Betekenis van decoy receptor 3 (Dcr3) en externe-signaal gereguleerd kinase 1/2 (Erk1 /2) bij maagkanker

Betekenis van decoy receptor 3 (Dcr3) en externe-signaal gereguleerd kinase 1/2 (Erk1 /2) bij maagkanker
Abstracte achtergrond
Decoy receptor 3 (DcR3), een lid van de tumor necrosis factor receptor (TNFR) superfamilie, wordt gebruikt voor anti-tumor immuniteit onderdrukken. Het wordt sterk tot expressie gebracht in veel tumoren en de expressie kan worden gereguleerd door de MAPK /MEK /ERK signaleringsroute. De MAPK /MEK /ERK-route is gerapporteerd als een regulator in tumor optreden, ontwikkeling en klonale expansie. Extern signaalgereguleerde kinase (ERK) is een belangrijk lid van deze route.
Resultaten
De expressie van DcR3 en ERK1 /2 in tumorweefsels maagkanker patiënten significant hoger dan de niet-kankerachtige (P
< 0,05). Er was geen statistisch verschil tussen de tumor weefsel van patiënten met verschillende leeftijden of geslacht, en zelfs van verschillende differentiatie (P Restaurant > 0,05). Echter, bij patiënten met stadium I maagkanker, de DcR3 en ERK1 /2 niveaus waren significant lager dan patiënten met meer gevorderde stadia.
Conclusies
DcR3 en ERK1 /2, een cruciale rol spelen in de ontwikkeling van maagkanker, en zij kunnen nieuwe merkers voor het aangeven van de efficiëntie van maag kankerbehandeling in de toekomst. achtergrond
Decoy receptor 3 (DcR3) is een lid van de tumor necrosis factor receptor (TNFR) superfamilie. Het is aangetoond dat de decoy receptor van Fas ligand (FasL), LIGHT en TL1A [1-3], ook bekend als TR6 worden [4]. DcR3 wordt meestal uitgedrukt in tumorcellen en competitieve remmer van TNF signalering. Overexpressie van DcR3 in tumorcellen beschermt tegen apoptose. DcR3 beschermt tumorcellen uit immune surveillance omdat het bijdraagt ​​tot de onderdrukking van de gastheer anti-tumor immuniteit.
DcR3 mRNA en eiwit geamplificeerd in verschillende kwaadaardige weefsels, zoals longkanker, darmkanker, maagkanker, esophageal carcinoom, pancreas kanker en kwaadaardige melanoom [1, 5, 6]. Wu et al.
[7] gemeld dat DcR3 niet kon worden gedetecteerd in niet-tumor patiënten, maar 98,8% (82/83) van de patiënten met maligne kankers worden gedetecteerd.
Dit verschijnsel blijkt dat de verhoogde DcR3 expressie wordt significant gecorreleerd met het ontstaan ​​van tumoren en tumor progressie. Wu et al.
[8] gemeld dat DcR3 was sterk tot expressie gebracht in menselijke maagkanker (GC) en positief gecorreleerd met de ontwikkeling en metastasen van gastrische lesies. Maagkankerpatiënten met een hoge expressie DcR3 gepresenteerd een meer gevorderde ziekte pN2-3 dan die met een lage expressie DcR3. Ondernemingen De DcR3 voor FasL betrokken kunnen zijn bij de progressie van maagkanker. Verdere evaluatie van de mogelijke rol van DcR3 en de regulering van DcR3 expressie in kwaadaardige cellen is zeer belangrijk voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën voor het bestrijden van de groei van kwaadaardige cellen die de gastheer immune surveillance ontsnappen.
In het beginstadium, de MAPK /ERK route wordt geactiveerd in tumoren, wat een aanzienlijk teken voor vele soorten kankers bij mensen. Onlangs heeft een aantal lijnen erop wijst dat ERK een parameter voor het voorspellen van de prognose van verschillende kankers zoals borstkanker, colonkanker, pancreaskanker en cholangiocarcinoom zijn. Wang et al.
[9] gemeld dat de expressie van ERK1 /2 was hoog in cholangiocarcinoom, die correleerden met de TNM stadia.
Kim et al.
[10] vonden dat LPS geïnduceerde afgifte in DcR3 humane intestinale epitheliale cellen (IEC), die kennelijk zijn via de activering van door mitogeen geactiveerde eiwitkinasen (MAPK), zoals extracellulair signaal gereguleerde kinase 1 en 2 (ERK1 /2) en c-Jun NH2-terminale proteïne kinase ( JNK). LPS-geïnduceerde DcR3 release in SW480 cellen werd afgeschaft door ERK1 /2 en JNK remmers. Bovendien Yang et al.
[11] gemeld dat 3 g /ml DcR3 induceerde aanmerkelijk de fosforylatie van ERK en p38.
Overeenkomstig deze rapporten stellen wij voor DcR3 en ERK1 /2 nauw verwant. De DcR3 genen nauw gecorreleerd met het optreden en de ontwikkeling van vele soorten tumoren. In dit onderzoek onderzochten we de expressie en locatie van DcR3 en ERK1 /2 in maagkanker patiënten van verschillende leeftijden, geslacht, stadium en differentiatie, de relatie tussen DcR3 /ERK1 /2 en maagkanker voorkomen en ontstaan ​​verkennen. Bovendien geven we suggesties voor klinische diagnose van maagkanker.
Methods
klinische monsters
Tumoren waren van maagkanker patiënten die een endoscopische biopsie of curatieve operaties werden ondergaan in Zhongshan ziekenhuis aangesloten bij Xiamen University. Tumor weefsels waaruit DNA en eiwitten werden geïsoleerd waren uit verse specimen van resectie chirurgie. Alle monsters werden verkregen met toestemming van de patiënt en de goedkeuring van de Commissie Medische Ethiek van Zhongshan ziekenhuis Xiamen University.
Muizen
Alle experimenten werden uitgevoerd met behulp van 6-8 weken mannelijk naakt muizen gekocht van Model Animal Research Center van Medical College Xiamen University. Alle dieren werden gehuisvest in specifieke pathogeen vrije omstandigheden met een constante toegang tot water en voer. Alle experimentele procedures werden na de goedkeuring van de Animal Care en gebruik Comite van Xiamen University uitgevoerd.
Cell cultuur Ondernemingen De menselijke maagkanker cellijn BGC823 werd in ons laboratorium, die gekweekt werd in flessen met Dulbecco's gemodificeerd Eagle's onderhouden medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2.
Reagentia
DMEM, FBS en penicilline-streptomycine werden aangeschaft van Hyclone Corporation (Utah, USA). -Hematoxyline en eosine (H &E) assay kit werd gekocht bij Chemicon International, Inc (Temecula, CA, USA). ERK1 /2 en DcR3 Abs werden gekocht van Santa Cruz Bio-technologie. RT-RCR reagentia werden gekocht van TaKaRa (Dalian, China). De primer sequentie werd gesynthetiseerd uit Sangon (Shanghai, China).
In vivo dierlijke tumormodellen
Tumoren in mannelijk naakt muizen werden gegenereerd door intramusculaire (im) injectie van BGC823 cellen (1,0 x 105 cellen in 100 pl PBS) in de rechterflank. Tumormetingen werden omgezet in tumorvolume (V) met de formule (L x W2 x 0,52), waarbij L en W de lengte en breedte, respectievelijk. De metingen werden gemaakt met een schuifmaat. All-tumor dragende muizen werden willekeurig verdeeld in groepen (2 muizen /groep).
RT-PCR en Western blotting analyse voor het onderzoek van de expressie van DcR3 /ERK
Totaal RNA van DcR3 en ERK1 /2 werd geëxtraheerd uit gestimuleerd cellen met behulp Trizol. Om ERK /DcR3 gen aantal kopieën, DNA van verse tumor monsters werd geanalyseerd met RT-PCR te meten. De stroomopwaartse en stroomafwaartse primers voor ERK1 mRNA waren 5'-CCTGCTCATCAACACCACC-3 'en 5'-CGTAGCCACATACTCCGTCA-3', en waren ERK2 mRNA 5'-TCTTCC AGCCCTCCTTCCTG-3 'en 5'-CGTTTCTGCGCCGTTAGGT-3'. De monsters werden gedenatureerd bij 95 ° C gedurende 4 minuten, gevolgd door 35 amplificatiecycli (95 ° C, 45 seconden; 55 ° C, 45 sec en 72 ° C, 60 sec). De producten waren 300 bp en 400 bp fragmenten respectievelijk. Voor DcR3 mRNA, de stroomopwaartse primer was 5'GCAAAGCCAAGGATTCCCCCTG -3 'en de stroomafwaartse primer was 5'-GGCACTGCTCTGAGCTGGAGCTG-3'. De monsters werden gedenatureerd bij 95 ° C gedurende 4 minuten, gevolgd door 30 amplificatiecycli (95 ° C, 45 seconden; 55 ° C, 45 sec en 72 ° C, 60 sec). Het product was een 921-bp fragment.
BGC823 cellen werden geoogst en gelyseerd in lysis buffer (1% (v /v) Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM PMSF, 2 g /ml aprotinine, en 2 g /ml leupeptine) dat DcR3 en ERK1 /2-eiwitten kunnen vrijkomen. Vijfentwintig microgram totale lysaat werd gefractioneerd door SDS-PAGE en onderworpen aan Western blot analyse met behulp van anti-ERK en anti-DcR3 mAb (kloon 3 H5).
Western blotting en ELISA-test voor het onderzoeken van de expressie van DcR3 /ERK remmers na behandeling
BGC823 cellen kweeksupernatanten werden op verschillende tijdstippen verzameld en niveaus van U0126, PD98059, APDC, MEK1 /2 en ERK1 /2 interferenties werden gekwantificeerd met commerciële ELISA-kits, volgens de instructies van de leverancier. Cellen behandeld met ERK1 /2 shRNA (5: 2, 6: 2), U0126 /PD98059 (0 umol /l, 5 umol /L, 10 umol /L, 20 umol /L, 40 umol /L) en APDC (0 umol /L, 10 umol /L, 20 umol /L, 40 umol /L, 80 umol /L), respectievelijk. Na een 5- of 7-dagen incubatie werden de cellen onderworpen aan cytokinen zoals aangegeven assay. Vijfentwintig microgram totale lysaat werd gefractioneerd door SDS-PAGE en onderworpen aan Western blot analyse met behulp van anti-ERK en anti-DcR3 mAb (kloon 3 H5).
Immunohistochemie analyse voor de expressie van DcR3 en ERK1 /2
tumorweefsels werden gefixeerd in formaldehyde medium en ingebed in paraffine. Secties 6 mm werden aangebracht op glazen plaatjes voorbehandeld met 0,1% poly-L-lysine. Zij werden vervolgens deparaffinaged in xy-lene, gedehydrateerd in gegradeerde ethanol en gedrenkt in 3% H 2O 2 voor 10 min te elimineren endogene peroxidase-activiteit. Vervolgens werden de objectglaasjes ondergedompeld in citraatbuffer (pH 6,0) en kookte bij 92-98 ° C in een microgolfoven gedurende 10 min. Zij werden vervolgens 3 maal met PBS gewassen voor 10 minuten elk en geblokkeerd met 10% normaal geit serum in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. De objectglaasjes werden vervolgens met de affiniteit gezuiverde konijn-anti-TR6 Ab (1,67 g /ml) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Na wassen werden de objectglaasjes geïncubeerd met gebiotinyleerd geit-anti-konijn antilichaam gedurende 10 min. TR6 signaal werd onthuld door streptavidine-peroxidase behulp DAB als substraat volgens de instructies van de Histostain-Plus kit (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). DcR3 signalen werden geopenbaard in het bruin. Tenslotte werden de objectglaasjes met hematoxyline en verzegeld met waterige Mounting Media (Zymed).

Statistische analyse De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD. De significantie van het verschil tussen de groepen werd bepaald door studenten`s tweezijdige t-test. Kanswaarde van minder dan 0,05 werd als significant beschouwd. Alle middelen werden berekend uit ten minste drie onafhankelijke experimenten.
Resultaten
Kankerpatiënten hebben verheven DcR3 niveaus Belgique Om de correlatie tussen DcR3 expressie en tumor ontstaan ​​en ontwikkeling te bestuderen, werden tumoren van 50 maagkanker patiënten verzameld en getest voor DcR3 mRNA en eiwitniveaus. Zoals getoond in figuur 1a, werden de 921 bp banden DcR3 gegenereerd door RT-PCR van de tumorweefsels van de meeste patiënten (36/50), vergeleken met de niet-kankerachtige weefsels (2/50) van dezelfde organen van deze patiënten. Deze resultaten demonstreren dat DcR3 niveaus waren significant verhoogd (acht willekeurig gekozen klinische monsters zijn getoond in figuur 1a). Om onze resultaten verder te bevestigen, werden de DcR3 eiwitniveaus onderzocht door western blotting. De resultaten tonen aan dat DcR3-eiwit kan worden gedetecteerd in de meeste kankerpatiënten; DcR3-eiwit werd gedetecteerd in 74% (37/50) van de tumorweefsels, maar slechts in 6% (3/50) van de niet-kankerachtige weefsels (Tabel 1 en Figuur 1b, acht willekeurig gekozen klinische monsters zijn getoond in figuur 1b ). Figuur 1 de expressie van DcR3 in maagkanker en niet-kankerachtige weefsels door RT-PCR (Figure1A) en Western blotting (Figure1b) geanalyseerd. a: Lane M, DNA-merkers; lanes1-7, tumorweefsels; laan 8, niet-kwaadaardige weefsels; DcR3 mRNA was positief in 36 van 50 tumorweefsels (1-7) en negatief in niet-kankerachtige weefsels (8). b: lanes1-7, tumor weefsel; laan 8, niet- kankerachtige weefsels. DcR3 eiwit was positief in 37 van 50 monsters van tumorweefsel (1-7), die slechts 3 van 50 in niet-kankerachtige weefsels (8).
Tabel 1 Analyse van maagkanker patiënten met DcR3 en ERK1 /2 expressie in tumor en normale weefsels
Cases
positief getal
Positieve tarief (%)
tumor
50
mRNA
Eiwitten
+ /+
mRNA
Eiwitten
+ /+
DcR3
36
37
28
72,0
74,0
56,0
ERK1
37
42
36
74,0
84,0
72,0
P
> 0.05
ERK2
32
37
27
64,0
74,0
54,0
niet-kanker
50
DcR3 2
3
0
4,0
6,0
0
ERK1
6
5 1
12,0
15,0
2,0
ERK2
9
10

• MicroRNA-206 onderdrukt maag kanker celgroei en metastasis
• Optimale regime van trastuzumab in combinatie met oxaliplatine /capecitabine in de eerste lijn behandeling van HER2-positieve gevorderde maagkanker (CGOG1001): een multicenter, fase II trial