Importanza del recettore decoy 3 (Dcr3) ed esterna-segnale regolate chinasi 1/2 (ERK1 /2) in gastrica cancer

Importanza recettore decoy 3 (Dcr3) ed esterna-segnale regolate chinasi 1/2 (ERK1 /2) nel cancro gastrico
Abstract
sfondo
Decoy recettore 3 (DcR3), un membro del recettore del fattore di necrosi tumorale (TNFR) superfamiglia, è associato con soppressione di immunità anti-tumorale. E 'altamente espressa in molti tumori, e la sua espressione può essere regolata dal /MEK /ERK percorso di segnalazione MAPK. Il /MEK /ERK MAPK pathway è stato segnalato per essere un regolatore di comparsa del tumore, lo sviluppo e l'espansione clonale. -Segnale esterno chinasi regolata (ERK) è un membro importante di questo percorso.
Risultati
L'espressione di DcR3 e ERK1 /2 nei tessuti tumorali di pazienti affetti da cancro gastrico è stato significativamente più alto rispetto al gruppo non-cancerose (P
< 0,05). Non vi era alcuna differenza statistica tra i tessuti tumorali da pazienti con età diverse o genere, e anche di differenziazione diversi (P
> 0,05). Tuttavia, nei pazienti con stadio I cancro gastrico, il DcR3 e ERK1 /2 livelli erano significativamente più bassi rispetto ai pazienti con stadi più avanzati
. Conclusioni
DcR3 e ERK1 /2 svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo del cancro gastrico, e possono essere nuovi marcatori per indicare l'efficacia del trattamento del cancro gastrico in futuro.
Sfondo
Decoy recettore 3 (DcR3) è un membro del recettore del fattore di necrosi tumorale (TNFR) superfamiglia. Essa ha dimostrato di essere il recettore decoy per Fas ligando (FasL), LIGHT e TL1A [1-3], noto anche come TR6 [4]. DcR3 è per lo più espressa nelle cellule tumorali e inibisce competitivamente segnalazione del TNF. Sovraespressione di DcR3 nelle cellule tumorali li protegge da apoptosi. DcR3 protegge le cellule tumorali da sorveglianza immunitaria in quanto contribuisce alla soppressione dell'immunità ospite antitumorale.
DcR3 mRNA e di proteine ​​sono amplificati in vari tessuti maligni, come il cancro del polmone, cancro del colon, cancro gastrico, carcinoma esofageo, del pancreas cancro e melanoma maligno [1, 5, 6]. Wu et al.
[7] hanno riportato che DcR3 non può essere rilevato in pazienti non tumorali, ma potrebbe essere rilevato in 98,8% (82/83) dei pazienti con tumori maligni.
Questo fenomeno dimostra che l'elevata espressione DcR3 è significativamente correlata con la tumorigenesi e la progressione del tumore. Wu ed altri.
[8] ha riferito che DcR3 è stato altamente espresso nel carcinoma gastrico umano (GC), e positivamente correlata con lo sviluppo e la metastasi di lesioni gastriche. pazienti affetti da cancro gastrico con un'alta espressione DcR3 presentato una malattia pN2-3 più avanzata rispetto a quelli con una bassa espressione DcR3.
Il DcR3 per FasL può essere coinvolto nella progressione del cancro gastrico. Ulteriore valutazione dei possibili ruoli di DcR3 e la regolazione dell'espressione DcR3 nelle cellule maligne è molto importante per lo sviluppo di nuove strategie per il controllo della crescita delle cellule maligne che sfuggono alla sorveglianza immunitaria dell'ospite.
Nella fase iniziale, la MAPK /ERK attivato nei tumori, che è un segno notevole per molti tipi di tumori nell'uomo. Recentemente, diverse linee di prove ha suggerito che ERK potrebbe essere un parametro per predire la prognosi di vari tipi di cancro, come il cancro al seno, cancro del colon, cancro del pancreas e colangiocarcinoma. Wang et al.
[9] ha riferito che l'espressione di ERK1 /2 è stato elevato in colangiocarcinoma, che correlata con gli stadi TNM.
Kim et al.
[10] ha rilevato che LPS induceva rilascio DcR3 in umane intestinali cellule epiteliali (IEC), che sembrava essere attraverso l'attivazione di chinasi mitogeno-activated protein (MAPK), come extracellulare chinasi segnale regolate 1 e 2 (ERK1 /2) e proteina chinasi c-Jun NH2-terminale ( JNK). LPS-indotta DcR3 rilascio nelle cellule SW480 è stata abolita da inibitori JNK ERK1 /2 e. Inoltre, Yang et al.
[11] ha riferito che 3 g /ml DcR3 marcatamente indotto la fosforilazione di ERK e p38.
In accordo con questi rapporti, proponiamo che DcR3 e ERK1 /2 sono strettamente correlati. I geni DcR3 strettamente correlati con l'insorgenza e lo sviluppo di molti tipi di tumori. In questo studio abbiamo valutato il livello di espressione e la posizione del DcR3 e ERK1 /2 nei pazienti con cancro gastrico di diversa età, sesso, stadio e la differenziazione, per esplorare il rapporto tra DcR3 /ERK1 /2 e gastrica insorgenza del cancro e lo sviluppo. Inoltre, mettiamo a disposizione suggerimenti per la diagnosi clinica dei tumori gastrici.
Metodi
campioni clinici
tumori sono stati da pazienti affetti da cancro gastrico che sono stati sottoposti a biopsia endoscopica o operazioni curative in Zhongshan Hospital affiliato con Università di Xiamen. tessuti tumorali da cui il DNA e le proteine ​​sono stati isolati erano di esemplari freschi di resezione chirurgica. Tutti i campioni sono stati ottenuti con il consenso del paziente e l'approvazione della commissione medica etica di Zhongshan Hospital Università di Xiamen.
Topi
Tutti gli esperimenti sono stati effettuati utilizzando 6-8 settimane topi nudi maschili acquistati da un modello animale Research Center di Medical College Università di Xiamen. Tutti gli animali sono stati alloggiati in specifiche condizioni di libero patogeni con accesso costante all'acqua e chow. Tutte le procedure sperimentali sono state effettuate dopo l'approvazione del Comitato cura e l'uso di animali di Xiamen University.
Cultura cellulare
La linea di cellule di cancro gastrico umano BGC823 è stata mantenuta nel nostro laboratorio, che è stato coltivato in boccette con Modified Eagle di Dulbecco medium (DMEM) supplementato con siero fetale bovino 10% (FBS), e 1% di penicillina-streptomicina a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO2.
Reagenti
DMEM, FBS e penicillina-streptomicina sono stati acquistati da Hyclone Corporation (Utah, USA). Ematossilina-e-eosina (H & E) kit di analisi sono stati acquistati da CHEMICON® International, Inc. (Temecula, CA, USA). ERK1 /2 e DcR3 Abs sono stati acquistati dalla tecnologia Santa Cruz Bio. reagenti RT-RCR sono stati acquistati da Takara (Dalian, Cina). La sequenza di innesco è stato sintetizzato da Sangon (Shanghai, Cina).
In vivo modelli tumorali animali
I tumori sono stati generati in topi nudi maschili per via intramuscolare (im) iniezione di cellule BGC823 (1,0 × 105 cellule 100ul PBS) in il fianco destro. misurazioni tumorali sono stati convertiti in volume del tumore (V) dalla formula (L × W2 × 0,52), dove L e W sono la lunghezza e larghezza, rispettivamente. Le misurazioni sono state effettuate con un calibro a corsoio. Tutti i topi portatori di tumore sono stati divisi casualmente in gruppi (2 topi /gruppo).
RT-PCR e analisi Western blotting per l'esame l'espressione di DcR3 /ERK
RNA totale di DcR3 e ERK1 /2 è stato estratto da stimolata cellule utilizzando Trizol. Per misurare ERK /DcR3 numero di copie del gene, il DNA da campioni tumorali freschi è stato analizzato con RT-PCR. I primer a monte ea valle per ERK1 mRNA erano 5'-CCTGCTCATCAACACCACC-3 'e 5'-CGTAGCCACATACTCCGTCA-3', e per ERK2 mRNA erano 5'-TCTTCC AGCCCTCCTTCCTG-3 'e 5'-CGTTTCTGCGCCGTTAGGT-3'. I campioni sono stati denaturati a 95 ° C per 4 min, seguiti da 35 cicli di amplificazione (95 ° C, 45 sec; 55 ° C, 45 sec; e 72 ° C, 60 sec). I prodotti erano 300 bp e frammenti di 400 bp rispettivamente. Per DcR3 mRNA, il primer a monte era 5'- GCAAAGCCAAGGATTCCCCCTG -3 'e il primer a valle era 5'-GGCACTGCTCTGAGCTGGAGCTG-3'. I campioni sono stati denaturati a 95 ° C per 4 min, seguiti da 30 cicli di amplificazione (95 ° C, 45 sec; 55 ° C, 45 sec; e 72 ° C, 60 sec). Il prodotto era un frammento di 921 bp.
BGC823 cellule sono state raccolte e lisate in tampone di lisi cellulare (1% (v /v) Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM PMSF, 2 g /ml aprotinina, e 2 g /ml leupeptina) che potrebbe rilasciare DcR3 e ERK1 /2 proteine. Venticinque microgrammi di lisato totale era frazionate mediante SDS-PAGE e sottoposti ad analisi Western blotting utilizzando l'anti-ERK o anti-DcR3 monoclonale (clone 3 H5).
Western blotting e test ELISA per l'esame della espressione di DcR3 /ERK dopo il trattamento inibitori
BGC823 cellule sovranatanti sono stati raccolti a vari intervalli, e livelli di U0126, PD98059, APDC, MEK1 /2 e ERK1 /2 interferenze sono stati quantificati utilizzando kit commerciali ELISA, secondo le istruzioni del fornitore. Le cellule trattate con ERK1 /2 shRNA (5: 2, 6: 2), U0126 /PD98059 (0 mmol /L, 5 mmol /L, 10 micromol /L, 20 micromol /L, 40 mmol /L) e APDC (0 mmol /L, 10 mmol /L, 20 mmol /L, 40 mmol /L, 80 mmol /L), rispettivamente. Dopo una incubazione di 5 o 7 giorni, le cellule sono state sottoposte alle citochine come dosaggio indicato. Venticinque microgrammi di lisato totale era frazionate mediante SDS-PAGE e sottoposti ad analisi Western blotting utilizzando l'anti-ERK o anti-DcR3 monoclonale (clone 3 H5).
Analisi immunoistochimica per l'espressione di DcR3 e ERK1 /2
tessuti tumorali sono stati fissati in un mezzo formaldeide e inclusi in paraffina. Sezioni spessore 6 mm sono state montate su vetrini pretrattati con 0,1% di poli-L-lisina. Sono stati poi deparaffinaged in xy-lene, disidratati in etanolo assortite e imbevuto di 3% H 2O 2 per 10 minuti per eliminare l'attività della perossidasi endogena. Successivamente, i vetrini sono stati immersi in tampone citrato (pH 6,0) e bollito a 92-98 ° C in un forno a microonde per 10 min. Successivamente, sono stati risciacquati 3 volte con PBS per 10 minuti ciascuno e bloccati con il 10% di siero normale di capra in PBS per 1 ora a temperatura ambiente. I vetrini sono stati quindi fatti reagire con il coniglio purificato per affinità anti-TR6 Ab (1,67 g /ml) a temperatura ambiente per 2 ore. Dopo il lavaggio, i vetrini sono stati incubati con l'anticorpo di capra anti-coniglio biotinilato per 10 min. segnale TR6 è stata rivelata da streptavidina-perossidasi utilizzando DAB come substrato in base alle istruzioni del kit di Histostain-Plus (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). segnali DcR3 sono stati rivelati in marrone. Infine, i vetrini sono stati di contrasto con ematossilina e sigillati con acquosa mezzi di montaggio (Zymed).
Analisi statistica
dati sono stati presentati come media ± SD. La significatività della differenza tra i gruppi è stata valutata mediante Student`s due code t-test. valore di probabilità inferiore a 0.05 è stato considerato significativo. Tutti i mezzi sono stati calcolati da almeno tre esperimenti indipendenti.
Risultati
I malati di cancro hanno elevati livelli DcR3
Per studiare la correlazione tra DcR3 espressione e tumore comparsa e lo sviluppo, tumori da 50 pazienti affetti da cancro gastrico sono stati raccolti e testati per DcR3 mRNA e livelli di proteine. Come mostrato in Figura 1a, le bande DcR3 921 bp sono stati generati mediante RT-PCR dai tessuti tumorali maggior parte dei pazienti (36/50), rispetto ai tessuti non tumorali (2/50) dalle stessi organi di questi pazienti. Questi risultati dimostrano che i livelli DcR3 erano significativamente aumentati (otto campioni clinici prelevati a caso sono mostrati in Figura 1a). Per confermare ulteriormente i nostri risultati, i livelli di proteine ​​DcR3 sono stati esaminati mediante western blotting. I risultati dimostrano che le proteine ​​DcR3 potrebbe essere rilevato in molti pazienti oncologici; proteine ​​DcR3 è stata rilevata nel 74% (37/50) dei tessuti tumorali, ma solo nel 6% (3/50) dei tessuti non tumorali (Tabella 1 e Figura 1b; otto campioni clinici prelevati a caso sono mostrati nella Figura 1b ). Figura 1 L'espressione di DcR3 nel carcinoma gastrico e tessuti non tumorali analizzate mediante RT-PCR (Figure1a) e Western blotting (Figure1b). un: Corsia M, marcatori del DNA; lanes1-7, tessuti tumorali; corsia 8, tessuti non tumorali; DcR3 mRNA è stato positivo in 36 su 50 tessuti tumorali (1-7) e negativo in tessuti non tumorali (8). B: lanes1-7, tessuti tumorali; corsia 8, tessuti non tumorali. proteine ​​DcR3 è stato positivo in 37 su 50 campioni di tessuto tumorale (1-7), che solo 3 dei 50 in tessuti non-cancerose (8).
Tabella 1 Analisi dei pazienti affetti da cancro gastrico con DcR3 e ERK1 /2 espressione in tessuti tumorali e normali

casi
numero positivo
tasso positivo (%)
tumore
50
mRNA
proteine ​​
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
36
37
28
72,0
74,0
56.0
ERK1
37
42
36
74,0
84,0
72,0
P
> 0.05
ERK2
32
37
27
64,0
74,0
54,0
non cancerose
50
DcR3 2
3
0
4.0
6.0
0
ERK1
6
5
1 12.0
15,0
2.0
ERK2
9 10
3
18.0
20,0
6.0
Espressione di ERK1 /2 in campioni clinici
per identificare le molecole di segnalazione relative alla DcR3, i livelli di espressione di ERK1 /2, JNK e p38 sono stati testati. Abbiamo scoperto che poteva essere individuato solo ERK1 /2 in campioni di tumore (dati non mostrati per JNK e p38). ERK1 mRNA è stata rilevata nel 74% dei campioni (37/50), e ERK2 mRNA è stata rilevata nel 64% dei campioni (32/50; Tabella 1 e Figura 2a). A livello di proteine, ERK1 è stata rilevata nel 84% (42/50) e ERK2 nel 74% (37/50) dei tessuti tumorali (Tabella 1 e Figura 2b). Questi risultati indicano che i pazienti con tumori del cancro gastrico hanno una maggiore ERK1 /2-evento positivo rispetto ai tessuti non-cancerose (P
< 0,05). C'era una correlazione positiva tra i livelli di mRNA e di proteine, come in 42 dei 50 tumori tessuti ERK1 livello di proteina è stata elevata, di cui 36 casi sono stati coerenti con l'espressione di mRNA. In contrasto, l'espressione della proteina ERK1 è stata rilevata in cinque tessuti normali. Nell'esaminare ERK2, 37 dei 50 casi di tessuti tumorali sono risultati positivi per l'espressione della proteina ERK2, di cui 27 casi sono stati coerenti con l'espressione ERK2 mRNA, mentre solo dieci casi hanno mostrato l'espressione della proteina positivo nei tessuti normali. Gli otto campioni prelevati a caso sono mostrati in Figura 2. Figura 2 L'espressione di ERK1 /2 nel cancro gastrico e tessuti non tumorali analizzate mediante RT-PCR (figura 2a) e Western blotting (Figura 2b). un: Corsia M, marcatori del DNA; lanes1-7, tessuti tumorali; corsia 8, tessuti non tumorali; ERK1 e ERK2 mRNA sono risultati positivi nei tessuti tumorali. B:. ERK1 e proteine ​​ERK2 erano positivi nei tessuti tumorali (1-8)
Location di ERK1 /2 in pazienti affetti da cancro gastrico
Per esaminare ERK1 distribuzione /2, tumori da 50 pazienti sono stati esaminati con immunoistochimica. I risultati mostrano che ERK1 /2 sono stati espressi nei tessuti tumorali dalla maggior parte dei pazienti. espressione ERK1 è stato trovato nel citoplasma. ERK2 espressione positiva è stata trovata in alcune cellule tumorali (Figura 3). Figura 3 La posizione di proteine ​​ERK1 /2 nei tessuti di cancro gastrico analizzati mediante immunoistochimica. A: controllo, B: ERK1, C:. ERK2
DcR3 e ERK1 /2 livelli correlano con l'invasione del tumore, ma non con l'età, il sesso o la differenziazione
L'incidenza positiva di DcR3 mRNA nei tessuti tumorali di pazienti affetti da cancro gastrico è stato 72,0% (36/50), e di proteine ​​DcR3 74,0% (37/50), che era significativamente superiore nei tessuti non tumorali mostrano solo il 4% (2/50) e il 6% (3/50), rispettivamente ( P
< 0,05; Tabella 1). Il verificarsi positivo di espressione ERK1 /2 mRNA era 74,0% (37/50) e 64,0% (32/50), e di espressione della proteina 84,0% (42/50) e 74,0% (37/50). Entrambi erano significativamente più alti rispetto ai tessuti non tumorali, mostrando 12,0% (6/50) e il 18,0% (9/50), e il 10,0% (5/50) e il 20,0% (10/50), rispettivamente (Tabella 1). Questi risultati suggeriscono che i livelli DcR3 e ERK1 2 di espressione /correlati con insorgenza del tumore e lo sviluppo.
Come mostrato nelle tabelle 2, 3 e 4, non vi era alcuna differenza significativa tra tessuti tumorali provenienti da diverse età, gruppi di genere e pazienti con differenziazione diverso le fasi del cancro gastrico (P
> 0,05). Tuttavia, i livelli di espressione DcR3 e ERK1 /2 erano significativamente elevato in fase TNM II-IV (Tabella 5). Così, le espressioni di DcR3 e ERK1 /2 correlati con l'invasione del tumore e lo stadio TNM, ma non con l'età, il sesso o differentiation.Table 2 Correlazione di espressione di DcR3 e ERK1 /2 con l'età nel carcinoma gastrico pazienti
I casi
numero positivo
tasso positivo (%)
≥50
32
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
25
28
21
78,1
87,5
65,6
ERK1
28
31
26
87,5
96,9
81,2
P
> 0.05
ERK2
20
22
16
62,5
68,8
50,0
< 50 | 18
DcR3
11
9
5
61,1
50,0
27,8
ERK1
13
11
5
72,2
61,1
27,8
ERK2
12
15
6
66,7
83,3
33,3
Tabella 3 Correlazione di espressione di DcR3 e ERK1 /2 con il sesso nel carcinoma gastrico pazienti
Cases
numero positivo
tasso positivo (%)
Maschio
39
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
29
29
24
74,4
74,4
61,5
ERK1
32
35
28
82,1
89,7
71,8
P
> 0.05
ERK2
26
30
23
66,7
76,9
59,0
femminile
11
DcR3 7
8
5
63,6
72,7
45,6
ERK1
9 7
6
81,8
63,6
54,5
ERK2
6
7 4
54,6
63,6
36,4
Tabella 4 Correlazione di espressione di DcR3 e ERK1 /2 con differenziazione del tumore nel cancro gastrico pazienti
Casi
numero positivo
tasso positivo (%)
Bene
9
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
7 7
5
77,8
77,8
55,6
ERK1 7
9 Pagina 6
77,8
100,0
66,7
P
> 0.05
ERK2
6 7
5
66,7
77,8
55,6
moderatamente
28
DcR3
21
23
20
75,0
82,1
71,4
ERK1
24
24
22
85,7
85,7
78,6
ERK2
19
24
17
67,9
85,7
60,7
basso
13
DcR3
8 7
5
61,5
53,9
38,5
ERK1 10
9 Pagina 8
76,9
69,2
61,5
ERK2 7
6
5
53,9
46,2
38,5
Tabella 5 Correlazione di espressione di DcR3 e ERK1 /2 con fasi patologiche del tumore nel cancro gastrico pazienti
stadio TNM
Casi
numero
tasso positivo
positiva (%)
I
6
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
proteine ​​
+ /+
DcR3
1 1
1 16,7
16,7
16,7
ERK1 2
2
1
33,3
33,3
16,7
P
> 0.05
ERK2
1 1 0

16,7
16,7
0.0
II
17
DcR3
12
13
10
70,6
76,5
58,8
ERK1
14
14
11
82,4
82,4
64,7
P
> 0.05
ERK2 10
12
9
58,8
70,6
52,9
III
25
DcR3
21
21
21
84,0
84,0
84,0
ERK1
23
24
22
92,0
96,0
88,0
P
> 0.05
ERK2
20
23
18
80,0
92,0
72,0
IV 2
DcR3 2
2
2
100,0 100,0

100,0
ERK1 2
2 2
100,0 100,0

100,0
P
> 0.05
ERK2
1 1
1 50.0 50.0

50,0
livelli di espressione di DcR3 e ERK1 /2 sono amplificati in modelli animali
Come mostrato nella tabella 6, dopo l'iniezione di cellule BGC823 nel fianco destro di topi nudi, i tumori crescevano ogni giorno. RT-PCR è stato utilizzato per testare DcR3 e ERK1 /2 livelli di mRNA nei tumori e analisi western blot è stato utilizzato per esaminare i livelli di proteina. Nei modelli animali di cancro gastrico, DcR3, ERK1 e ERK2 sono stati rilevati a 921 bp, 300 bp e 400 bp rispettivamente. In questi tessuti tumorali DcR3 mRNA è stato rilevato dal primo giorno sei, ha raggiunto il picco il giorno 10, ed è rimasta rilevato il giorno 12. DcR3 è stato anche rilevato dal sesto giorno in giorno 12 nel fegato, mentre è stato rilevato solo il giorno 12 di cuore e polmone ( Figura 4a). espressioni ERK1 /2 mRNA sono stati rilevati dal giorno quattro nei tessuti tumorali, e ERK1 mRNA ha raggiunto il picco il giorno 10 (Figura 4a e la Tabella 7) .table 6 Peso del BGC823 tumore nel topo nudo (x ± s, n = 6)
Gruppo
Δ peso /mg
2 d
4d
6d
8d
10 d
12 d
normale -
- -
- Francia - -
Modello
0. 47 ± 0. 17 △
0. 77 ± 0. 28 △
1. 01 ± 0. 39 △
1. 43 ± 0. 79 △
1. 65 ± 0. 68 △
1. 46 ± 0. 66 △
Nota: △ P
< 0.01 vs
normale; ** P
< 0.01 vs
modello.
Tabella 7 Espressione di DcR3 e ERK1 /2 mRNA nei tessuti tumorali di modelli animali analizzati mediante RT-PCR

2d

4d

6d

8d

10d

12d

DcR3
—
—
+
+
++
++
ERK1
—
+
+
+
++
++
ERK2
—
+
+
+
+
+
Figura 4 L'espressione di DcR3 e ERK1 /2 in modelli murini analizzati mediante RT-PCR (Figura 4a) e Western blotting (Figura 4b). un: Corsia M, marcatore del DNA; lanes1-6 cuore, il fegato, milza, polmoni, reni e tessuti tumorali di modelli murini al quarto giorno; lanes7-12, che l'ottavo giorno; lanes13-18, il dodicesimo giorno; ERK1 mRNA è stato positivo in lane2,8,9,12,14,15,18, ERK2 mRNA è stato positivo in lane1,2,6,9,10,12,13,14,15,17,18. DcR3 mRNA è stato rilevato in lane8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. b: corsia 1, del cuore; lane2, fegato; lane3, milza; lane4, polmone; lane5, rene; lane6, tessuti tumorali; L'espressione di proteine ​​ERK1 maggiore nei tessuti tumorali, come il passare del tempo, nel cuore, fegato e reni persisteva per 12 giorni, l'espressione di ERK2 potrebbe essere rilevato in milza e del tumore dal secondo giorno che è stata positiva nei tessuti tumorali fino al quarto giorno e tutti i cinque organi al dodicesimo giorno. L'espressione della proteina DcR3 è stato positivo nei tessuti tumorali e il fegato al sesto giorno e nella milza il decimo giorno, che era negativo nel cuore, polmone, rene fino al dodicesimo giorno.
Proteine ​​DcR3 è stato rilevato il giorno sei di tumore tessuti e fegato, e l'espressione rimase fino è stato rilevato il giorno 12. proteine ​​DcR3 il giorno 10 nella milza e di giorno 12 nel cuore, reni e polmoni. proteine ​​ERK1 è stato rilevato il giorno quattro nei tessuti tumorali, e ha continuato ad aumentare ogni giorno. proteine ​​ERK1 è rimasto ad un livello stabile di cuore, fegato e reni, ma è diminuito nel polmone e della milza il giorno 10, dopo aver raggiunto il picco. ERK2 è stato rilevato il secondo giorno nei tessuti tumorali e della milza. Da quattro giorni, la proteina ERK2 è stato rilevato in tutti e sei i campioni, e ha continuato ad aumentare fino al giorno 12. Questi risultati suggeriscono che ERK1 e ERK2 potrebbero avere effetti diversi sulla comparsa del tumore, lo sviluppo e l'espansione clonale.
Espressione DcR3 diminuito dopo inibire la espressione o la fosforilazione di ERK1 /2 in BGC823 cellule
Per studiare l'effetto di ERK1 2 espressione e la fosforilazione /sull'espressione DcR3, BGC823 cellule sono state trattate con ERK1 /2 shRNA o con gli inibitori che regolano specificamente l'ERK. analisi Western blot ha confermato che gli inibitori efficacemente bloccato la fosforilazione delle molecole pathway MEK /ERK, e che la shRNA ridotto significativamente l'espressione di ERK1 /2 (figura 5). Come mostrato in Figura 5A, quando BGC823 cellule sono state trattate con ERK1 /2 shRNA, ERK1 /2 e P-ERK1 /2 livelli diminuiti rispetto al controllo. Figura 5 L'espressione di ERK1 /2 e P-ERK1 /2 nella linea cellulare BGC823 con interferenza plasmide e l'inibitore rilevato da Western blotting. R: I livelli di espressione di ERK1 /2 e P-ERK1 /2 in calo rispetto al controllo. 1) gruppo di controllo; 2) 5: 2 (plasmide: reattivo); 3) 6: 2 (plasmide: reagente). B: ERK1 /2 fosforilazione gradualmente diminuita come le concentrazioni del U0126 inibitore, PD98059 aumentato, ma l'espressione totale ERK1 /2 proteine ​​poco cambiato. 1) 0 micromol /L; 2) 5 micromol /L; 3) 10 micromol /L; 4) 20 micromol /L; 5) 40 mmol /L. C: ERK1 /2 fosforilazione gradualmente diminuita come le concentrazioni di inibitore APDC. 1) 0 micromol /L; 2) 10 micromol /L; 3) 20 micromol /L; 4) 40 micromol /L; 5) 80 micromol /L. D: PD98059 può ovviamente inibire il livello di fosforilazione MEK1 /2, ma non ha alterare i livelli di espressione MEK1 /2 o NF-kB. 1) 0 micromol /L; 2) 5 micromol /L; 3) 10 micromol /L; 4) 20 micromol /L; 5) 40 mmol /L.
U0126 è un inibitore MEK molto efficace, con conseguente inibizione della fosforilazione ERK, come fa PD98059. ERK fosforilazione gradualmente diminuita come le concentrazioni dei farmaci è aumentato, anche se l'espressione totale ERK1 2 proteine ​​/difficilmente cambia (Figura 5B).
APDC in grado di inibire l'attivazione delle cellule di NF-kB in una varietà di cellule. Attraverso la degradazione di IκB, APDC può diminuire la traslocazione di NF-kB, bloccando così l'attivazione di NF-kB. Come mostrato in Figura 5 C, sotto diverse concentrazioni di APDC, cambiando il livello di inibizione di NF-kB in grado di attenuare in modo significativo ERK1 /2 livelli di fosforilazione. Tuttavia, il meccanismo specifico richiede ulteriori indagini.
Per esaminare l'effetto di questi inibitori e shRNA sull'espressione DcR3 abbiamo utilizzato l'analisi ELISA, che ha dimostrato che secreto DcR3 nel surnatante diminuito dopo i diversi trattamenti (Figura 6). L'analisi statistica ha mostrato che i livelli di secrezione DcR3 erano significativamente differenti tra i gruppi sperimentali e gruppi di controllo (P
< 0,05). Come mostrato in figura 6, l'interferenza con ERK1 /2 in cellule BGC823 portato alla espressione della proteina DcR3 diminuita rispetto al gruppo di controllo. La tendenza corrisponde al livello di espressione di ERK in figura 5 e dimostra che i due sono correlati positivamente. Inoltre, DcR3 e P-ERK livelli di espressione sono diminuite quando le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di U0126, PD98059 e APDC. Questi dati indicano che la secrezione di DcR3 positivamente correlata con P-ERK1 /2 livelli di espressione in BGC823 cellule gastriche. Vale la pena notare che nel gruppo U0126, i livelli di secrezione DcR3 aumentati quando la concentrazione di farmaco ha raggiunto 40 micromol /L; Tuttavia, il meccanismo specifico richiede ulteriori indagini. Nel gruppo APDC, livelli DcR3 non sono cambiati in modo significativo a concentrazioni superiori a 20 micromol /L. Figura 6 L'espressione della proteina DcR3 con interferenza plasmid e inibitore mediante analisi ELISA. una: i livelli di espressione DcR3 in BGC823 cultura supernate diminuite quando le cellule sono state trattate con interferenze ERK1 plasmide. B: i livelli di espressione DcR3 diminuite quando le cellule sono state trattate con interferenze ERK2 plasmide. C: i livelli di espressione DcR3 diminuite quando le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di U0126, PD98059 e APDC micromol /L
Discussione
E 'stato dimostrato che il gene DcR3 si esprime ad un livello basso di embrione umano, polmone,. cervello, fegato, milza, stomaco, colon, linfonodi e nel midollo spinale, mentre è stato espresso ad un livello elevato di tumori come il cancro gastrointestinale, carcinoma epatocellulare e cancro al pancreas [1, 12].
Wu et al.
[8] ha riferito che l'espressione di DcR3 in pazienti affetti da cancro gastrico era significativamente più alta rispetto al normale. espressione DcR3 nel cancro gastrico ben differenziato era significativamente più bassa rispetto a quella dei campioni scarsamente differenziati (P ​​
< 0,05).
Il livello di espressione DcR3 era significativamente associato con metastasi linfonodali e stadio patologico, ma ha fatto si correla con dimensioni del tumore, lo stato metastatico o tipi istologici. Quando i pazienti sono stati seguiti per 63 mesi, DcR3 iperespressione è risultato essere associato a un tasso significativamente ridotta di sopravvivenza [13, 14].
Molti rapporti hanno dimostrato che livelli elevati di espressione di ERK1 /2 strettamente correlata con il seno, del colon-retto e il cancro al pancreas, così come il melanoma maligno, la leucemia e mixoma [15-18].
la nostra ricerca ha dimostrato che nei pazienti con cancro gastrico, l'incidenza positiva di DcR3 e ERK1 /2 mRNA era superiore a quello del mancato tessuti cancerosi (P < 0,05). RT-PCR e Western blotting hanno dimostrato che i livelli di mRNA e di espressione proteica di DcR3 e ERK1 /2 in tessuti tumorali erano significativamente più alti rispetto a quelli in tessuti non tumorali, suggerendo che DcR3 e ERK1 /2 livelli sono correlati con lo sviluppo del tumore, ma non con l'età , il sesso o la differenziazione (P
> 0,05).
I nostri risultati hanno dimostrato che l'incidenza positiva di espressione di DcR3 e ERK1 /2 mRNA e DcR3 e ERK1 2 proteine ​​/abbinati tra loro. I risultati di immunoistochimica hanno anche dimostrato che nei tumori gastrici, ERK1 /2 è stato altamente espresso.
Chen et al.
[19] ha riferito che il tasso positivo di espressione DcR3 era 74,4% (32/43) nel carcinoma epatocellulare, e che c'era una correlazione significativa tra l'espressione DcR3 e metastasi così come recidiva e la differenziazione.
nel modello gastrica del mouse, RT-PCR ha dimostrato che DcR3 mRNA potrebbe essere rilevato in tumori sin dal primo giorno sei. ERK1 /2 mRNA e di proteine ​​sono state rilevate anche nei tumori, e livelli di ERK1 gradualmente aumentata nei tumori gastrici. Inoltre, sono state rilevate anche in cuore, fegato, milza, polmone e rene del modello di cancro gastrico animali, suggerendo che hanno un ruolo importante nella progressione tumorale. ERK1 /2 mRNA è stato rilevato dal giorno quattro nei tessuti tumorali, e ERK1 mRNA ha raggiunto il picco nel giorno 10. proteine ​​ERK1 potrebbe essere rilevato anche il quarto giorno nei tessuti tumorali, e ha continuato ad aumentare ogni giorno. ERK1 è rimasto ad un livello stabile di cuore, fegato e reni, ma è diminuito nel polmone e della milza il giorno 10, dopo aver raggiunto il picco. ERK2 è stato rilevato il secondo giorno nei tessuti tumorali e della milza. Da quattro giorni, ERK2 è stato rilevato in tutti e sei i tessuti, e ha continuato ad aumentare fino al giorno 12. ERK2 non poteva essere rilevato nel cuore, polmone e della milza mediante RT-PCR il giorno 12 in modelli animali, ma i livelli di proteina potrebbe essere rilevato. Questi risultati suggeriscono che ERK1 e ERK2 potrebbero avere effetti diversi sulla comparsa del tumore, lo sviluppo e l'espansione clonale. Molti studi hanno indicato che l'espressione di ERK1 2 mRNA e proteine ​​/varia in diversi tumori e cellule [20, 21]. Alcuni rapporti recenti suggeriscono che potrebbe essere del tutto contrario in alcuni casi. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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