Význam Decoy receptora 3 (Dcr3) a vonkajším signálom regulovaná kináza 1/2 (Erk1 /2) v žalúdočnej cancer

význam Decoy receptora 3 (Dcr3) a vonkajším signálom regulovaná kináza 1/2 (Erk1 /2) u karcinómu žalúdka
Abstrakt
pozadí
Decoy receptor 3 (DcR3), člen TNF receptor (TNFR) nadčeľade, je spojený s potlačením protinádorovej imunity. To je vysoko exprimovaný v rade nádorov, a jeho expresie môže byť regulovaná MAPK /MEK /ERK signálnej dráhy. MAPK /MEK /ERK bolo hlásené, že je regulátor vo výskyte nádorov, vývoji a klonálnej expanzii. Externý signál regulované Kinase (EKR), sú nevyhnutnou členom tejto dráhy.
Výsledky
expresie DcR3 a ERK1 /2 v nádorovom tkanive pacientov s karcinómom žalúdka bolo signifikantne vyššie ako skupina bez rakoviny (P
< 0,05). Nebol žiadny štatisticky významný rozdiel medzi nádorového tkaniva od pacientov s rôznymi veku alebo pohlavia, a dokonca aj rôznych diferenciácie (P Hotel > 0,05). Avšak u pacientov s štádiu I rakovina žalúdka sa DcR3 a ERK1 /2 hladiny boli výrazne nižšie ako u pacientov s viac pokročilých štádiách.
Závery
DcR3 a ERK1 /2 hrajú dôležitú úlohu v rozvoji rakoviny žalúdka, a môžu byť nové markery pre indikáciu účinnosti liečby rakoviny žalúdka v budúcnosti.
pozadí
Decoy receptora 3 (DcR3) je členom TNF receptor (TNFR) superrodiny. Bolo preukázané, že receptor, pre Fas ligand (FasL), ľahký a TL1A [1-3], tiež známy ako TR6 [4]. DcR3 je prevažne exprimovaný v nádorových bunkách a kompetitívne inhibuje TNF signalizáciu. Nadmerná expresia DcR3 v nádorových bunkách ich chráni pred apoptózou. DcR3 chráni nádorové bunky od imunitného dozoru, že prispieva k potlačeniu imunity hostiteľa proti nádoru.
DcR3 mRNA a proteín sú amplifikovanej v rôznych malígnych tkanivách, ako je rakovina pľúc, rakoviny hrubého čreva, rakoviny žalúdka, pažeráka, karcinóm pankreasu karcinóm a malígny melanóm [1, 5, 6]. Wu et al.
[7] uvádzajú, že DcR3 nemohli byť detekované u pacientov nenádorových, ale mohol byť detekovaný v 98,8% (82/83) pacientov s malígnymi nádormi.
Tento jav ukazuje, že zvýšená DcR3 expresia je významne koreluje s tumorogenézy a progresie nádoru. Wu et al.
[8] hlásil, že DcR3 bol vysoko exprimovaný v ľudskej rakovine žalúdka (GC) a pozitívne koreluje s vývojom a metastáz žalúdočných lézií. pacientov s rakovinou žalúdka s vysokou expresiou DcR3 predstavila pokročilejšie pN2-3 ochorenia ako pacienti s nízkou expresiou v DcR3.
DcR3 na FasL môžu byť zapojené do progresie rakoviny žalúdka. Ďalšie vyhodnotenie možných rolí DcR3 a regulácia DcR3 expresiu v malígnych buniek je pre vývoj nových stratégií pre reguláciu rastu malígnych buniek, ktoré unikajú hostiteľa imunitný dohľad veľmi dôležité.
V počiatočnej fáze, MAPK /EKR dráha je aktivovaná v nádoroch, čo je pozoruhodné znamenie pre mnoho druhov rakoviny u ľudí. V poslednej dobe niekoľko línií dôkazov navrhol, že EKR môže byť parametrom pre odhad prognózy rôznych druhov rakoviny, ako je rakovina prsníka, rakoviny hrubého čreva, rakoviny pankreasu a cholangiokarcinom. Wang et al.
[9] popísali, že expresia ERK1 /2 bola vysoká v cholangiokarcinom, ktorá korelovala s fázou TNM.
Kim et al.
[10] zistili, že LPS indukované uvoľnenie v DcR3 ľudské črevné epiteliálne bunky (IEC), ktoré sa objavili, že je cez aktiváciu mitogénom aktivovanej proteínkinázy (MAPK), ako je extracelulárna signálom regulovaná kináza 1 a 2 (ERK1 /2) a c-Jun NH2-terminálny proteín kinázy ( JNK). LPS-indukovanej DcR3 uvoľňovanie v bunkách SW480 bola zrušená ERK1 /2 a inhibítory JNK. Ďalej Yang et al.
, [11] hlásil, že 3 g /ml DcR3 výrazne indukovanej fosforylácie EKR a P38.
V súlade s týmito správami, navrhujeme, aby DcR3 a ERK1 /2 spolu úzko súvisia. Gény DcR3 úzko koreluje s výskytom a rozvoju mnohých druhov nádorov. V tejto štúdii sme skúmali hladinu expresie a umiestnenie DcR3 a ERK1 /2 u pacientov s rakovinou žalúdka rôzneho veku, pohlavia, tribúna a diferenciácie, aby preskúmala vzťah medzi DcR3 //2 a žalúdočné výskytu rakoviny ERK1 a vývoja. Ďalej zabezpečujeme návrhy pre klinickou diagnózou rakoviny žalúdka.
Metódy
klinických vzoriek
Nádory boli od pacientov s karcinómom žalúdka, ktorí podstúpili endoskopické biopsia alebo liečebné operácie v Zhongshan nemocnice pridružený Xiamen univerzite. Nádorové tkanivá, z ktorej boli izolované DNA a proteín bol z čerstvého vzorky resekcia operáciu. Všetky vzorky boli získané so súhlasom pacienta a schválenie Výboru pre lekársku etiku Zhongshan nemocnice Xiamen University.
Myší
Všetky experimenty boli vykonané s použitím 6-8 týždňov samcov holých myší zakúpené od zvieracom modeli Research Center of Medical College Xiamen University. Všetky zvieratá bola umiestnená za špecifických podmienok bez patogénov s konštantnou prístup k vode a potrave. Všetky experimentálne postupy boli vykonané po schválení výborom zvierat starostlivosť a používanie Xiamen University.
Bunkových kultúr
rakovina žalúdka u ľudí bunkové línie BGC823 bola udržiavaná v našom laboratóriu, ktorá bola kultivované v bankách s Dulbeccova modifikovanom Eaglovho medium (DMEM) doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom (FBS) a 1% penicilínu-streptomycínu pri 37 ° C vo vlhkej atmosfére s 5% CO2.
činidiel
DMEM, FBS a penicilín-streptomycín boli zakúpené od Hyclone Corporation (Utah, USA). Hematoxylin eozín-a (H &E) Testovacia súprava boli zakúpené od Chemicon International, Inc. (Temecula, CA, USA). ERK1 /2 a DcR3 Abs boli zakúpené od Santa Cruz technológie Bio. RT-RCR činidlá boli zakúpené od Takara (Dalian, Čína). Primer sekvencie sa syntetizuje z Sangon (Shanghai, Čína).
In vivo zvieracích nádorových modeloch
Nádory boli generované v mužskej holých myší intramuskulárnu (im) injekcia BGC823 buniek (1,0 x 105 buniek v 100 ul PBS) do pravé krídlo. Meranie nádorov boli prevedené na objem nádoru (V) podľa vzorca (L x W2 x 0,52), kde L a W sú dĺžka a šírka, resp. Meranie bola vykonaná s nóniom. Všetky myši s nádorom boli rozdelené náhodne do skupín (2 myši /skupina).
RT-PCR a analýzy Western blot pre skúmanie expresie DcR3 /EKR
Celková RNA DcR3 a ERK1 /2 sa extrahuje zo stimulovaných buniek pomocou TRIzolu. Pre meranie EKR /DcR3 počtu kópií génu, DNA z čerstvých nádorových vzoriek bol analyzovaný pomocou RT-PCR. Nadväzujúcich priméry pre ERK1 mRNA boli 5'-CCTGCTCATCAACACCACC-3 'a 5'-CGTAGCCACATACTCCGTCA-3', a pre ERK2 mRNA boli 5'-TCTTCC AGCCCTCCTTCCTG-3 'a 5'-CGTTTCTGCGCCGTTAGGT-3'. Vzorky boli denaturované pri 95 ° C počas 4 minút, nasleduje 35 cyklov amplifikácie (95 ° C, 45 s; 55 ° C, 45 sekúnd, a 72 ° C, 60 s). Produkty boli 300 bp a 400 bp fragmenty, resp. Pre DcR3 mRNA, upstream primer bol 5'GCAAAGCCAAGGATTCCCCCTG -3 'a downstream primer so sekvenciou 5'-GGCACTGCTCTGAGCTGGAGCTG-3'. Vzorky boli denaturované pri 95 ° C počas 4 minút, nasledovalo 30 cyklov amplifikácie (95 ° C, 45 s; 55 ° C, 45 sekúnd, a 72 ° C, 60 s). Ako produkt sa získa 921-bp fragment.
BGC823 boli bunky zozbierané a lyžovanie v bunkovej lyzačním pufru (1% (v /v), Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM PMSF, 2 g /ml aprotinínu, a 2 g /ml leupeptinu), ktoré môže uvoľniť DcR3 a ERK1 /2 proteíny. Dvadsať päť mikrogramov celkového lyzátu bol frakčnom SDS-PAGE a podrobia analýze Western blot s použitím anti-EKR, alebo anti-DcR3 mAb (klon 3 H5).
Western blotting a ELISA testu pre skúmanie expresie DcR3 /EKR po liečbe inhibítory
BGC823 buniek supernatanty kultúry boli odoberané v rôznych intervaloch a hladiny U0126, PD98059, APDC, MEK1 /2 a ERK1 /2 interferencie boli kvantifikované za použitia komerčných kitov ELISA podľa inštrukcií dodávateľa. Bunky ošetrené ERK1 /2 zhrňme (5: 2, 6: 2), U0126 /PD98059 (0 pmol /l, 5 pmol /l, 10 pmol /l, 20 umol /L, 40 pmol /l) a APDC (0 umol /L, 10 pmol /l, 20 pmol /l, 40 umol /L, 80 pmol /l), v danom poradí. Po 5-tich alebo 7-dňový inkubácii boli bunky podrobené cytokínov, ako je uvedené testu. Dvadsať päť mikrogramov celkového lyzátu bol frakčnom SDS-PAGE a podrobia analýze Western blot s použitím anti-EKR, alebo anti-DcR3 mAb (klon 3 H5).
Imunohistochemické analýza na expresiu DcR3 a ERK1 /2
nádorového tkaniva boli fixované vo formaldehyde médiá a vložené do parafínu. Sekcia 6 mm hrubé boli umiestnené na sklenené sklíčka vopred ošetrené 0,1% poly-L-lyzínu. Oni boli potom deparaffinaged v xy Lene, dehydrované v etanolové a namočia do 3% H 2O 2 po dobu 10 minút na odstránenie endogénnej peroxidáza aktivity. Ďalej bola sklíčka ponorená v citrátovom pufri (pH 6,0) a varí sa pri 92-98 ° C v mikrovlnnej rúre po dobu 10 minút. Následne boli opláchnuté 3x PBS pre každý a blokované 10% normálnom kozím sérom v PBS po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti 10 min. Sklíčka sa potom uvedie do reakcie s afinitnej purifikovaným králičie anti-TR6 Ab (1,67 g /ml) pri izbovej teplote po dobu 2 hodín. Po premytí bola sklíčka inkubovaná s biotinylizované kozie anti-králičie protilátkou po dobu 10 minút. Signál TR6 bolo odhalené streptavidín-peroxidázou pomocou DAB ako substrátu podľa pokynov z kitu Histostain-Plus (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). DcR3 signály boli odhalené v hnedej farbe. Nakoniec bola sklíčka boli kontrastne hematoxylínom a utesní sa vodným Montážne média (Zymed).
Štatistická analýza
Data bola prezentovaná ako priemer ± SD. Významnosť rozdielov medzi skupinami bola hodnotená Študentský dvojstranného t-testu. Pravdepodobnosť hodnota je nižšia ako 0,05 bola považovaná za významnú. Všetky prostriedky boli vypočítané z aspoň troch nezávislých experimentov.
Výsledky
pacientov s nádorovým ochorením majú zvýšené hladiny DcR3
Pre štúdium korelácia medzi DcR3 expresie a nádoru vzniku a vývoja, nádory z 50 pacientov s karcinómom žalúdka boli zhromaždené a testované pre DcR3 mRNA a nízka hladina bielkovín. Ako je znázornené na obrázku 1a, sa 921 bp DcR3 pásy boli generované pomocou RT-PCR z nádorového tkaniva väčšiny pacientov (36/50), v porovnaní s non-rakovinové tkanivá (2/50) z rovnakých orgánoch týchto pacientov. Tieto výsledky ukazujú, že hladiny DcR3 významne zvýšili (osem náhodne vybral klinických vzoriek sú uvedené na obrázku 1 a). Pre ďalšie potvrdenie našich výsledkov, hladiny DcR3 bielkoviny boli vyšetrené westernovým prenosom. Výsledky ukazujú, že DcR3 proteín nebol detegovaný u väčšiny pacientov s rakovinou; DcR3 proteín bol zistený u 74% (37/50) z nádorových tkanivách, ale iba v 6% (3/50) z non-rakovinové tkanivá (tabuľka 1 a obrázok 1b; osem náhodne vybral klinických vzoriek sú uvedené na obrázku 1b ). Obrázok 1 Expresia DcR3 v žalúdočnej rakoviny a non-rakovinové tkanivá analyzované pomocou RT-PCR (Figure1a) a westernovým prenosom (Figure1b). a: Lane M, DNA markery; lanes1-7, nádorové tkanivá; dráha 8, non-rakovinové tkanivá; DcR3 mRNA bola pozitívna v 36 z 50 nádorových tkanív (1-7) a negatívne v non-rakovinové tkanivá (8). b: lanes1-7, nádorové tkanivá; dráha 8, non-rakovinové tkanivá. DcR3 proteín bol pozitívny v 37 z 50 vzoriek nádorového tkaniva (1-7), ktoré iba 3 z 50 v non-rakovinové tkanivá (8).
Tabuľka 1 Analýza pacientov s karcinómom žalúdka s DcR3 a ERK1 /2 v expresii nádorové a normálne tkanivá
Puzdrá
kladné číslo
Pozitívne sadzba (%)
nádor
50
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
36
37
28
72,0
74,0 56,0

ERK1
37
42
36
74,0
84,0
72,0
P Hotel > 0.05
ERK2
32
37
27
64,0
74,0
54,0
Non-rakovinové
50
DcR3
2
3
0
4,0
6,0
0
ERK1
6
5
1
12,0
15,0
2,0
ERK2
9
10 Sims 3
18.0 20.0
6,0
Expresia ERK1 /2 v klinických vzorkách
pre identifikáciu signálnych molekúl spojených s DcR3, expresných hladín ERK1 /2, boli testované JNK a p38. Zistili sme, že iba ERK1 /2 by mohli byť detekované vo vzorkách nádorov (dáta nie sú ukázaná pre JNK a p38). ERK1 mRNA bola detekovaná u 74% vzoriek (37/50), a ERK2 mRNA bola detekovaná u 64% vzoriek (32/50; tabuľka 1 a obrázok 2a). Na úrovni proteínu, ERK1 bola detekovaná u 84% (42/50) a ERK2 v 74% (37/50) nádorových tkanív (tabuľka 1 a obrázok 2b). Tieto výsledky ukazujú, že u pacientov so žalúdočnými rakovinových nádorov majú vyššie ERK1 /2-pozitívna výskyt v porovnaní s non-rakovinové tkanivá (P
menšie ako 0,05). Bola pozitívna korelácia medzi mRNA a proteínu, ako je v 42 z 50 nádorového tkaniva na ERK1 na úrovni proteínov boli zvýšenie, z toho 36 prípadov bolo v súlade s mRNA expresie. Na rozdiel od toho expresie ERK1 proteín bol detekovaný iba v piatich normálneho tkaniva. Pri skúmaní ERK2, 37 z 50 prípadov nádorových tkanív boli pozitívne na expresiu proteínu ERK2, z toho 27 prípadov bolo v súlade s expresiou ERK2 mRNA, zatiaľ čo iba desať prípadoch boli pozitívne expresie proteínu v normálnych tkanivách. Osem náhodne vybral vzoriek sú uvedené na obrázku 2. Obrázok 2 Expresia ERK1 /2 v žalúdočnej rakoviny a non-rakovinové tkanivá analyzované pomocou RT-PCR (obrázok 2a) a westernovým prenosom (obr 2b). a: Lane M, DNA markery; lanes1-7, nádorové tkanivá; dráha 8, non-rakovinové tkanivá; ERK1 a ERK2 mRNA boli pozitívne v nádorových tkanivách. b :. ERK1 a ERK2 proteín boli pozitívne v nádorových tkanivách (1-8)
Umiestnenie ERK1 /2 u pacientov s karcinómom žalúdka
Pre zistenie ERK1 /2 distribúcie, nádory z 50 pacientov boli testované pomocou imunohistochémia. Výsledky ukazujú, že ERK1 /2 boli exprimované v nádorových tkanivách od väčšiny pacientov. ERK1 expresie bola nájdená v cytoplazme. ERK2 pozitívny expresie bola nájdená v niektorých nádorových bunkách (obrázok 3). Obrázok 3 Umiestnenie ERK1 /2 proteínu v žalúdočných rakovinových tkanivách analyzované imunohistochemicky. A: kontrola, B: ERK1, C :. ERK2
DcR3 a ERK1 úrovňou /2 koreluje s nádorovú inváziou, ale nie s vekom, pohlavím alebo diferenciácie
pozitívneho vplyvu DcR3 mRNA v nádorovom tkanive pacientov s karcinómom žalúdka bolo 72,0% (36/50), a DcR3 bielkovín 74,0% (37/50), ktorá bola výrazne vyššia ako v non-rakovinové tkanivá vykazujú iba 4% (2/50) a 6% (3/50), v uvedenom poradí ( P Hotel &0,05; tabuľka 1). Pozitívne výskyt výrazu ERK1 /2 mRNA bola 74,0% (37/50) a 64,0% (32/50), a expresie proteínov 84,0% (42/50) a 74,0% (37/50). Obe z nich boli výrazne vyššie ako non-rakovinové tkanivá, čo ukazuje 12,0% (6/50) a 18,0% (9/50), a 10,0% (5/50) a 20,0% (10/50), v danom poradí (tabuľka 1). Tieto výsledky naznačujú, že DcR3 a ERK1 /2 expresné hladiny koreluje s výskytom a vývoj nádoru.
Ako je uvedené v tabuľkách 2, 3 a 4, nebol zistený žiadny významný rozdiel medzi nádorového tkaniva z rôznych vekových kategórií, pohlavia a skupín pacientov s rôznymi diferenciácie štádia rakoviny žalúdka (P Hotel > 0,05). Avšak, DcR3 a ERK1 /2 expresné hladiny boli značne vysoká v TNM štádiu II-IV (tabuľka 5). To znamená, že výrazy DcR3 a ERK1 /2 koreluje s nádorovú inváziu a TNM štádiu, ale nie s vekom, pohlavím alebo differentiation.Table 2 korelácie expresie DcR3 a ERK1 /2 s vekom v onkologickí pacienti žalúdočnej
prípady
kladné číslo
Pozitívne sadzba (%)
≥50
32
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
25
28
21
78,1
87,5
65,6
ERK1
28
31
26
87,5
96,9
81,2
P Hotel > 0.05
ERK2
20
22
16
62,5
68,8
50,0 Hotel < 50
18
DcR3
11
9
5
61,1
50,0
27,8
Erk1
13
11
5
72,2
61,1
27,8
ERK2
12
15
6
66,7
83,3
33,3
Tabuľka 3 Korelácia expresie DcR3 a ERK1 /2 s pohlavím v onkologickí pacienti žalúdočnej
Puzdrá
kladné číslo
Pozitívne sadzba (%)
Male
39
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
29
29
24
74,4
74,4
61,5
Erk1
32
35
28
82,1
89,7
71,8
P Hotel > 0.05
ERK2
26
30
23
66,7
76,9
59,0
Žena
11
DcR3
7
8
5
63,6
72,7
45,6
ERK1
9
7
6
81,8
63,6
54,5
ERK2
6
7
4
54,6
63,6
36,4
Tabuľka 4 Korelácia expresie DcR3 a ERK1 /2 s diferenciáciou nádoru u pacientov s nádorovým ochorením žalúdočnej
Cases
Kladné číslo
Pozitívne sadzba (%)
No
9
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
7
7
5
77,8
77,8
55,6
ERK1
7
9
6
77,8
100,0
66,7
P Hotel > 0,05
ERK2
6
7
5
66,7
77,8
55,6
Mierne
28.
DcR3
21
23
20
75,0
82,1
71,4
Erk1
24
24
22
85,7
85,7
78,6
ERK2
19
24
17
67,9
85,7
60,7
Low
13
DcR3
8
7
5
61,5
53,9
38,5
Erk1
10
9
8
76,9
69,2
61,5
ERK2
7
6
5
53,9
46,2
38,5
Tabuľka 5 Korelácia expresie DcR3 a ERK1 /2 s patologickými fázach nádoru u pacientov s nádorovým ochorením žalúdočných
TNM štádiu
Cases

kladné číslo
Pozitívne sadzba (%)
Aj
6
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
1
1
1
16,7
16,7
16,7
ERK1
2
2
1
33,3
33,3
16,7
P Hotel > 0,05
ERK2
1
1
0
16,7
16,7
0,0
II
17
DcR3
12
13
10
70,6
76,5
58,8
Erk1
14
14
11
82,4
82,4
64,7
P
> 0,05
ERK2
10
12
9
58,8
70,6
52,9
III
25
DcR3
21
21
21
84,0
84,0
84,0
Erk1
23
24
22
92,0
96,0
88,0
P
> 0,05
ERK2
20
23
18
80,0
92,0
72,0
IV
2
DcR3
2
2
2
100,0 100,0
100,0
ERK1
2
2
2
100,0 100,0
100,0
P
> 0,05
ERK2
1
1
1
50,0
50,0
50.0
Hladiny expresie DcR3 a ERK1 /2 sú zosilnené na zvieracích modeloch
Ako je uvedené v tabuľke 6, po injekcii BGC823 buniek do pravého boku nahých myší, nádory narástli každý deň. RT-PCR bola použitá pre testovanie hladín DcR3 a ERK1 /2 mRNA v nádoroch a western blot analýzy bolo vyšetrených hladín proteínov. V žalúdočných modeloch rakoviny zvierat, DcR3, ERK1 a ERK2 boli detekované pri 921 bp, 300 bp a 400 bp, v danom poradí. V týchto nádorových tkanivách bol DcR3 mRNA detekovaná od Šiesty deň vyvrcholil v deň 10, a zostal detekované v deň 12. DcR3 bol tiež detekovaný z Šiesty deň sa do 12. dňa v pečeni, zatiaľ čo bolo zistené, iba v deň 12 na srdce a pľúc ( obrázok 4a). ERK1 /2 mRNA výrazy boli detekované od štvrtého dňa v nádorových tkanivách, a ERK1 mRNA kulminoval v deň 10 (Obrázok 4a a v tabuľke 7) .Table 6 Hmotnosť BGC823 tumoru u nahých myší (x ± s, n = 6)
skupina
Δ hmotnosť /mg
2 d
4d
6d
8d
10 d
12 d
Normal -
- -
- - -
Model
0. 47 ± 0. 17 △
0. 77 ± 0. 28 △
1. 01 ± 0. 39 △
1. 43 ± 0. 79 △
1. 65 ± 0. 68 △
1. 46 ± 0. 66 △
Poznámka: △ P Hotel < 0,01 vs
normálne; ** P Hotel < 0,01 vs
modelu.
Tabuľka 7 Expresia DcR3 a ERK1 /2 mRNA v nádorových tkanivách zvieracích modeloch analyzované pomocou RT-PCR

2d

4d

6d

8d

10d

12d

DcR3
—
—
+
+
++
++
ERK1
—
+
+
+
++
++
ERK2
—
+
+
+
+
+
Obrázok 4 Expresia DcR3 a ERK1 /2 v myšiach modeloch analyzované pomocou RT-PCR (obrázok 4a) a Western blot (obrázok 4b). a: Lane M, markeru DNA; lanes1-6, srdca, pečene, sleziny, pľúc, obličiek a nádorové tkanivá myšiach modeloch na štvrtý deň; lanes7-12, ktorý ôsmeho dňa; lanes13-18, dvanásteho dňa; ERK1 mRNA bola pozitívna v lane2,8,9,12,14,15,18, ERK2 mRNA bol pozitívny vo lane1,2,6,9,10,12,13,14,15,17,18. DcR3 mRNA bola detekovaná v lane8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 b: dráhe 1, srdce; lane2, pečeň; lane3, sleziny; lane4, pľúc; lane5, obličiek; lane6, nádorové tkanivá; Expresia ERK1 proteínu zvýšená v nádorových tkanivách, ako šiel čas, srdce, pečeň a obličky pretrvával po dobu 12 dní, expresia ERK2 by mohli byť detekované v slezine a nádoru od druhého dňa, ktorá bola pozitívna v nádorových tkanivách, až do štvrtého dňa a všetky z piatich orgánov do dvanásteho dňa. Expresia proteínu DcR3 bol pozitívny v nádorových tkanivách a pečeni na šiesty deň a v slezine desiatym dňom, ktorá bola negatívna na srdce, pľúc, obličiek až do dvanásteho dňa.
DcR3 proteín bol detekovaný na deň šesť v nádore tkaniva a pečene, a expresie zostala kým nebol detekovaný 12. DcR3 proteín v deň 10 v slezine a vo dne 12 v srdci, obličkách a pľúcach. ERK1 proteín bol detekovaný na štvrtý deň v nádorových tkanivách, a naďalej zvyšuje každý deň. ERK1 proteín zostal na stabilnej úrovni v srdci, pečeni a obličkách, ale klesla v pľúcach a slezine v deň 10, po dosiahnutí vrcholu. ERK2 bola zistená na deň dva v slezine a nádorových tkanivách. Od štvrtého dňa, ERK2 proteín bol detekovaný vo všetkých šiestich vzoriek, a naďalej zvyšovať až do dňa 12. Tieto výsledky ukazujú, že ERK1 a ERK2 môžu mať rôzne účinky na výskyt nádorov, vývoj a klonálnej expanzii.
DcR3 výraz poklesla po inhibíciu expresia alebo fosforylácie ERK1 /2 v bunkách BGC823
Pre skúmanie účinku ERK1 /2 expresie a fosforylácie na DcR3 expresiu, BGC823 boli bunky ošetrené ERK1 /2 zhrnie, alebo s inhibítory, ktoré špecificky regulujú EKR. Western blot analýza potvrdzuje, že inhibítory účinne blokovaný fosforylácii dráhy molekúl MEK /EQF, a že zhrnie významne znížil expresiu ERK1 /2 (obrázok 5). Ako je znázornené na obrázku 5A, kedy boli bunky BGC823 liečení ERK1 /2 zhrnie, ERK1 /2 a P-ERK1 /2 stupne znížil v porovnaní s kontrolou. Obrázok 5 Expresia ERK1 /2 a P-ERK1 /2 v bunkovej línii BGC823 s rušením plazmidu a inhibítor detekované pomocou Western blotting. a: Úrovne expresie ERK1 /2 a P-ERK1 /2 znížil v porovnaní s kontrolou. 1) kontrolná skupina; 2) 5: 2 (plazmid: činidlo); 3) 6: 2 (plazmid: činidlo). b: ERK1 /2 fosforylácie postupne klesal ako koncentráciách inhibítora U0126, PD98059 zvýšená, ale celková ERK1 /2 expresie proteínu takmer nezmenila. 1) 0 pmol /l; 2) 5 pmol /l; 3) 10 pmol /l; 4) 20 pmol /l; 5) 40 umol /L. c: ERK1 /2 fosforylácie postupne klesal ako koncentrácia inhibítora APDC. 1) 0 pmol /l; 2) 10 pmol /l; 3) 20 pmol /l; 4) 40 pmol /l; 5) 80 umol /L. d: PD98059 môžu samozrejme inhibovať úroveň MEK1 /2 fosforylácie, ale nemenil MEK1 /2 alebo NF-kB hladiny expresie. 1) 0 pmol /l; 2) 5 pmol /l; 3) 10 pmol /l; 4) 20 pmol /l; 5) 40 umol /L.
U0126 je veľmi účinný inhibítor MEK, čo vedie k inhibícii fosforylácie EKR, rovnako ako PD98059. K fosforylácii EKR postupne klesal ako koncentrácie liekov zvýšené, aj keď celková expresie ERK1 /2 proteín prakticky nezmenila (obrázok 5B).
APDC môžu inhibovať aktiváciu NF-kB buniek v rôznych buniek. Prostredníctvom degradácia IKB, APDC môže znížiť translokácii NF-kB, a tým blokuje aktiváciu NF-kB. Ako je znázornené na obrázku 5 ° C, za rôznych koncentrácií APDC zmene úrovne inhibícia NF-kB môže výrazne zmierňujú ERK1 /2 úrovne fosforylácie. Avšak, špecifický mechanizmus vyžaduje ďalšie skúmanie.
Skúmať účinok týchto inhibítorov a zhrnie na DcR3 prejavu sme použili ELISA analýzy, ktoré preukázali, že vylučovaný DcR3 v supernatante poklesla po rôznych možnostiach liečby (Obrázok 6). Štatistická analýza ukázala, že hladina DcR3 sekrécia boli významne odlišné medzi experimentálnej a kontrolnej skupiny (P Hotel &0,05). Ako je znázornené na obrázku 6, interferencia s ERK1 /2 v bunkách BGC823 viedli k zníženiu expresie DcR3 proteínu v porovnaní s kontrolnou skupinou. Tento trend sa zhoduje s EKR hladinu expresie na obrázku 5 a dokazuje, že dvaja sú pozitívne korelované. Okrem toho, DcR3 a P-EQF hladiny expresie znížená, pokiaľ bunky boli ošetrené rôznymi koncentráciami U0126, PD98059 a APDC. Tieto údaje naznačujú, že vylučovanie DcR3 pozitívne koreluje s P-ERK1 /2 podlažiach výraz v BGC823 žalúdočných bunkách. Stojí za zmienku, že v skupine U0126, hladiny DcR3 sekrécia zvyšuje, keď je koncentrácia liečiva dosiahla 40 pmol /l; Avšak, špecifický mechanizmus vyžaduje ďalšie vyšetrovanie. V skupine APDC hladiny DcR3 významne nemenila v koncentráciách vyšších ako 20 umol /l. Obrázok 6 Expresia proteínu DcR3 s presahom plazmidu a inhibítora analýzou ELISA. a: DcR3 hladiny expresie v BGC823 kultivačnom supernatantu sa znížila, keď boli bunky ošetrené rušenie ERK1 plazmidu. b: Úrovne DcR3 expresie znížená, pokiaľ boli bunky ošetrené rušenie ERK2 plazmidu. c: DcR3 hladiny expresie znížená, pokiaľ bunky boli ošetrené rôznymi koncentráciami U0126, PD98059 a APDC umol /l
Diskusia
Bolo preukázané, že gén je exprimovaný DcR3 na nízkej úrovni v ľudského embrya, pľúc ,. mozog, pečeň, slezina, žalúdok, hrubé črevo, lymfatických uzlín a miechy, vzhľadom k tomu, že bolo vyjadrené na vysokej úrovni v rakoviny, ako je rakovina gastrointestinálneho traktu, hepatocelulárneho karcinómu a karcinómu pankreasu [1, 12].
Wu et al.
[8] popísali, že expresia DcR3 u pacientov s rakovinou žalúdka bol podstatne vyšší, ako je obvyklé. DcR3 výraz v dobre diferencovaného karcinómu žalúdka bola významne nižšia ako u málo diferencovaných vzoriek (P
menšie ako 0,05).
Hladinu expresie DcR3 boli významne spojené s lymfatických uzlín a patologické fáze, ale nekoreluje s veľkosťou nádoru, metastázujúce stavu, alebo histologických typov. Kedy boli pacienti sledovaní po dobu 63 mesiacov, bolo zistené, DcR3 nadmerná expresia je spojená s výrazne skrátenou prežitia [13, 14].
Mnoho správy ukázali, že vysoké hladiny expresie ERK1 /2 v úzkej korelácii s prsníka, kolorektálny a rakovinu pankreasu, rovnako ako malígny melanóm, leukémia a Myxo [15-18].
Náš výskum ukázal, že u pacientov s rakovinou žalúdka, pozitívneho výskytu DcR3 a ERK1 /2 mRNA bola vyššia ako v non rakovinové tkanivá (P menšia ako 0,05). RT-PCR a western blot ukázala, že mRNA a expresie proteínu DcR3 a ERK1 /2 v nádorovom tkanive boli významne vyššie ako u non-rakovinové tkanive, čo naznačuje, že DcR3 a ERK1 úrovňou /2 koreluje s vývojom nádoru, ale nie s vekom , pohlavie alebo diferenciácie (P Hotel &0,05).
Naše výsledky ukázali, že pozitívny výskyt expresie DcR3 a ERK1 /2 mRNA a DcR3 a ERK1 /2 proteínu uzavreté medzi sebou. Výsledky imunohistochemické tiež preukázali, že v nádorov žalúdka, ERK1 /2 bol vysoko exprimovaný.
Chen et al.
[19] uviedli, že pozitívne miera DcR3 expresie bola 74,4% (32/43) u hepatocelulárneho karcinómu, a že existuje významná korelácia medzi expresiou DcR3 a metastázy, rovnako ako opakovanie a diferenciácie.
v myšiam modeli žalúdku, RT-PCR ukázala, že DcR3 mRNA by mohla byť detekovaná v nádoroch z Šiesty deň. ERK1 /2 mRNA a proteín sa zistili aj v nádoroch, a hladiny ERK1 v žalúdočných nádorov sa postupne zvyšuje. Okrem toho sa zistili aj v srdce, pečeň, slezina, pľúca a obličky žalúdočné modelu rakoviny zvierat, čo ukazuje, že majú dôležitú úlohu v progresii nádoru. ERK1 /2 mRNA bola detekovaná od štvrtého dňa v nádorových tkanivách, a ERK1 mRNA kulminoval v deň 10. ERK1 proteín by mohol byť zistený tiež štvrtý deň v nádorových tkanivách, a naďalej zvyšuje každý deň. ERK1 zostal na stabilnej úrovni v srdci, pečeni a obličkách, ale klesla v pľúcach a slezine v deň 10, po dosiahnutí vrcholu. ERK2 bola zistená na deň dva v slezine a nádorových tkanivách. Od štvrtého dňa, ERK2 bola detekovaná vo všetkých šiestich tkanivách, a naďalej zvyšovať až do dňa 12. ERK2 nemohli byť detekované v srdca, pľúc a sleziny pomocou RT-PCR v deň 12 na zvieracích modeloch, ale mohol by byť detekované hladiny proteínov. Tieto výsledky naznačujú, že ERK1 a ERK2 môžu mať rôzne účinky na výskyt nádorov, vývoj a klonálnej expanzii. Mnohé štúdie ukázali, že expresia ERK1 /2 mRNA a proteín sa líši v rôznych nádoroch a buniek [20, 21]. Niektoré nedávne správy navrhol, aby mohli byť úplne opačný v niektorých prípadoch. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• MicroRNA-206 potláča žalúdočnú rast rakovinových buniek a metastáz
• Optimálny režim trastuzumabu v kombinácii s oxaliplatinou /kapecitabínom v prvej línii liečby HER2-pozitívnych pokročilá rakovina žalúdka (CGOG1001): multicentrickej, štúdii fázy II