyyden oli 1,16 ng /ml yhteensä greliinin kanssa havaittavalla alueella 0-100 ng /ml. Määrä immunoreaktiivisen materiaalin määritettiin käyttäen ei-lineaarista regressiokäyrän-fit, jota käytettiin määrittämään ja vertaa pitoisuus NUCB2 /nesfatin-1 eritystä seerumissa ja median näytteitä.

Tilastollinen analyysi

Analyysit määrällisten qRT-PCR ja ELISA tiedot suoritettiin käyttäen One-Way ANOVA seurasi Tukeyn monivertailutestillä. GraphPad Prism versio 5 (GraphPad Software Incorporated, San Diego, CA, USA) käytettiin tilastollisiin analyyseihin ja kuvaajia. Merkitsevyys määritetään, kun p < 0,05. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM.

Tulokset

NUCB2, PC 1/3 ja PC 2-mRNA: t ilmentyvät MGN3-1 soluissa ja NUCB2 mRNA ilmentyy vatsassa, maksassa, pieni suolistossa ja paksusuolen uroshiirten

tunnistettu ilmaus NUCB2 (202 emäsparia), prohormone konvertaasi 1/3 (400 emäsparia), ja prohormone konvertaasi 2 (406 emäsparia) mRNA MGN3-1 soluissa (kuvio. 1A). NUCB2 (202 bp) mRNA: n ekspressio havaittiin myös mahassa, maksassa, ohutsuolessa ja paksusuolessa mies C57 /BL6-hiiriä (Fig. 1 B). Absoluuttiset tasot NUCB2 mRNA: n ilmentymisen mahalaukussa oli suurempi kuin NUCB2 mRNA: n ekspression maksassa, ohutsuolessa ja paksusuolessa (Fig. 1 C).

MGN3-1 solut ovat immunopositiivisia greliinin NUCB2 /Nesfatin-1 , PC 1/3 ja PC 2

Fluoresenssimikroskopia näkyy MGN3-1 solut värjättiin anti-nesfatin-1 vasta-aineella (Texas-punainen, Fig. 2B) ja anti-greliini-aine (FITC-vihreä; Fig. 2A) osoitti selkeän kolokalisaation (Yellow, Fig. 2C) on nesfatin-1 ja greliini immunoreaktiivisuus. Kuitenkin jotkut greliini positiiviset solut eivät olleet immunoreaktiivisia nesfatin-1 (Fig. 2C). MGN3-1 solut osoittivat PC 1/3 immunoreaktiivisuus (Texas Red, Fig. 2D) ja PC 2 immunoreaktiivisuus (Texas Red, Fig. 2E). DAPI (Blue) värjätään tumaan kaikkien solujen lukien ne solut eivät positiivisia proteiineja tutkittu. Ohjaus liukuu värjättiin sekundaarinen vasta-aineella yksinään (Fig. 2F) ei immunoreaktiivisuus. Konfokaaliset kuvantaminen osoitti MGN3-1 solut värjättiin anti-nesfatin-1 vasta-aineella (Texas-punainen, Fig. 3A) ja anti-greliini-aine (FITC-vihreä; Fig. 3B) osoitti selkeän kolokalisaation (Yellow, Fig. 3C) of nesfatin-1 ja greliini immunoreaktiivisuus. Negatiivinen kontrolli värjätään ainoastaan ​​sekundaarisia vasta-aineita yksinään (Fig. 3d).

NUCB2 proteiinin ilmentymisen paksusuolen, ohutsuolessa ja maksassa uroshiirillä

NUCB2 proteiini ekspressoituu paksusuolen ohutsuolessa ja maksassa uroshiirillä osoittaa selvästi kaistalla NUCB2 vastasi noin 50 kD. Rat nesfatin-1-peptidi, jota käytetään positiivisena kontrollina on esitetty erillinen vyöhyke, joka vastaa noin 10 kDa (kuvio. 4A, vasen kuva). Kuitenkaan mitään juovat, jotka osoittavat täysin jalostettu nesfatin-1 näkyivät 10 kDa kudosnäytteistä (Fig. 4A, vasen kuva). Olemme myös löytäneet bändit noin 47 kDa alla 50 kDa ohutsuolessa ja maksassa, mutta ei paksusuolessa (Fig. 4A, vasen kuva). Selvä bändi GAPDH käytettiin ohjaus talon pitäminen geeni havaitaan 37 kDa esitetty kaikissa kudoksissa (Fig. 4A, oikea kuva). NUCB2 /nesfatin-1-immunoreaktiivisuus havaitaan limakalvoilta ohutsuolessa (Fig. 4B, vasemmalla kuva) ja paksusuoli (Fig. 4B; oikea kuva).

vaikutukset glukoosin ja L-tryptofaania on NUCB2 mRNA: n ekspression, ja NUCB2 /nesfatin-1 eritystä MGN3-1 soluista

soluja inkuboidaan 100 mM glukoosia DMEM oli korkeampi NUCB2 mRNA ilmaisu kuin soluja inkuboitiin 5,6, 25 ja 50 mM DMEM glukoosikonsentraatioita 1 tunnin kuluttua inkubaation (Kuva. 5A). 2 tunnin kuluttua inkubaation jälkeen solut inkuboitiin 100 mM DMEM olivat merkittävästi korkeammat NUCB2 mRNA: n ekspressio kuin soluja inkuboitiin 5,6 ja 50 mM glukoosi (DMEM, Fig. 5C). 1 tunnin (kuvio. 5B) ja 2 tuntia (Kuva. 5D), ei ollut merkittäviä eroja NUCB2 /nesfatin-1 eritystä. NUCB2 mRNA-ekspressio oli merkittävästi suurempi soluja inkuboitiin 10 mM L-tryptofaani (Fig. 5E) verrattuna soluihin, jotka inkuboitiin 0,07 ja 1,0 mM L-tryptofaani. NUCB2 /nesfatin-1 eritystä soluista inkuboitiin 1,0 ja 10,0 mM L-tryptofaani olivat huomattavasti korkeampia kuin soluja inkuboitiin 0,7 mM L-tryptofaani (Fig. 5F).

Vaikutus linoleenihappo, oktaanihappo ja öljyhappo happo NUCB2 mRNA: n ekspression, ja NUCB2 /nesfatin-1: n eritys MGN3-1 solujen

Olemme löytäneet NUCB2 mRNA: n ekspressio vähenee merkittävästi soluissa, joita käsiteltiin 1, 10, ja 100 uM öljyhappoa (Fig. 6E) verrattuna kontrolliin. Ei muutoksia NUCB2 mRNA havaittiin soluissa, joita käsiteltiin linoleenihappo (Fig. 6A) ja oktaanihappo (Fig. 6C). Edelleen, NUCB2 /nesfatin-1 eritys oli muuttumattomina soluissa, joita käsiteltiin eri annoksilla linoleenihapon (Fig. 6B), oktaanihappo (Fig. 6D), ja öljyhappoa (Fig. 6F).

Vaikutus L-tryptofaani, linoleenihappo, oktaanihappo ja öljyhappo itsenäisesti greliini mRNA ilmaisun, ja yhteensä greliinin eritystä MGN3-1 soluista

Ei muutoksia greliinin mRNA (S1A kuva) ja yhteensä greliinin eritystä (S1B kuva ) havaittiin, kun soluja käsiteltiin eri annoksilla glukoosin post 1 tunnin inkuboinnin jälkeen. Greliini mRNA-ekspressio oli merkittävästi suurempi soluja inkuboitiin 1 mM L-tryptofaani (Fig. 7A), verrattuna soluihin, jotka inkuboitiin 0,07 ja 10 mM L-tryptofaani. Mitään merkittävää eroa yhteensä greliinin eritystä soluissa, joita käsiteltiin eri annoksilla L-tryptofaani (Fig. 7B). Löysimme mitään muutosta greliinin mRNA: n ilmentymisen (Fig. 7C), mutta yhteensä greliinin eritystä oli korkea soluista inkuboitiin 100 uM linoleenihappo (Fig. 7D) verrattuna valvoa, 1 ja 10pM annosta. Ei muutoksia greliinin mRNA: ta (Fig. 7E) ja yhteensä greliinin eritystä (Fig. 7F) havaittiin, kun soluja käsiteltiin eri annoksilla oktaanihappoa. Samaan aikaan, greliini-mRNA: n (kuva. 7H), ja yhteensä greliinin eritystä (Fig. 7I) olivat merkittävästi korkeammat solut käsiteltiin 100 uM öljyhappo, verrattuna kontrolliin, 1 ja 10 uM öljyhappoa.

Krooninen vaikutukset ravintoaineiden NUCB2 mRNA ilmaisun ja seerumi NUCB2 /nesfatin-1 hiirissä

ruumiinpaino, ruoan saanti ja verensokerin profiilia hiirillä ruokittu erilaisia ​​ruokavalioita on esitetty S2 kuvassa. Hiiret ruokittu runsaasti rasvaa ruokavalioon oli huomattavan alhainen ilmentyminen NUCB2 mRNA mahalaukussa verrattuna ruokittu kontrollina runsaasti proteiinia tai korkea ruokavaliot (Fig. 8A). Ei ollut merkittävää eroa ilmentyminen NUCB2 mRNA ohutsuolessa hiirien välillä ruokittu ohjaus, runsaasti proteiinia, korkea hiilihydraatti tai runsasrasvaisen ruokavalion (Fig. 8B). Hiiret ruokittu korkea proteiinipitoisuus ja runsasrasvaisen ruokavalion on verrattain alhainen ilmentyminen NUCB2 mRNA paksusuolessa kuin hiirillä ruokittu valvontaa tai korkea ruokavaliot (Fig. 8C). Hiiret ruokittu proteiinipitoista ravintoa oli merkittävä alhainen ilmentyminen NUCB2 mRNA maksassa kuin hiiret ruokittu toisella ruokavalion (Fig. 8D). 7 a.m, ei ollut eroja seerumin nesfatin-1 /NUCB2 tasot hiirissä syötetään eri ruokavalioita (Fig. 9A). At 1 p.m, korkea hiilihydraatti ruokavalio ruokittu hiirillä oli merkitsevästi korkeampi seerumin nesfatin-1 /NUCB2 liikkeessä (Fig. 9B). Seerumin nesfatin-1 /NUCB2 oli merkitsevästi alhaisempi hiirissä ruokittu korkea hiilihydraatti, runsaasti proteiinia tai runsaasti rasvaa, vertailuryhmän ruokavalioon ruokitaan hiirillä yhdeksäntoista (Fig. 9C).

Akuutit vaikutukset ravintoaineiden NUCB2 mRNA ilmaisun , verensokerin ja seerumi NUCB2 /nesfatin-1 hiirissä

ei tapahtunut merkittäviä muutoksia ilmaus NUCB2 mRNA mahalaukussa (Fig. 10 A), ohutsuoli (Fig. 10B), paksusuoli (kuvio . 10C) ja maksassa (Kuva. 10D) väliin hiirillä ruokittu proteiinipitoista, korkea hiilihydraatti, runsaasti rasvaa tai vettä.

• PLoS ONE: Millainen Kapseli endoskooppi sopii ohjattavan itseliikkuva Kapseli endoskooppi? Kokeellinen tutkimus Käyttäen Sika Vatsa Model for Clinical Application (videot)
• PLoS ONE: Vatsa Lämpötila Records Paljasta Nursing Käyttäytyminen ja kiinteään ruokaan siirtymisen kulutus käytettäessä Vieroittamattomien nisäkäs, Kirjohylje Pup (Phoca vitulina)