Pomen vaba receptorja 3 (Dcr3) in zunanjim signalom urejeno kinaze 1/2 (Erk1 /2) v želodčni cancer

Pomen umetnih receptorja 3 (Dcr3) in zunanjim signalom urejeno kinaze 1/2 (Erk1 /2) v raka želodca
Izvleček
ozadju
Decoy receptorja 3 (DcR3), član tumorske nekroze faktor receptor (TNFR) naddružina, ki je povezan z zatiranje protitumorsko imunosti. Je zelo izražena v številnih tumorjih in njegovo izražanje lahko ureja /MEK /ERK signalne poti MAPK. MAPK /MEK /ERK poti so poročali, da je regulator tumorja nastanku, razvoju in klonsko ekspanzijo. Zunanji signal regulirano kinaze (ERK) je ključni član te poti.
Rezultati
izražanja DcR3 in ERK1 /2 v tumorskih tkivih bolnikov z rakom želodca je bila bistveno višja od ne-rakavi skupine (P
< 0,05). Ni bilo statistično značilne razlike med tumorskih tkiv pri bolnikih z različnih starosti in spola, in celo različnih diferenciacije (P
> 0,05). Vendar pa sem raka na želodcu, je bila pri bolnikih s fazi DcR3 in ERK1 /2 stopnje bistveno nižje kot pri bolnikih z bolj naprednimi fazah.
Sklepi
DcR3 in ERK1 /2 igrajo ključno vlogo pri razvoju raka želodca in so lahko nove oznake za navedbo učinkovitosti zdravljenja želodčnega raka v prihodnosti.
Ozadje
vaba receptorja 3 (DcR3) je član tumorske nekroze faktor receptor (TNFR) naddružine. Izkazalo se je, da je vaba receptor za Fas ligand (FasL), LIGHT in TL1A [1-3], znan tudi kot TR6 [4]. DcR3 je večinoma izražena v tumorskih celicah in konkurenčno zavira TNF signalizacijo. Čezmerno DcR3 v tumorskih celicah, ki jih ščiti pred apoptozo. DcR3 ščiti tumorske celice imunskega nadzora, saj prispeva k zatiranju imunitete gostitelja proti tumorjem.
DcR3 mRNA in proteina, so dopolnjena v različnih malignih tkivih, kot so pljučni rak, rak debelega črevesa, rak želodca, požiralnika karcinoma trebušne slinavke rak ter maligni melanom [1, 5, 6]. Wu et al.
[7], so poročali, da DcR3 ni mogoče zaznati pri bolnikih brez tumorjev, vendar bi lahko zaznali pri 98,8% (82/83) bolnikov z malignimi raka.
Ta pojav kaže, da je povišana DcR3 izražanje je bistveno povezana z tumorigeneze in napredovanje tumorja. Wu et al.
[8], so poročali, da je bil DcR3 močno izražena v človeškega raka želodca (GC) in pozitivni korelaciji z razvojem in metastazami želodca lezij. Želodčne bolniki z rakom z visoko DcR3 izražanja predstavila bolj napredno pN2-3 bolezni kot tisti z nizkimi DcR3 izražanje a.
DcR3 za se FasL lahko sodelujejo v napredovanje raka želodca. Nadaljnje vrednotenje možnih vlog DcR3 in urejanju DcR3 izražanja v malignih celic je zelo pomembno za razvoj novih strategij za nadzor rast malignih celic, ki se izmika gostitelja imunskega nadzora.
V zgodnji fazi, MAPK /ERK poti se aktivira v tumorjih, ki je znan znak za veliko vrst raka pri ljudeh. Nedavno je več linij dokazov predlagal, da bi ERK parameter za napovedovanje prognozo različnih vrst raka, kot sta rak dojke, rak debelega črevesa, rak trebušne slinavke in holangiokarcinom. Wang et al.
[9], so poročali, da je bil izraz ERK1 /2 visoko holangiokarcinom, ki se ujemajo s stopnjami TNM.
Kim et al.
[10] je pokazala, da LPS povzroča DcR3 sproščanje v črevesnih epitelijskih celic človeških (IEC), ki se je pojavila, da se preko aktivacije mitogenom aktivirana protein kinaz (MAPK), kot zunajcelični-signala regulirano kinaze 1 in 2 (ERK1 /2) in c-Jun NH2-terminalne protein kinaze ( JNK). LPS inducirani DcR3 sprostitev v SW480 celicah je bila odpravljena s ERK1 /2 in zaviralci JNK. Poleg tega Yang et al.
[11] je poročal, da 3 g /ml DcR3 izrazito inducirano fosforilacijo ERK in p38.
V skladu s temi poročili, predlagamo, da se DcR3 in ERK1 /2 tesno povezana. V DcR3 geni tesno povezana s pojavom in razvojem številnih vrst tumorjev. V tej študiji smo raziskovali nivo izražanja in lokacijo DcR3 in ERK1 /2 pri bolnikih želodca z rakom različnih starosti, spolu, stopnji in diferenciacija, raziskati odnos med DcR3 /ERK1 /2 in želodca nastanek in razvoj raka. Poleg tega nudimo predloge za klinično diagnozo želodčnega raka.
Metode
kliničnih vzorcev
Tumorji so bili pri bolnikih želodca z rakom, ki so opravili endoskopsko biopsijo ali kurativnih dejavnosti v Zhongshan bolnišnici povezan z Xiamen univerzo. Tumorske tkiva, iz katerega so bile izolirane DNA in beljakovin so iz svežih osebka resekcijo operacijo. Vsi vzorci so bili pridobljeni s soglasjem pacienta in odobritev Odbora za medicinsko etiko Zhongshan Hospital Xiamen University.
Miši
Vsi eksperimenti so bili izvedeni z 6-8 tednih moški golih miših, kupljene od modela Research Center živali Medical College Xiamen University. Vse živali so bile nastanjene v posebnih patogenov prostih pogojih s stalnim dostopom do vode in večerjo. Vsi eksperimentalni postopki so bili izvedeni po odobritvi Odbora za živali oskrbe in uporabe Univerze Xiamen.
Celične kulture
človeške želodčne rak celične linije BGC823 je ohranila v našem laboratoriju, ki je kultivirani v posodah z Dulbecco je spremenjen Eagle je medij (DMEM), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (FBS), in 1% penicilin-streptomicina pri 37 ° C v vlažni atmosferi 5% CO2.
reagentov
bile kupljene DMEM, FBS in penicilin-streptomicinom Hycolne Corporation (Utah, ZDA). Hematoxylin-in-eozin (H & E) test kit so bile kupljene od Chemicon International, Inc (Temecula, CA, ZDA). ERK1 /2 in DcR3 Abs so bili kupljeni od Santa Cruz Bio tehnologije. RT-RCR reagenti so bili kupljeni od Takara (Dalian, Kitajska). Premaz zaporedje smo sintetizirali iz Sangon (Shanghai, Kitajska).
In vivo živalskih modelih tumorjev
so tumorjev, ki nastajajo v moškem golih miših, ki ga intramuskularno (im) injiciranje BGC823 celic (1,0 × 105 celic v 100 nI PBS) v desnega krila. Meritve tumor smo pretvorili v volumen tumorja (V) s formulo (L x W2 x 0,52), kjer sta L in W dolžino in širino oz. Meritve so bile narejene s šestilom Vernier. Vse miši s tumorjem pri čemer smo naključno razdelili v skupine (2 miši /skupina).
RT-PCR in Western blotting analizo za preverjanje ekspresije DcR3 /ERK
Celotna RNA DcR3 in ERK1 /2 je bil ekstrahiran iz spodbujena celice, ki uporabljajo TRIzola. Za merjenje ERK /DcR3 število kopij gena, DNK iz svežih vzorcih tumorja so analizirali z RT-PCR. Na zgornjem in spodnjem toku primerji za ERK1 mRNA so 5'-CCTGCTCATCAACACCACC-3 "in 5'-CGTAGCCACATACTCCGTCA-3", in za ERK2 mRNA so 5'-TCTTCC AGCCCTCCTTCCTG-3 'in 5' CGTTTCTGCGCCGTTAGGT-3 ". Vzorce smo denaturirali pri 95 ° C za 4 min, čemur sledi 35 ciklov pomnoževanja (95 ° C, 45 sek, 55 ° C, 45 sek in 72 ° C, 60 sek). Proizvodi so bili 300-bp in 400 bp fragmenta oz. Za DcR3 mRNA, je bil pred premaz 5'GCAAAGCCAAGGATTCCCCCTG -3 "in primer nadaljnji bil 5'-GGCACTGCTCTGAGCTGGAGCTG-3". Vzorce smo denaturirali pri 95 ° C za 4 min, čemur sledi 30 ciklov pomnoževanja (95 ° C, 45 sek, 55 ° C, 45 sek in 72 ° C, 60 sek). Produkt je bil 921-bp fragmenta.
BGC823 Celice požanjemo in liziramo celična liznega pufra (1% (v /v) Nonidet P-40, 150 mM NaCI, 50 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM PMSF, 2 g /ml aprotinina in 2 g /ml leupeptina), ki se lahko sprosti DcR3 in ERK1 /2 proteine. Petindvajset mikrogramov celotne lizat smo frakcionirali s SDS-PAGE in izpostavljena Western blot analizo, s pomočjo anti-ERK ali anti-DcR3 mAb (klon 3 H5).
Western blot in ELISA za preverjanje izražanja DcR3 /ERK po zdravljenju zaviralci
BGC823 celic supernatante kulture so bili zbrani v različnih časovnih intervalih, in ravni U0126, PD98059, APDC, MEK1 /2 in ERK1 /2 interferenc so količinsko uporabo komercialnih ELISA, v skladu z navodili prodajalca. Celice, predelane z ERK1 /2 shRNA (5: 2, 6: 2), U0126 /PD98059 (0 mol /L, 5 mol /L, 10 umol /L, 20 umol /L, 40 umol /L) in APDC (0 umol /L, 10 umol /L, 20 umol /L, 40 umol /L, 80 umol /L), oz. Po 5- ali 7-dnevni inkubaciji smo celice izpostavimo citokinov, kot je naveden testu. Petindvajset mikrogramov celotne lizat smo frakcionirali s SDS-PAGE in izpostavljena Western blot analizo, s pomočjo anti-ERK ali anti-DcR3 mAb (klon 3 H5).
Analizo imunohistokemija za izražanje DcR3 in ERK1 /2
Tumorske tkiva so bile določene v formaldehidom mediju in vdelali v parafin. Profili debeline 6 mm so bili nameščeni na steklenih ploščicah predhodno obdelane z 0,1% poli-L-lizina. Nato so deparaffinaged v xy-Lene, dehidrirani v razvrstijo etanola in namoči v 3% H 2O 2 za 10 minut, da odpravijo endogeni aktivnosti peroksidaze. Naslednji so bili drsi potopljeni v citratnem pufru (pH 6,0) in kuhamo pri 92-98 ° C v mikrovalovni pečici 10 min. Nato so se sperejo 3 krat s PBS za vsako ter blokirali z 10% normalno kozji serum v PBS 1 uro pri sobni temperaturi 10 min. Drsniki nato reagiramo z afiniteto očistimo kunčjega anti-TR6 Ab (1,67 g /ml) pri sobni temperaturi 2 uri. Po izpiranju smo drsi inkubirali s biotiniliranega kozji-anti-kunčjega protitelesom 10 minut. TR6 signal, je razkril streptavidina-peroksidaze uporabo DAB kot substrat v skladu z navodili iz Histostain-Plus komplet (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). DcR3 signali so se pokazali v rjavi barvi. Na koncu so bili diapozitivi jih nasprotno s hematoksilinom in zapečatena z vodno montažno medije (Zymed).
Statistična analiza
Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SD. Pomen razlike med skupinama je bila ocenjena s študentovih dvorepe t-testom. Verjetnost vrednost manj kot 0,05 je zdelo pomembno. Vsa sredstva so bili izračunani iz vsaj treh neodvisnih poskusih.
Rezultati
bolnikih z rakom so povišane vrednosti DcR3 PODJETJA
Za študij korelacijo med DcR3 izražanja in tumorja nastanek in razvoj, so se tumorji od 50 bolnikov z rakom želodca zbrana in testirana za DcR3 mRNA in koncentracije proteina. Kot je prikazano na sliki 1a, je bilo 921 bp DcR3 trakovi ustvari RT-PCR iz tumorskih tkiv večini bolnikov (36/50), v primerjavi z ne-rakavih tkiv (2/50) iz istih organov teh bolnikov. Ti rezultati kažejo, da so bile ravni DcR3 znatno povečal (osem naključno izbral kliničnih vzorcev so prikazani na sliki 1a). Da bi še dodatno potrjujejo naše rezultate, so bile ravni DcR3 beljakovin pregledal zahodni blot. Rezultati kažejo, da je mogoče DcR3 protein odkrili v večini bolnikov z rakom; DcR3 protein smo odkrili pri 74% (37/50), od tumorskih tkiv, vendar le 6% (3/50) od zunaj rakavih tkiv (tabeli 1 in sliki 1b; osem naključno nabranih klinični vzorci so prikazani na sliki 1b ). Slika 1 Izraz DcR3 z rakom želodca in ne-rakavih tkiv, ki so jih analizirali RT-PCR (Figure1a) in Western blot analiza (Figure1b). A: Lane M, DNK označevalce; lanes1-7, tumor tkiva; proga 8, non-rakave tkiva; DcR3 mRNA bil pozitiven v 36 od 50 tumorskih tkiv (1-7) in negativen v ne-rakavih tkiv (8). b: lanes1-7, tumor tkiva; proga 8, non-rakave tkiva. DcR3 protein je bil pozitiven v 37 od 50 vzorcev tkiva tumorja (1-7), ki le 3 od 50 v ne-rakavih tkiv (8).
Tabela 1 Analiza bolnikov z rakom želodca z DcR3 in ERK1 /2 izražanja v tumor in normalnih tkiv
Ohišja
Pozitivna številka
Pozitivna stopnja (%)
tumor
50
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
36
37
28
72,0
74,0
56,0
ERK1
37
42
36
74,0
84,0
72,0
P
> 0.05
ERK2
32
37
27
64,0
74,0
54,0
Non-rakavi
50
DcR3
2
3
0
4.0
6,0
0
ERK1
6
5
1
12,0
15,0
2.0
ERK2
9
10
3
18,0
20,0
6,0
Izražanje ERK1 /2 v kliničnih vzorcih
identificirati signalnih molekul, povezanih z DcR3, se izražanjem ERK1 /2, smo testirali JNK in p38. Ugotovili smo, da lahko le ERK1 /2 zaznati v vzorcih tumorjev (podatki niso prikazani za JNK in p38). ERK1 mRNA smo odkrili v 74% vzorcev (37/50) in ERK2 mRNA smo odkrili v 64% vzorcev (32/50; tabeli 1 in slika 2a). Na nivoju proteina je ERK1 odkrili v 84% (42/50) in ERK2 v 74% (37/50) tumorskih tkiv (tabela 1 in slika 2b). Ti rezultati kažejo, da imajo bolniki z rakom želodca tumorji višje ERK1 /2-pozitiven pojav v primerjavi z ne-rakavih tkiv (P
< 0,05). Tam je bila pozitivna korelacija med mRNA in beljakovin, kot v 42 50 tumorja tkivu ERK1 je bil povišan nivo beljakovin, od tega 36 primerov v skladu z izrazom mRNA. V nasprotju s tem je ERK1 protein izraz zaznali le pet normalnih tkiv. Pri preučevanju ERK2 je bilo 37 od 50 primerov tumorskih tkiv pozitiven ERK2 beljakovin izražanja, od tega je bilo 27 primerov v skladu z izrazom ERK2 mRNA, medtem ko je le deset primerov je pokazala pozitivno beljakovin izraz v normalnih tkivih. Osem naključno nabranih vzorcev so prikazani na sliki 2. Slika 2 Izraz ERK1 /2, rak želodca in ne-rakavih tkiv analizirajo s RT-PCR (slika 2a) in Western blot analiza (slika 2b). A: Lane M, DNK označevalce; lanes1-7, tumor tkiva; proga 8, non-rakave tkiva; ERK1 in ERK2 mRNA so bili pozitivni v tumorskih tkivih. b. ERK1 in ERK2 beljakovine so bili pozitivni v tumorskih tkivih (1-8)
Lokacija ERK1 /2 pri bolnikih z rakom želodca
Za pregled ERK1 /distribucija 2, so tumorji od 50 bolnikov testiral imunohistokemijo. Rezultati kažejo, da so ERK1 /2 izražen v tumorskih tkiv iz večine bolnikov. ERK1 izraz je bilo ugotovljeno v citoplazmi. ERK2 pozitiven izraz je bilo v nekaterih tumorskih celic (slika 3). Slika 3 Lokacija ERK1 2 beljakovin /v želodčnih rakavih tkivih analiziral imunohistokemijo. A: Control, B: ERK1, C:. ERK2
DcR3 in ERK1 ravni /2 korelaciji s tumorsko invazijo, ne glede na starost, spol ali diferenciacijo
pozitivni pojavnosti DcR3 mRNA v tumorskih tkivih bolnikov z rakom želodca je bila 72,0% (36/50), in DcR3 beljakovin 74,0% (37/50), ki je bila bistveno višja kot pri ne-rakastih tkiv, ki kažejo samo 4% (2/50) in 6% (3/50), v tem zaporedju ( P
< 0,05; tabela 1). Pozitivna pojav ERK1 /2 mRNA izražanja je bila 74,0% (37/50) in 64,0% (32/50), in izražanja proteinov 84,0% (42/50) in 74,0% (37/50). Oba sta bila precej višja od ne-rakastih tkiv, ki prikazuje 12,0% (6/50) in 18,0% (9/50) in 10,0% (5/50) in 20,0% (10/50), oziroma (tabela 1). Ti rezultati kažejo, da DcR3 in ERK1 /izraz 2 ravni korelaciji s tumorsko nastanek in razvoj.
Kot je prikazano v tabelah 2, 3 in 4, ni bilo bistvene razlike med tumorskih tkiv, različnih starosti, oba spola in bolniki z različnimi diferenciacije faze raka želodca (P
> 0,05). Vendar pa so DcR3 in ERK1 /2 izražanje ravni precej visoka v fazi TNM II-IV (tabela 5). Tako so izrazi DcR3 in ERK1 /2 korelaciji s tumorsko invazijo in stopnji TNM, vendar ne glede na starost, spol ali differentiation.Table 2 Korelacija izražanja DcR3 in ERK1 /2 s starostjo pri bolnikih z želodčnim rakom
primeri
Pozitivna številka
Pozitivna stopnja (%)
≥50
32
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
25
28
21
78,1
87,5
65,6
ERK1
28
31
26
87,5
96,9
81,2
P
> 0.05
ERK2
20
22
16
62,5
68,8
50,0
< 50
18
DcR3
11
9
5
61,1
50,0
27,8
ERK1
13
11
5
72,2
61,1
27,8
ERK2
12
15
6
66,7
83,3
33,3
Tabela 3 Povezanost izražanja DcR3 in ERK1 /2 s spolom pri bolnikih z želodčnim rakom
zadevah
Pozitivna številka
Pozitivna stopnja (%)
Male
39
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
29
29
24
74,4
74,4
61,5
ERK1
32
35
28
82,1
89,7
71,8
P
> 0.05
ERK2
26
30
23
66,7
76,9
59,0
ženska
11
DcR3
7
8
5
63,6
72,7
45,6
ERK1
9
7
6
81,8
63,6
54,5
ERK2
6
7
4
54,6
63,6
36,4
Tabela 4 Povezanost izražanja DcR3 in ERK1 /2 z diferenciacijo tumorja pri bolnikih z želodčnim rakom
zadevah

Pozitivna številka
Pozitivna stopnja (%)
No
9
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
7
7
5
77,8
77,8
55,6
ERK1
7
9
6
77,8
100,0
66,7
P
> 0.05
ERK2
6
7
5
66,7
77,8
55,6
Zmerno
28.
DcR3
21
23
20
75,0
82,1
71,4
ERK1
24
24
22
85,7
85,7
78,6
ERK2
19
24
17
67,9
85,7
60,7
nizka
13
DcR3
8
7
5
61.5
53,9
38,5
ERK1
10
9
8
76,9
69,2
61,5
ERK2
7
6
5
53,9
46,2
38,5
Tabela 5 Povezanost izražanja DcR3 in ERK1 /2 z patoloških fazah tumorja pri bolnikih z želodčnim rakom
fazi TNM
zadevah

Pozitivna številka
Pozitivna stopnja (%)
sem
6
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
1
1
1
16,7
16,7
16,7
ERK1
2
2
1
33,3
33,3
16,7
P
> 0.05
ERK2
1
1
0
16,7
16,7
0,0
II
17
DcR3
12
13
10
70,6
76,5
58,8
ERK1
14
14
11
82,4
82,4
64,7
P
> 0.05
ERK2
10
12
9
58,8
70,6
52,9
III
25
DcR3
21
21
21
84,0
84,0
84,0
ERK1
23
24
22
92,0
96,0
88,0
P
> 0.05
ERK2
20
23
18
80,0
92,0
72,0
IV
2
DcR3
2
2
2
100,0
100,0
100,0
ERK1
2
2
2
100,0
100,0
100,0
P
> 0.05
ERK2
1
1
1
50,0
50,0
50,0
ravni izražanja DcR3 in ERK1 /2, dopolnjena v živalskih modelih
Kot je razvidno v tabeli 6, po injiciranju BGC823 celice v desni bok golih miših, tumorji rasla vsak dan. RT-PCR smo uporabili za testiranje DcR3 in ERK1 /2 ravni mRNA v tumorjih in zahodni blot analizo je bila uporabljena za preučitev ravni beljakovin. Pri modelih želodčnih raka na živalih, so bile odkrite DcR3, ERK1 in ERK2 na 921 bp, 300 bp in 400 bp oz. V teh tumorskih tkivih je DcR3 mRNA zaslediti, šesti dan, vrhuncem na 10. dan, in ostali odkrije na dan 12. DcR3 je bila odkrita tudi šesti dan na dan 12 v jetrih, medtem ko je bilo pri srcu in pljučih (odkrijejo šele na dan 12 slika 4a). ERK1 /2 mRNA izrazi so bile odkrite v štirih dneh v tumorskih tkivih, in ERK1 mRNA vrhuncem na dan 10. (sliki 4a in v tabeli 7) .table 6 teža BGC823 tumorja v golih miših (x ± s, n = 6)
skupina
Δ teža /mg
2 d
4d
6D

8d
10 d
12 d
Normal
- -
- -
- -
Model
0. 47 ± 0. 17 △
0. 77 ± 0. 28 △
1. 01 ± 0. 39 △
1. 43 ± 0. 79 △
1. 65 ± 0. 68 △
1. 46 ± 0. 66 △
Opomba: △ P
< 0,01 vs
normalno; ** P
< 0,01 vs
modelu.
Tabela 7 Izražanje DcR3 in ERK1 /2 mRNA v tumorskih tkivih živalskih modelih analiziral RT-PCR

2d

4d

6d

8d

10d

12d

DcR3
—
—
+
+
++
++
ERK1
—
+
+
+
++
++
ERK2
—
+
+
+
+
+
Slika 4 Izraz DcR3 in ERK1 /2, v modelih miši analiziranih RT-PCR (slika 4a) in Western blot analiza (slika 4b). A: Lane M DNA dvojno podajo; lanes1-6, srce, jetra, vranico, pljuča, ledvice in tumorskih tkivih modelov miško na četrti dan; lanes7-12, ki je osmi dan; lanes13-18, dvanajsti dan; ERK1 mRNA je bil pozitiven v lane2,8,9,12,14,15,18, ERK2 mRNA je bil pozitiven v lane1,2,6,9,10,12,13,14,15,17,18. DcR3 mRNA bila odkrita v lane8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 b: stezo 1, srce; lane2, jetra; lane3, vranica; lane4, pljuč; lane5, ledvice; lane6, tumor tkiva; Izraz ERK1 beljakovin povečala v tumorskih tkivih, kot je čas mineval, v srce, jetra in ledvice je trajal 12 dni, lahko izraz ERK2 odkriti v vranici in tumorja od drugega dne, ki je bil pozitiven v tumorskih tkivih do četrti dan in vsi petih organov v dvanajsti dan. Izraz DcR3 beljakovin je bila pozitivna v tumorskih tkivih in jetrih na šesti dan in v vranici na deseti dan, ki je bil negativen v srcu, pljučih, ledvicah do dvanajstega.
DcR3 beljakovin je bila odkrita na šesti dan v tumorju tkiva in jeter, in izraz je ostal, dokler je bil dan 12. DcR3 protein v vranici in po dnevu 12 v srca, ledvic in pljuč odkrije na dan 10. ERK1 beljakovin je bila odkrita na Četrti dan v tumorskih tkivih, in še naprej povečuje vsak dan. ERK1 protein ostala na stabilni ravni srca, jeter in ledvic, vendar je bila nižja v pljuča in vranico 10. dan, potem ko je dosegel vrh. ERK2 je bila zaznana v vranice in tumorskih tkivih, drugi dan. Od štirih dneh, je ERK2 protein odkrili v vseh šestih vzorcih, in še naprej povečevala do dne 12. Ti rezultati kažejo, da bi lahko imela ERK1 in ERK2 različne učinke na tumorja nastanku, razvoju in klonsko ekspanzijo.
DcR3 izraz se je po zaviranju izražanje ali fosforilacijo ERK1 /2 v BGC823 celicah
da bi raziskali vpliv ERK1 2 izražanja in fosforilacije /o DcR3 izražanja, so BGC823 celice zdravijo z ERK1 /2 shRNA ali z zaviralci ki specifično urejajo ERK pot. Western blot analiza je potrdila, da so inhibitorji učinkovito blokiran fosforilacijo procesi molekul MEK /ERK, in da je shRNA znatno zmanjša ekspresijo ERK1 /2 (slika 5). Kot je prikazano na sliki 5A, ko so BGC823 celice zdravljeni z ERK1 /2 shRNA, ERK1 /2 in P-ERK1 /2 ravni zmanjšal v primerjavi s kontrolo. Slika 5 Izraz ERK1 /2 in P-ERK1 /2 v skladu BGC823 celic z motnjami plazmida in inhibitor odkrije metodo Western blot. A: ekspresijski nivoji ERK1 /2 in P-ERK1 /2 zmanjšal v primerjavi s kontrolo. 1) kontrolna skupina; 2) 5: 2 (plazmid: reagent); 3) 6: 2 (plazmid: reagent). b: ERK1 /2 fosforilacija postopoma znižala na koncentracije U0126 zaviralca, PD98059 povečala, vendar skupno ERK1 /2 protein izraz skoraj ni spremenil. 1) 0 mol /L; 2) 5 mol /L; 3) 10 mol /L; 4) 20 umol /L; 5) 40 umol /L. c: ERK1 /2 fosforilacija postopoma zmanjševalo koncentracij zaviralca APDC. 1) 0 mol /L; 2) 10 mol /L; 3) 20 umol /L; 4) 40 mol /L; 5) 80 umol /L. d: PD98059 lahko seveda zavira raven fosforilacijsko MEK1 /2, vendar to ni spremenilo MEK1 /2 ali NF-κB raven izražanja. 1) 0 mol /L; 2) 5 mol /L; 3) 10 mol /L; 4) 20 umol /L; 5) 40 umol /L.
U0126 je zelo učinkovit inhibitor MEK, ki izhajajo iz inhibicije fosforilacije ERK, tako kot PD98059. ERK fosforilacijo postopoma zmanjševalo koncentracijami zdravil povečalo, čeprav je skupna izraz ERK1 /2 protein komajda spremenila (slika 5B).
APDC lahko inhibira aktivacijo NF-κB celic v različnih celicah. Z razgradnjo IκB, lahko APDC zmanjša translokacijo NF-κB, tako blokiranje aktivacije NF-κB. Kot je prikazano na sliki 5 ° C, pod različnimi koncentracijami APDC, spreminjanjem višine inhibicije NF-κB lahko znatno zmanjšujejo ERK1 /2 nivoja fosforilacije. Vendar pa je poseben mehanizem zahteva nadaljnje preiskave.
Da bi preučili učinek teh zaviralcev in shRNA na DcR3 izražanja smo uporabili ELISA analizo, ki je pokazala, da je izločen DcR3 v supernatanta se je po različnih tretmajev (Slika 6). Statistična analiza je pokazala, da so bile koncentracije izločanja DcR3 bistveno razlikujejo med preizkusnih skupinah in kontrolne skupine (P
< 0,05). Kot je prikazano na sliki 6, poseg ERK1 /2, BGC823 celicah privedle do zmanjšane proteinske ekspresije DcR3 v primerjavi s kontrolno skupino. Trend se ujema s stopnjo ERK izraz na sliki 5, in dokazuje, da sta dve pozitivni korelaciji. Nadalje, DcR3 in P-ERK ekspresijski nivoji zmanjšala ko smo celice obdelali z različnimi koncentracijami U0126, PD98059 in APDC. Ti podatki kažejo, da izločanje DcR3 v pozitivni korelaciji s-ERK1 P /2 nivojih izražanja v BGC823 želodčnih celic. Treba je omeniti, da je v skupini U0126, sekrecijski nivoji DcR3 poveča, ko koncentracija zdravila dosežena 40 umol /L; Vendar pa je poseben mehanizem zahteva nadaljnje preiskave. V skupini APDC, ravni DcR3 ni bistveno pri koncentracijah, višjih od 20 mol /L spremeniti. Slika 6 Izraz DcR3 proteina z vmešavanjem plazmidom in inhibitor z analizo ELISA. A: DcR3 stopnje izraženosti v BGC823 kulture supernate zmanjšala, ko so celice zdravijo z motenj ERK1 plazmida. b: Ravni DcR3 izraz zmanjšala, ko so celice zdravijo z motenj ERK2 plazmida. c: DcR3 stopnje izraženosti zmanjšala, ko so celice zdravijo z različnimi koncentracijami U0126, PD98059 in APDC mol /L
Razprava
Dokazano je, da je gen DcR3 izražena na nizki ravni človeškega zarodka, pljuč. možganov, jeter, vranice, želodca, debelega črevesa, bezgavke in hrbtenjača, medtem ko je bila izražena na visoki ravni v raka, kot je rak prebavil, karcinomom jetrnih celic in raka trebušne slinavke [1, 12].
Wu et al.
[8] poročal, da je bila ekspresija DcR3 pri bolnikih z rakom želodca bistveno višja od normalne. DcR3 izraz v dobro diferenciranega raka želodca, je bila bistveno manjša kot pri slabo diferenciranih osebkov (P
< 0,05).
Raven izražanja DcR3 je značilno povezana z bezgavkah metastaz in patološke fazi, vendar ni v korelaciji z velikostjo tumorja, metastatskega status, ali histoloških tipov. Če so bili bolniki sledila pa za 63 mesecev, je bilo ugotovljeno, DcR3 prekomerno, da je povezana z bistveno skrajšano stopnjo preživetja [13, 14].
Veliko poročila so pokazala, da visoka raven izraz za ERK1 /2 tesno povezana z dojke, debelega črevesa in rak trebušne slinavke, kot maligni melanom, levkemija in miksomov [15-18].
Naša raziskava je pokazala, da je pri bolnikih z rakom želodca, pozitivni pojavnosti DcR3 in ERK1 /2 mRNA višje kot v ne- rakave tkiva (P < 0,05). RT-PCR in western blot je pokazala, da so bile ravni mRNA in izražanje beljakovin v DcR3 in ERK1 /2 v tumorskih tkivih bistveno višje od tistih v ne-rakavih tkiv, kar pomeni, da raven DcR3 in ERK1 /2 povezano z razvojem tumorja, ne pa s starostjo , spol ali diferenciacija (P
> 0,05).
Naši rezultati so pokazali, da je pozitivno pojavnost izražanja DcR3 in ERK1 /2 mRNA in DcR3 in ERK1 /2 beljakovin ujema med seboj. Rezultati Imunohistokemija tudi pokazala, da v želodčnih tumorjev, je ERK1 /2 visoko izraženo.
Chen et al.
[19] poroča, da je bila pozitivna stopnja DcR3 izražanja 74,4% (32/43) v karcinomom jetrnih celic, in da obstaja visoka korelacija med DcR3 izražanja in metastaz, kot tudi ponovitve in diferenciacijo.
v miške želodca modela, RT-PCR je pokazala, da bi se DcR3 mRNA odkriti v tumorjih iz šesti dan. ERK1 /2 mRNA in proteina so odkrili tudi v tumorjih, in ravni ERK1 v želodčnih tumorjev postopoma povečuje. Poleg tega so zaznali tudi v srce, jetra, vranica, pljuča in ledvica v želodčni rak modela živali, kar kaže, da imajo pomembno vlogo pri napredovanje tumorja. ERK1 /2 mRNA odkrili v štirih dneh v tumorskih tkivih, in ERK1 mRNA vrhuncem na dan 10. ERK1 beljakovin mogoče zaznati tudi na Četrti dan v tumorskih tkivih, in še naprej povečuje vsak dan. ERK1 ostala na stabilni ravni srca, jeter in ledvic, vendar je bila nižja v pljuča in vranico 10. dan, potem ko je dosegel vrh. ERK2 je bila zaznana v vranice in tumorskih tkivih, drugi dan. Od štirih dneh, je ERK2 odkrili v vseh šestih tkivih, in še naprej povečevala, dokler dan 12. ERK2 ni bilo mogoče odkriti v srca, pljuča in vranico RT-PCR na dan 12. v živalskih modelih, vendar bi se lahko odkrijejo vsebnosti beljakovin. Ti rezultati kažejo, da bi lahko imela ERK1 in ERK2 različne učinke na tumorja nastanku, razvoju in klonsko ekspanzijo. Številne študije so pokazale, da je izraz ERK1 2 mRNA in proteina /razlikuje v različnih tumorjev in celic [20, 21]. Nekatera nedavna poročila predlagal, da bi se lahko popolnoma nasprotno, v nekaterih primerih. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• MicroRNA-206 zatira rast želodčni rak celic in metastaz
• Optimalna režim trastuzumaba v kombinaciji z oksaliplatinske /kapecitabina v prvi liniji zdravljenja s HER2-pozitivnega napredovalega raka želodca (CGOG1001): multicentrično, preskušanje faze II