Betydningen av lokkefugl receptor 3 (Dcr3) og ekstern signalregulert kinase 1/2 (ERK1 /2) i magekreft

Betydningen av lokkefugl receptor 3 (Dcr3) og ekstern signalregulert kinase 1/2 (ERK1 /2) i magekreft
Abstract
Bakgrunn
Decoy receptor 3 (DcR3), et medlem av tumornekrosefaktor -reseptor (TNFR) superfamilien, er forbundet med anti-tumor-immunitet undertrykkelse. Det er sterkt uttrykt i mange tumorer, og dets ekspresjon kan reguleres ved den MAPK /MEK /ERK-signalveien. MAPK /MEK /ERK-reaksjonsveien er blitt rapportert å være en regulator i tumorforeteelse, utvikling og klonal ekspansjon. Ekstern-signal regulert kinase (ERK) er et viktig medlem av denne veien.
Resultater
uttrykk for DcR3 og ERK1 /2 i tumorvev av magekreftpasienter var betydelig høyere enn den ikke-kreft gruppen (P
< 0,05). Det var ingen statistisk forskjell mellom tumorvev fra pasienter med ulike aldre og kjønn, og til og med forskjellige differensiering (P
> 0,05). Men hos pasienter med stadium I magekreft, den DcR3 og ERK1 /2 plan var betydelig lavere enn pasienter med mer avanserte stadier
. Konklusjoner
DcR3 og ERK1 /2 spiller en viktig rolle i utviklingen av magekreft, og de kan være nye markører for å indikere effektiviteten av magekreft behandling i fremtiden.
Bakgrunn
Decoy receptor 3 (DcR3) er et medlem av tumornekrosefaktor-reseptor (TNFR) super. Det har vist seg å være lokkedue reseptor for Fas ligand (Fasl), LIGHT og TL1A [1-3], også kjent som TR6 [4]. DcR3 er mest uttrykt i tumorceller og kompetitivt hemmer TNF signalering. Overekspresjon av DcR3 i tumorceller beskytter dem mot apoptose. DcR3 beskytter tumor celler fra immunovervåkning som den bidrar til undertrykkelse av vertens antitumorimmunitet.
DcR3 mRNA og protein som blir forsterket i forskjellige ondartet vev, så som lungekreft, tykktarmskreft, magekreft, spiserørskreft, bukspyttkjertel cancer og ondartet melanom [1, 5, 6]. Wu et al.
[7] rapporterte at DcR3 ikke kunne påvises i ikke-tumorpasienter, men kunne påvises i 98,8% (82/83) av pasientene med ondartet kreft.
Dette fenomen viser at den forhøyede DcR3 uttrykk er signifikant korrelert med tumordannelse og tumorprogresjon. Wu et al. Product: [8] rapporterte at DcR3 ble sterkt uttrykt i menneskelig magekreft (GC), og positivt korrelert med utviklingen og metastaser av helsefare. Magekreft pasienter med høy DcR3 uttrykk presentert en mer avansert pN2-3 sykdom enn de med lav DcR3 uttrykk.
DcR3 for Fasl kan være involvert i utviklingen av magekreft. Videre evaluering av de mulige roller DcR3 og regulering av DcR3 ekspresjon i ondartede celler er meget viktig for utvikling av nye strategier for å kontrollere veksten av ondartede celler som unnslipper vertens immunovervåkning.
På et tidlig stadium, MAPK /ERK-veien aktivert i tumorer, noe som er en betydelig tegn for mange typer kreft hos mennesker. Nylig har flere linjer med bevis antydet at ERK kan være en parameter for å forutsi prognose av forskjellige kreftformer, slik som brystkreft, tykktarmskreft, kreft i bukspyttkjertel og kolangiokarsinom. Wang et al. Product: [9] rapportert at ekspresjon av ERK1 /2 var høy i kolangiokarsinom, noe som korrelerte med TNM etapper.
Kim et al.
[10] fant at LPS-indusert frigjøring i DcR3 humane intestinale epitelceller (IEC), som så ut til å være via aktivering av mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK), slik som ekstracellulære signalregulerte kinase 1 og 2 (ERK1 /2) og c-Jun NH2-terminale protein kinase ( JNK). LPS-indusert DcR3 utgivelsen i SW480 celler ble avskaffet ved ERK1 /2 og JNK-hemmere. Videre Yang et al.
[11] rapportert at 3 g /ml DcR3 markert indusert fosforylering av ERK og p38.
I overensstemmelse med disse rapportene, foreslår at DcR3 og ERK1 /2 er nært beslektet. De DcR3 gener korrelert med forekomst og utvikling av mange typer svulster. I denne studien undersøkte vi uttrykket nivå og plassering av DcR3 og ERK1 /2 i magekreftpasienter i ulike aldre, kjønn, scene og differensiering, for å utforske forholdet mellom DcR3 /ERK1 /2 og magekreft forekomst og utvikling. Videre gir vi forslag til klinisk diagnose av magekreft.
Metoder
kliniske prøver
Svulster var fra mage kreftpasienter som ble gjennomgått endoskopisk biopsi eller kurativ virksomhet i Zhongshan sykehus tilknyttet Xiamen universitet. Tumorvev som DNA og protein ble isolert var fra ferske eksemplar av reseksjon kirurgi. Alle prøvene ble oppnådd med pasientens samtykke og godkjenning av komité for medisinsk etikk av Zhongshan Hospital Xiamen University.
Mus
Alle forsøkene ble utført ved hjelp av 6-8 uker mannlige naken mus kjøpt fra Model Animal Research Center of Medical College Xiamen University. Alle dyrene ble holdt under spesifikke patogen frie betingelser med konstant tilgang til vann og chow. Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført etter godkjenning av Animal Care og bruk komité Xiamen University.
Cell kultur
human magekreft cellelinje BGC823 ble opprettholdt i vårt laboratorium, som var dyrket i kolber med Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS), og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2.
Reagenser
DMEM, FBS og penicillin-streptomycin ble kjøpt fra Hyclone Corporation (Utah, USA). Hematoxylin-og-eosin (H &Co. E) analysesett ble kjøpt fra Chemicon International, Inc (Temecula, CA, USA). ERK1 /2 og DcR3 Abs ble kjøpt fra Santa Cruz Bio-teknologi. RT-RCR reagenser ble kjøpt fra Takara (Dalian, Kina). Primersekvensen ble syntetisert fra Sangon (Shanghai, Kina).
In vivo dyretumormodeller
Svulster ble generert i mannlige naken mus ved intramuskulær (im) injeksjon av BGC823 celler (1,0 x 105 celler i 100 ul PBS) inn den høyre flanke. Tumormålinger ble omdannet til tumorvolum (V) med formelen (L x W2 x 0,52), hvor L og W er lengden og bredden, henholdsvis. Målinger ble gjort med en verniercaliper. Alle tumorbærende mus ble tilfeldig fordelt i grupper (2 mus /gruppe).
RT-PCR og Western blotting-analyse for å undersøke uttrykket av DcR3 /ERK
Total RNA av DcR3 og ERK1 /2 ble hentet fra stimulert celler ved hjelp Trizol. For å måle ERK /DcR3 genkopitallet, DNA fra ferske tumorprøver ble analysert med RT-PCR. Oppstrøms og nedstrøms primere til ERK1 mRNA var 5'-CCTGCTCATCAACACCACC-3 'og 5'-CGTAGCCACATACTCCGTCA-3', og for ERK2 mRNA var 5'-TCTTCC AGCCCTCCTTCCTG-3 'og 5'-CGTTTCTGCGCCGTTAGGT-3'. Prøvene ble denaturert ved 95 ° C i 4 minutter, etterfulgt av 35 amplifikasjonssykluser (95 ° C, 45 sekunder; 55 ° C, 45 sekunder; og 72 ° C, 60 sek). Produktene var 300 bp og 400 bp-fragmenter respektivt. For DcR3 mRNA, oppstrømsprimeren var 5'-GCAAAGCCAAGGATTCCCCCTG -3 'og nedstrømsprimeren var 5'-GGCACTGCTCTGAGCTGGAGCTG-3'. Prøvene ble denaturert ved 95 ° C i 4 minutter, etterfulgt av 30 amplifikasjonssykluser (95 ° C, 45 sekunder; 55 ° C, 45 sekunder; og 72 ° C, 60 sek). Produktet var en 921-bp-fragmentet.
BGC823-celler ble høstet og lysert i cellelyseringsbuffer (1% (v /v) Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM PMSF, 2 g /ml aprotinin, og 2 g /ml leupeptin) som kan frigjøre DcR3 og ERK1 /2-proteiner. Tjuefem mikrogram av total lysat ble fraksjonert ved hjelp av SDS-PAGE og underkastet Western blotting-analyse ved å bruke anti-ERK eller anti-DcR3 mAb (klon 3 H5).
Western blotting og ELISA-analyse for å undersøke ekspresjon av DcR3 /ERK etter hemmere behandling
BGC823 celler kultursupernatanter ble samlet på ulike intervaller, og nivåene av U0126, PD98059, APDC, MEK1 /2 og ERK1 /2 interferenser ble kvantifisert ved hjelp av kommersielle ELISA kits, i henhold til leverandørens anvisninger. Celler ble behandlet med ERK1 /2 shRNA (5: 2, 6: 2), U0126 /PD98059 (0 umol /l, 5 umol /L, 10 pmol /l, 20 umol /L, 40 pmol /l) og APDC (0 umol /L, 10 pmol /l, 20 umol /L, 40 pmol /L, 80 pmol /L), respektivt. Etter at en 5- eller 7-dagers inkubasjon ble cellene utsatt for cytokiner som indikerte analysen. Tjuefem mikrogram av total lysat ble fraksjonert ved hjelp av SDS-PAGE og underkastet Western blotting-analyse ved å bruke anti-ERK eller anti-DcR3 mAb (klon 3 H5).
Immunhistokjemi analyse for ekspresjon av DcR3 og ERK1 /2
tumorvev ble løst i en formaldehyd medium og i parafin. Delene 6 mm ble montert på objektglass forbehandlet med 0,1% poly-L-lysin. De ble deretter deparaffinaged i xy-lene, dehydrert i gradert etanol og dynket i 3% H 2o 2 i 10 min å eliminere endogen peroksidase aktivitet. Deretter ble platene nedsenket i citrat-buffer (pH 6,0) og kokes ved 92-98 ° C i en mikrobølgeovn i 10 min. Deretter ble de skylt 3 ganger med PBS i 10 minutter hver, og blokkert med 10% normalt geiteserum i PBS i 1 time ved romtemperatur. Glassene ble deretter omsatt med affinitets-rensede kanin anti-TR6 Ab (1,67 g /ml) ved romtemperatur i 2 timer. Etter vasking ble platene inkubert med biotinylert geit-anti-kanin-antistoff i 10 min. TR6 signal ble avslørt av streptavidin-peroksidase bruker DAB som et substrat i henhold til instruks fra Histostain-Plus kit (Zymed Laboratories, South San Francisco, California). DcR3 signaler ble avslørt i brunt. Til slutt ble platene motfarget med hematoksylin og forseglet med vandig Monterings Media (Zymed).
Statistisk analyse
Resultatene ble angitt som middelverdi ± SD. Signifikansen av forskjellen mellom gruppene ble bestemt ved studentens to-halet t-test. Sannsynlighetsverdi på mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant. Alle midler ble beregnet ut fra minst tre uavhengige eksperimenter.
Resultater
Kreftpasienter har forhøyet DcR3 nivåer
For å studere sammenhengen mellom DcR3 uttrykk og svulst forekomst og utvikling, ble svulster fra 50 mage kreftpasienter samlet inn og testet for DcR3 mRNA og proteinnivåer. Som vist i figur 1a, ble 921 bp DcR3 bånd generert ved RT-PCR fra tumorvev i de fleste pasienter (36/50), sammenlignet med de ikke-cancervev (2/50) fra de samme organer i disse pasientene. Disse resultater viser at DcR3 nivåene var signifikant øket (åtte tilfeldig plukket kliniske prøver er vist i Figur 1a). For ytterligere å bekrefte våre resultater ble DcR3 protein nivåer undersøkt av western blotting. Resultatene viser at DcR3 protein kunne påvises i de fleste kreftpasienter; DcR3 protein ble påvist i 74% (37/50) av tumorvevet, men bare i 6% (3/50) av de ikke-cancerøse vev (tabell 1 og figur 1 b, åtte tilfeldig plukket kliniske prøver er vist i figur 1b ). Figur 1 Ekspresjon av DcR3 i magekreft og ikke-cancervev analysert ved RT-PCR (Figure1a) og Western blotting (Figure1b). a: Lane M, DNA-markører; lanes1-7, tumorvev; lane 8, ikke-cancerøse vev; DcR3 mRNA var positiv i 36 av 50 tumorvev (1-7) og negativ i ikke-cancervev (8). b: lanes1-7, tumorvev; lane 8, ikke-cancervev. DcR3 protein var positiv i 37 av 50 prøver av tumor-vev (1-7), hvor kun tre av 50 i ikke-cancervev (8).
Tabell 1 Analyse av magekreftpasienter med DcR3 og ERK1 /2-ekspresjon i tumor og normalt vev Book Cases
Positive tall
Positive rate (%)
tumor
50
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
36
37
28
72,0
74,0
56,0
ERK1
37
42
36
74,0
84,0
72,0
P
> 0,05
ERK2
32
37
27
64,0
74,0
54,0
Non-kreft
50
DcR3
2
3
0
4,0
6,0
0
ERK1
6
5
1 12,0
15,0
2.0
ERK2
9
10
3
18,0
20,0
6,0
uttrykk for ERK1 /2 i kliniske prøver
å identifisere signalmolekyler knyttet til DcR3 uttrykket nivåer av ERK1 /2, ble JNK og p38 testet. Vi fant at bare ERK1 /2 kunne påvises i tumorprøver (data ikke vist for JNK og p38). ERK1 mRNA ble påvist i 74% av prøvene (37/50), og ERK2 mRNA ble påvist i 64% av prøvene (32/50; tabell 1 og figur 2a). På proteinnivå, ble ERK1 påvist i 84% (42/50) og ERK2 i 74% (37/50) av tumorvev (tabell 1 og figur 2B). Disse resultatene tyder på at pasienter med magekreftsvulster har en høyere ERK1 /2-positive forekomsten, sammenlignet med de ikke-cancervev (P
< 0,05). Det var en positiv korrelasjon mellom mRNA og proteinnivåene, som i 42 av 50 tumorvev den ERK1 proteinnivå ble hevet, av hvilke 36 tilfeller var konsistent med den mRNA-ekspresjon. I motsetning til dette ble ERK1 protein ekspresjon bare detektert i fem normale vev. Når behandlingen ERK2, 37 av 50 tilfeller av tumorvev var positive for ERK2 protein ekspresjon, av hvilke 27 tilfeller var konsistent med den ERK2 mRNA-ekspresjon, mens bare ti tilfeller viste positiv protein ekspresjon i normalt vev. De åtte tilfeldig plukket prøvene er vist i figur 2. Figur 2 Ekspresjon av ERK1 /2 i magekreft og ikke-cancervev analysert ved RT-PCR (figur 2a) og Western blotting (figur 2b). a: Lane M, DNA-markører; lanes1-7, tumorvev; lane 8, ikke-cancerøse vev; ERK1 og ERK2 mRNA var positive i tumorvev. b. ERK1 og ERK2 protein var positive i tumorvev (1-8)
Plassering av ERK1 /2 i magekreftpasienter
å undersøke ERK1 /2 distribusjon, ble svulster fra 50 pasienter testet av immunhistokjemi. Resultatene viser at ERK1 /2 ble uttrykt i tumor-vev fra de fleste av pasientene. ERK1 ekspresjon ble funnet i cytoplasma. ERK2 positiv ekspresjon ble funnet i noen tumorceller (figur 3). Figur 3 Plasseringen av ERK1 /2 protein i magekreft vev analysert ved immunhistokjemi. A: Kontroll, B: ERK1, C:. ERK2
DcR3 og ERK1 /2 nivåer korrelerer med tumorinvasjon, men ikke med alder, kjønn eller differensiering
positive forekomsten av DcR3 mRNA i tumorvev av magekreftpasienter var henholdsvis 72,0% (36/50), og av DcR3 protein 74,0% (37/50), som var signifikant høyere enn i ikke-cancervev som viser bare 4% (2/50) og 6% (3/50), ( P
< 0,05, tabell 1). Den positive forekomsten av ERK1 /2-mRNA-ekspresjon var 74,0% (37/50) og 64,0% (32/50), og protein ekspresjon 84,0% (42/50) og 74,0% (37/50). Begge var betydelig høyere enn de ikke-cancervev, som viser 12,0% (6/50) og 18,0% (9/50), og 10,0% (5/50) og 20,0% (10/50), henholdsvis (tabell 1). Disse resultatene tyder på at DcR3 og ERK1 /2 ekspresjonsnivåer korrelert med tumor forekomst og utvikling.
Som vist i tabellene 2, 3 og 4, var det ingen signifikant forskjell mellom tumorvev fra ulik alder, kjønn grupper og pasienter med forskjellig differensiering stadier av magekreft (P
> 0,05). Imidlertid DcR3 og ERK1 /2 ekspresjonsnivåer var signifikant høy i TNM stadium II-IV (tabell 5). Dermed uttrykk for DcR3 og ERK1 /2 korrelert med tumorinvasjon og TNM stadium, men ikke med alder, kjønn eller differentiation.Table 2 Korrelasjonen av uttrykk for DcR3 og ERK1 /2 med alder i mage kreftpasienter
tilfeller
Positive tall
Positive rate (%)
≥50
32
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
25
28
21
78,1
87,5
65,6
ERK1
28
31
26
87,5
96,9
81,2
P
> 0,05
ERK2
20
22
16
62,5
68,8
50,0
< 50
18
DcR3
11
9
5
61,1
50,0
27,8
ERK1
13
11
5
72,2
61,1
27,8
ERK2
12
15
6
66,7
83,3
33,3
Tabell 3 Korrelasjon av uttrykk for DcR3 og ERK1 /2 med kjønn i mage kreftpasienter
Cases
Positive tall
Positive rate (%)
Mann fra 39
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
29
29
24
74,4
74,4
61,5
ERK1
32
35
28
82,1
89,7
71,8
P
> 0,05
ERK2
26
30
23
66,7
76,9
59,0
Kvinne
11
DcR3
7
8
5
63,6
72,7
45,6
ERK1
9
7
6
81,8
63,6
54,5
ERK2
6
7
4
54,6
63,6
36,4
Tabell 4 Korrelasjonen av uttrykk for DcR3 og ERK1 /2 med tumor differensiering i magekreftpasienter
Cases <.no> Positive tall
Positive rate (%)
Vel
9
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
7
7
5
77,8
77,8
55,6
ERK1
7
9
6
77,8
100,0
66,7
P
> 0,05
ERK2
6
7
5
66,7
77,8
55,6
Moderat
28
DcR3
21
23
20
75,0
82,1
71,4
ERK1
24
24
22
85,7
85,7
78,6
ERK2
19
24
17
67,9
85,7
60,7
lav
13
DcR3
8
7
5
61,5
53,9
38,5
ERK1
10
9
8
76,9
69,2
61,5
ERK2
7
6
5
53,9
46,2
38,5
Tabell 5 Korrelasjonen av uttrykk for DcR3 og ERK1 /2 med patologiske stadier av svulst i mage kreftpasienter
TNM stadium
Cases

Positive tall
Positive rate (%)
jeg
6
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
1 1
1 16,7
16,7
16,7
ERK1
2
2
1
33,3
33,3
16,7
P
> 0,05
ERK2
en
1 0
16,7
16,7
0,0
II
17
DcR3
12
13
10
70,6
76,5
58,8
ERK1
14
14
11
82,4
82,4
64,7
P
> 0,05
ERK2
10
12
9
58,8
70,6
52,9
III
25
DcR3
21
21
21
84,0
84,0
84,0
ERK1
23
24
22
92,0
96,0
88,0
P
> 0,05
ERK2
20
23
18
80,0
92,0
72,0
IV
2
DcR3
2
2
2
100,0
100,0
100,0
ERK1
2
2
2
100,0
100,0
100,0
P
> 0,05
ERK2
1 1
1 50.0
50,0
50,0
Expression nivåer av DcR3 og ERK1 /2 blir forsterket i dyremodeller
Som vist i tabell 6, etter injisering BGC823 celler inn i den høyre flanken til nakne mus, tumorene vokste hver dag. RT-PCR ble anvendt for å teste DcR3 og ERK1 /2-mRNA-nivåer i tumorer og western blot-analyse ble brukt for å undersøke protein nivåer. I magekreft dyremodeller, ble DcR3, ERK1 og ERK2 oppdages på 921 bp, 300 bp og 400 bp, henholdsvis. I disse tumorvev ble DcR3 mRNA oppdaget fra dag seks, toppet seg på dag 10, og forble oppdaget på dag 12. DcR3 ble også påvist fra dag seks til dag 12 i leveren, mens det bare ble oppdaget på dag 12 i hjerte og lunge ( Figur 4a). ERK1 /2 mRNA uttrykk ble detektert fra dag fire i tumorvev, og ERK1 mRNA nådde en topp på dag 10 (figur 4a og tabell 7) .table 6 Vekt av BGC823 tumor i nakne mus (x ± s, n = 6)
Gruppe
Δ vekt /mg
2 d
4d
6d
8d
10 d
12 d
Normal -
- -
- -
-
Modell
0. 47 ± 0. 17 △
0. 77 ± 0. 28 △
1. 01 ± 0. 39 △
1. 43 ± 0. 79 △
1. 65 ± 0. 68 △
1. 46 ± 0. 66 △
Merk: △ P
< 0,01 vs
normal; ** P
< 0,01 vs
modell.
Tabell 7 Expression of DcR3 og ERK1 /2 mRNA i tumorvev av dyremodeller analysert ved RT-PCR

2d

4d

6d

8d

10d

12d

DcR3
—
—
+
+
++
++
ERK1
—
+
+
+
++
++
ERK2
—
+
+
+
+
+
Figur 4 Ekspresjon av DcR3 og ERK1 /2 i musemodeller analysert ved RT-PCR (figur 4a) og Western blotting (figur 4b). a: Lane M, DNA markør; lanes1-6, hjerter, lever, milt, lunger, nyrer og tumorvev av musemodeller på den fjerde dagen; lanes7-12, som på den åttende dag, lanes13-18, på den tolvte dagen; ERK1 mRNA var positiv i lane2,8,9,12,14,15,18, var ERK2 mRNA positiv i lane1,2,6,9,10,12,13,14,15,17,18. DcR3 mRNA ble påvist i lane8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. b: felt 1, hjerte; lane2, leveren; Lane3, milt; lane4, lunge; lane5, nyre; lane6, tumorvev; Ekspresjonen av ERK1 protein økte i tumorvev som tiden gikk, i hjerte, lever og nyre varte i 12 dager, kunne ekspresjonen av ERK2 bli detektert i milt og tumor fra den andre dagen som var positive i tumorvev, inntil den fjerde dagen og alle fem organer til tolvte dag. Uttrykket av DcR3 protein var positiv i tumorvev og lever på den sjette dagen, og i milten på den tiende dagen, som var negativ i hjerte, lunge, nyre til den tolvte dagen.
DcR3 protein ble oppdaget på dag seks i tumor vev og lever, og uttrykket forble frem til dag 12. DcR3 protein ble oppdaget på dag 10 i milten og dag 12 i hjerte, nyre og lunge. ERK1 protein ble oppdaget på dag fire i tumorvev, og fortsatte å øke hver dag. ERK1 protein holdt seg på et stabilt nivå i hjerte, lever og nyre, men det sank i lunge og milt på dag 10, etter å ha nådd toppen. ERK2 ble oppdaget på dag to i milt og tumorvev. Fra dag fire, ble ERK2 protein påvist i alle seks prøver, og fortsatte å øke til dag 12. Disse resultatene tyder på at ERK1 og ERK2 kan ha ulik effekt på tumor forekomst, utvikling og klonal ekspansjon.
DcR3 uttrykk sank etter å hemme ekspresjon eller fosforylering av ERK1 /2 i BGC823 celler
for å undersøke effekten av ERK1 /2 ekspresjon og fosforylering på DcR3 ekspresjon, ble BGC823 celler behandlet med ERK1 /2 shRNA eller med inhibitorer som spesifikt regulerer ERK-reaksjonsveien. Western blot-analyse bekreftet at inhibitorene effektivt blokkert fosforyleringen av MEK /ERK sti-molekyler, og at shRNA betydelig redusert ekspresjon av ERK1 /2 (figur 5). Som vist i figur 5A, når BGC823-celler ble behandlet med ERK1 /2 shRNA, ERK1 /2 og P-ERK1 /2 nivåer redusert i forhold til kontrollen. Figur 5 Ekspresjon av ERK1 /2 og P-ERK1 /2 i BGC823 cellelinje med plasmid forstyrrelser og inhibitor påvist ved Western blotting. a: Uttrykket nivåene av ERK1 /2 og P-ERK1 /2 redusert i forhold til kontrollen. 1) kontrollgruppe; 2) 5: 2 (plasmid:-reagens); 3) 6: 2 (plasmid: reagens). b: ERK1 /2 fosforylering gradvis redusert som konsentrasjonene av inhibitoren U0126, økt PD98059, men total ERK1 /2-protein ekspresjon nesten ikke forandret. 1) 0 mikromol /l; 2) 5 umol /l; 3) 10 ^ mol /l; 4) 20 umol /l; 5) 40 umol /L. c: ERK1 /2 fosforylering gradvis redusert som konsentrasjonene av inhibitoren APDC. 1) 0 mikromol /l; 2) 10 umol /l; 3) 20 ^ mol /l; 4) 40 ^ mol /l; 5) 80 umol /l. d: PD98059 kan selvsagt hemme MEK1 /2 fosforylering nivå, men det endret ikke MEK1 /2 eller NF-kB uttrykk nivåer. 1) 0 mikromol /l; 2) 5 umol /l; 3) 10 ^ mol /l; 4) 20 umol /l; 5) 40 umol /l.
U0126 er en meget effektiv MEK-inhibitor, som resulterer i hemning av ERK-fosforylering, som gjør PD98059. ERK-fosforylering gradvis nedover som konsentrasjonene av medikamentene økte, selv om total ERK1 /2-protein ekspresjon nesten ikke endres (figur 5B).
APDC kan inhibere NF-kB celleaktivering i en rekke celler. Ved nedbrytningen av IkB, kan APDC redusere translokasjon av NF-kB, og dermed blokkerer NF-kB-aktivering. Som vist i figur 5 C, under forskjellige konsentrasjoner av APDC, å endre nivået av NF-kB-inhibering i betydelig grad kan svekke ERK1 /2 fosforylering nivåer. Imidlertid krever den spesifikke mekanismen videre undersøkelser.
For å undersøke effekten av disse inhibitorer og shRNA på DcR3 uttrykk vi brukte ELISA-analyse, som viste at utskilt DcR3 i supernatanten ble redusert etter de forskjellige behandlinger (figur 6). Statistisk analyse viste at DcR3 sekresjon nivåene var signifikant forskjellig mellom eksperimentgruppene og kontrollgruppene (P
< 0,05). Som vist i figur 6, interferens med ERK1 /2 i BGC823 celler førte til redusert DcR3 protein ekspresjon sammenlignet med kontrollgruppen. Trenden samsvarer med ERK-ekspresjonsnivået i figur 5, og viser at de to er positivt korrelert. Videre DcR3 og P-ERK-ekspresjonsnivåer ble redusert når cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av U0126, PD98059 og APDC. Disse data indikerer at utskillelsen av DcR3 positivt korrelert med P-ERK1 /2 uttrykk nivåer i BGC823 gastriske celler. Det er verdt å merke seg at i U0126 gruppen, DcR3 sekresjon nivåene økte når legemiddelkonsentrasjonen nådd 40 mikromol /l; krever imidlertid den spesifikke mekanismen videre undersøkelser. I APDC gruppen, gjorde DcR3 nivåer ikke endres vesentlig i konsentrasjoner høyere enn 20 pmol /L. Figur 6 Ekspresjon av DcR3 protein med plasmid forstyrrelser og inhibitor ved hjelp av ELISA-analyse. a: DcR3 uttrykk nivåer i BGC823 kultur supernatanten redusert når cellene ble behandlet med ERK1 forstyrrelser plasmid. b: DcR3 uttrykk nivåer redusert når cellene ble behandlet med ERK2 forstyrrelser plasmid. c: DcR3 ekspresjonsnivåer redusert når cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av U0126, PD98059 og APDC umol /L Diskusjon
Det har blitt demonstrert at DcR3-genet uttrykkes på et lavt nivå i humant embryo, lunge,. hjerne, lever, milt, mage, kolon, lymfeknuter og ryggmargen, mens den ble uttrykt ved høyt nivå i cancertyper slik som gastrointestinal kreft, leverkreft og kreft i bukspyttkjertelen [1, 12].
Wu et al.
[8] rapportert at ekspresjon av DcR3 i magekreftpasienter var betydelig høyere enn normalt. DcR3 uttrykk i godt differensiert magekreft var betydelig lavere enn for dårlig differensierte prøver (P
< 0,05).
DcR3 uttrykk nivået var signifikant assosiert med lymfeknutemetastase og patologisk stadium, men ikke i høy med tumorstørrelse, metastatisk status, eller histologiske typer. Når pasienter ble fulgt opp i 63 måneder, ble DcR3 overekspresjon funnet å være assosiert med en betydelig kortere overlevelse [13, 14].
Mange rapporter har vist at høy uttrykk nivåer av ERK1 /2 korrelert med brystkreft, tykktarms og bukspyttkjertelkreft, så vel som ondartet melanom, leukemi og myxoma [15-18].
Våre undersøkelser viste at pasienter med magekreft, den positive forekomsten av DcR3 og ERK1 /2-mRNA var høyere enn i ikke- cancervev (P < 0,05). RT-PCR og western-blotting viste at mRNA og protein uttrykk nivåer av DcR3 og ERK1 /2 i tumorvev var betydelig høyere enn i ikke-cancer vev, noe som tyder på at DcR3 og ERK1 /2-nivåer korrelerer med tumorutvikling, men ikke med alderen , kjønn eller differensiering (P
> 0,05).
Våre resultater viste at de positive forekomsten av ekspresjon av DcR3 og ERK1 /2-mRNA og DcR3 og ERK1 /2-proteinet tilpasset hverandre. De immunhistokjemi Resultatene viste også at i mage svulster, ble ERK1 /2 svært uttrykt.
Chen et al. Product: [19] rapporterte at den positive frekvensen av DcR3 uttrykk var 74,4% (32/43) i leverkreft, og at det var en signifikant korrelasjon mellom DcR3 uttrykk og metastasering samt gjentakelse og differensiering.
i mus gastrisk modellen, RT-PCR viste at DcR3 mRNA kunne detekteres i svulster fra dag seks. ERK1 /2 mRNA og protein ble også påvist i svulster, og ERK1 nivåer gradvis økt i mage svulster. Videre, de ble også påvist i hjerte, lever, milt, lunge og nyre av den magekreft dyremodell, noe som antyder at de har en viktig rolle i tumorprogresjon. ERK1 /2 mRNA ble oppdaget fra dag fire i tumorvev, og ERK1 mRNA toppet seg på dag 10. ERK1 protein kan også påvises på dag fire i tumorvev, og fortsatte å øke hver dag. ERK1 holdt seg på et stabilt nivå i hjerte, lever og nyre, men det sank i lunge og milt på dag 10, etter å ha nådd toppen. ERK2 ble oppdaget på dag to i milt og tumorvev. Fra dag fire, ble ERK2 detektert i alle seks vev, og fortsatte å øke inntil dag 12. ERK2 kunne ikke påvises i hjerte, lunge og milt ved hjelp av RT-PCR på dag 12 i dyremodeller, men proteinnivåer kunne påvises. Disse resultatene tyder på at ERK1 og ERK2 kan ha ulik effekt på tumor forekomst, utvikling og klonal ekspansjon. Mange studier indikerte at ekspresjonen av ERK1 /2-mRNA og protein varierer i forskjellige tumorer og celler [20, 21]. Noen nylige rapporter antydet at de kan være helt motsatt i noen tilfeller. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• MikroRNA-206 undertrykker magekreft cellevekst og metastasis
• Optimal diett av trastuzumab i kombinasjon med oksaliplatin /kapecitabin i førstelinjebehandling av HER2-positiv avansert magekreft (CGOG1001): en multisenter, fase II trial