Significado do receptor chamariz 3 (DcR3) e-sinal externo regulada quinase 1/2 (ERK1 /2) no câncer gástrico

Significado do receptor chamariz 3 (DcR3) e-sinal externo regulada quinase 1/2 (ERK1 /2) no câncer gástrico da arte abstracta
Fundo
receptor Decoy 3 (DcR3), um membro do fator de necrose tumoral receptor (TNFR) superfamília, está associada com a supressão da imunidade anti-tumoral. Ele é altamente expressa em muitos tumores, e a sua expressão pode ser regulada pelo /via de sinalização MAPK MEK /ERK. O MAPK /MEK /ERK via tem sido relatada como sendo um regulador na ocorrência de tumor, desenvolvimento e expansão clonal. -Sinal externo quinase regulada (ERK) é um membro vital desta via.
Resultados
A expressão de DcR3 e ERK1 /2 em tecidos tumorais de pacientes com câncer gástrico foi significativamente maior do que o grupo não-cancerosos (P
< 0,05). Não houve diferença estatística entre os tecidos tumorais de pacientes com diferentes idades ou sexo, e até mesmo de diferenciação diferentes (P Art > 0,05). No entanto, em pacientes com estágio I câncer gástrico, o DcR3 e ERK1 /2 níveis foram significativamente menores do que os pacientes com mais estágios avançados.
Conclusões
DcR3 e ERK1 /2 desempenham um papel vital no desenvolvimento do câncer gástrico, e eles podem ser novos marcadores para indicar a eficácia do tratamento do cancro gástrico no futuro.
fundo
receptor chamariz 3 (DcR3) é um membro do receptor do factor de necrose tumoral (TNFR) superfamília. Mostrou-se ser o receptor chamariz para o ligando de Fas (FasL), luz e TL1A [1-3], também conhecido como TR6 [4]. DcR3 é principalmente expresso em células tumorais e inibe competitivamente a sinalização de TNF. A sobre-expressão de DcR3 em células tumorais protege-los contra a apoptose. DcR3 protege as células tumorais de vigilância imunológica, pois contribui para a supressão da imunidade anti-tumor host.
MRNA e proteína DcR3 são amplificados em vários tecidos malignos, tais como câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer gástrico, carcinoma esofágico, pâncreas cancro e melanoma maligno [1, 5, 6]. Wu et al.
[7] relataram que o DcR3 não pôde ser detectado em pacientes que não de tumor, mas poderia ser detectado em 98,8% (82/83) dos pacientes com cancros malignos.
Este fenómeno mostra que a elevada expressão DcR3 é significativamente correlacionada com tumorigênese e progressão tumoral. Wu et al.
[8] relataram que o DcR3 foi altamente expressa no cancro gástrico humano (CG), e positivamente correlacionada com o desenvolvimento de metástases e das lesões gástricas. pacientes com câncer gástrico com uma expressão alta DcR3 apresentou uma doença mais avançada pN2-3 do que aqueles com uma expressão de baixo DcR3.
O DcR3 para FasL podem estar envolvidos na progressão do câncer gástrico. A avaliação subsequente dos possíveis papéis de DcR3 e a regulação da expressão de DcR3 em células malignas é muito importante para o desenvolvimento de novas estratégias para controlar o crescimento de células malignas que escapam à vigilância imunitária do hospedeiro.
Na fase inicial, a MAPK /ERK via é activada em tumores, que é um sinal notável para muitos tipos de cancros em seres humanos. Recentemente, várias linhas de evidência sugerem que ERK poderia ser um parâmetro para predizer o prognóstico de vários cancros, tais como câncer de mama, câncer de cólon, câncer de pâncreas e colangiocarcinoma. Wang et al.
[9] relatou que a expressão de ERK1 /2 era elevado em colangiocarcinoma, o que se correlacionou com as fases TNM.
Kim et al.
[10] verificaram que o LPS induziu libertação de DcR3 em células epiteliais intestinais humanas (IEC), que parecem ser através da activação de quinases activadas por mitogénio (MAPK), tais como quinase extracelular regulada por sinal 1 e 2 (ERK1 /2) e cinase de proteína c-Jun NH2-terminal ( JNK). Induzida por LPS de libertação de DcR3 em células SW480 foi abolido por inibidores de JNK ERK1 /2 e. Além disso, Yang et al.
[11] relatou que 3 g /ml DcR3 marcadamente induziu a fosforilação de ERK e p38.
De acordo com esses relatórios, propomos que DcR3 e ERK1 /2 estão intimamente relacionados. Os genes DcR3 estreitamente relacionado com a ocorrência e desenvolvimento de vários tipos de tumores. Neste estudo investigou o nível de expressão e localização de DcR3 e ERK1 /2 em pacientes com câncer gástrico de diferentes idades, sexo, estágio e diferenciação, para explorar a relação entre DcR3 //2 e gástrica ocorrência de câncer ERK1 e desenvolvimento. Além disso, nós fornecemos sugestões para diagnóstico clínico de câncer gástrico.
Métodos
amostras clínicas
tumores eram de pacientes com câncer gástrico que foram submetidos a biópsia endoscópica ou operações curativos no hospital Zhongshan afiliada à Xiamen universidade. Os tecidos tumorais a partir da qual o DNA e proteína foram isolados eram do espécime frescas de cirurgia de ressecção. Todas as amostras foram obtidas com o consentimento e aprovação da Comissão de Ética Médica do Hospital Zhongshan Xiamen University paciente.
Ratos
Todos os experimentos foram realizados utilizando 6-8 semanas ratos nus masculinos adquiridos de Modelo Centro de Pesquisa Animal da Faculdade de Medicina Universidade de Xiamen. Todos os animais foram alojados em condições livres de patógenos específicos com acesso constante à água e ração. Todos os procedimentos experimentais foram realizados após a aprovação do Comitê de Cuidado e Uso Animal da Universidade de Xiamen. A cultura celular
A linha celular de cancro gástrico humano BGC823 foi mantida em nosso laboratório, que foi cultivado em frascos com Dulbecco modificado Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO2.
Reagentes
DMEM, FBS e penicilina-estreptomicina foram comprados a partir de Hyclone Corporation (Utah, EUA). Hematoxilina-e-eosina (H & E) Kit de ensaio foram adquiridos a Chemicon International, Inc. (Temecula, CA, EUA). ERK1 /2 e DcR3 Abs foram adquiridos a partir de tecnologia de Santa Cruz Bio. reagentes RT-RCR foram comprados da Takara (Dalian, China). A sequência iniciadora foi sintetizado a partir Sangon (Xangai, China).
In vivo em modelos animais de tumores
Os tumores foram gerados em ratinhos nu masculina por injecção intramuscular (im) A injecção de células BGC823 (1,0 × 105 células em 100 � PBS) em flanco direito. As medições do tumor foram convertidas em volume do tumor (V) pela fórmula (L x W2 × 0,52), onde L e W representam o comprimento e a largura, respectivamente. As medições foram feitas com uma craveira. Todos os ratinhos portadores de tumor foram divididos aleatoriamente em grupos (2 ratos /grupo).
RT-PCR e análise de transferência de Western para examinar a expressão de DcR3 /ERK
ARN total de DcR3 e ERK1 /2 foi extraído a partir estimulada células utilizando Trizol. Para medir ERK /DcR3 número de cópias do gene, o ADN a partir de amostras de tumor frescas foi analisada com RT-PCR. Os iniciadores a montante e a jusante para o ARNm de ERK1 foram 5'-CCTGCTCATCAACACCACC-3 'e 5'-CGTAGCCACATACTCCGTCA-3', e para o ARNm de ERK2 foram 5'-TCTTCC AGCCCTCCTTCCTG-3 'e 5'-CGTTTCTGCGCCGTTAGGT-3'. As amostras foram desnaturadas a 95 ° C durante 4 min, seguido de 35 ciclos de amplificação (95 ° C, 45 s; 55 ° C, 45 seg; e 72 ° C, 60 seg). Os produtos eram de 300 pb e fragmentos de 400 pb, respectivamente. Para o ARNm de DcR3, o iniciador a montante 5'-GCAAAGCCAAGGATTCCCCCTG foi -3 'e o iniciador a jusante foi 5'-GGCACTGCTCTGAGCTGGAGCTG-3'. As amostras foram desnaturadas a 95 ° C durante 4 min, seguido por 30 ciclos de amplificação (95 ° C, 45 s; 55 ° C, 45 seg; e 72 ° C, 60 seg). O produto era um fragmento de 921-pb.
BGC823 células foram colhidas e lisadas em tampão de lise celular (1% (v /v) de Nonidet P-40, NaCl 150 mM, Tris-HCl a 50 (pH 8), 1 mM PMSF, 2 g /ml de aprotinina, e 2 g /mL de leupeptina), que pode libertar o DcR3 e ERK1 /2 proteínas. Vinte e cinco microgramas de lisado total foram fraccionadas por SDS-PAGE e submetidos a análise de transferência de Western utilizando o anticorpo anti-ERK ou anti-DcR3 mAb (clone 3 H5).
Transferência de Western e ensaio ELISA para examinar a expressão de DcR3 /ERK após o tratamento inibidores
BGC823 células sobrenadantes de cultura foram recolhidos em vários intervalos, e os níveis de U0126, PD98059, APDC, MEK1 /2 e ERK1 /2 interferências foram quantificadas utilizando kits ELISA comerciais, de acordo com as instruções do fornecedor. As células tratadas com ERK1 /2 shRNA (5: 2, 6: 2), U0126 /PD98059 (0 umol /L, 5 nmol /L, 10 nmol /L, 20 nmol /L, 40 nmol /L) e APDC (0 ? mol /L, 10 nmol /L, 20 nmol /L, 40 nmol /L, 80 nmol /L), respectivamente. Após uma incubação de 5 ou 7 dias, as células foram submetidas a ensaio como as citocinas indicadas. Vinte e cinco microgramas de lisado total foram fraccionadas por SDS-PAGE e submetidos a análise de transferência de Western utilizando o anticorpo anti-ERK ou anti-DcR3 mAb (clone 3 H5). A análise imuno-histoquímica
para a expressão de DcR3 e ERK1 /2
Os tecidos tumorais foram fixadas num meio de formaldeído e embebida em parafina. Secções 6 mm de espessura foram montadas em lâminas de vidro previamente tratados com 0,1% poli-L-lisina. Eles foram, em seguida, em deparaffinaged XY-lene, desidratadas em etanol graduado e embebido em 3% H 2O 2 durante 10 minutos para eliminar a actividade da peroxidase endógena. Em seguida, as lâminas foram imersas em tampão citrato (pH 6,0) e ferve-se a 92-98 ° C num forno de micro-ondas durante 10 min. Subsequentemente, elas foram lavadas 3 vezes com PBS durante 10 min cada e bloqueadas com soro de cabra normal a 10% em PBS durante 1 h à temperatura ambiente. As lâminas foram então feitos reagir com o coelho purificado por afinidade anti-TR6 Ab (1,67 g /ml) à temperatura ambiente durante 2 h. Após a lavagem, as lâminas foram incubadas com anticorpo de cabra anti-coelho biotinilado durante 10 min. sinal TR6 foi revelada por estreptavidina-peroxidase utilizando DAB como um substrato de acordo com as instruções do kit de Histostain-Plus (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). sinais DcR3 foram revelados em marrom. Finalmente, as lâminas foram contrastadas com hematoxilina e selada com solução aquosa de meios de montagem (Zymed). A análise estatística

Os dados foram apresentados como média ± DP. A significância da diferença entre os grupos foi determinada pelo teste t bicaudal de Student`s. valor de probabilidade inferior a 0,05 foi considerado significativo. Todos os meios foram calculados a partir de pelo menos três experiências independentes.
Resultados
Pacientes com câncer têm níveis elevados de DcR3
Para estudar a correlação entre a expressão e tumor ocorrência e desenvolvimento DcR3, tumores de 50 pacientes com câncer gástrico foram recolhidos e testados para o ARNm de DcR3 e os níveis de proteína. Como se mostra na Figura 1a, os 921 pb bandas de DcR3 foram geradas por RT-PCR a partir dos tecidos tumorais da maioria dos pacientes (36/50), em comparação com os tecidos não cancerosos (2/50) dos mesmos órgãos de estes pacientes. Estes resultados demonstram que os níveis de DcR3 foram significativamente aumentados (oito amostras clínicas escolhidas aleatoriamente são mostrados na Figura 1A). Para confirmar ainda mais os nossos resultados, os níveis de proteína de DcR3 foram examinados por transferência Western. Os resultados demonstram que a proteína de DcR3 pode ser detectada na maior parte dos doentes com cancro; DcR3 proteína foi detectada em 74% (37/50) dos tecidos tumorais, mas apenas em 6% (3/50) dos tecidos não cancerosos (Tabela 1 e Figura 1b; oito amostras clínicas escolhidas aleatoriamente são apresentados na Figura 1b ). Figura 1 A expressão de DcR3 em tecidos de cancro gástrico e não cancerosos analisados ​​por RT-PCR (Figura 1A) e Western blot (Figura 1B). A: Pista M, marcadores de ADN; lanes1-7, tecidos tumorais; pista 8, tecidos não-cancerosos; DcR3 ARNm foi positivo em 36 de 50 tecidos de tumor (1-7) e negativo em tecidos não-cancerosas (8). b: lanes1-7, tecidos tumorais; pista 8, tecidos não-cancerosas. proteína de DcR3 foi positivo em 37 de 50 amostras de tecido de tumor (1-7), que apenas 3 de 50 em tecidos não-cancerosas (8).
Tabela 1 Análise de doentes com cancro gástrico com DcR3 e ERK1 /2 em expressão tumorais e normais tecidos

Cases
número positivo
taxa positiva (%)
tumor
50
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
36
37
28
72,0
74,0
56,0
ERK1
37
42
36
74,0
84,0
72,0
P Art > 0,05
ERK2
32
37
27
64,0
74,0
54,0
não-canceroso
50
DcR3 Página 2
3
0
4.0
6,0
0
ERK1
6
5
1

• MicroRNA-206 suprime o crescimento celular e câncer gástrico metastasis
• regime ideal de trastuzumab em combinação com oxaliplatina /capecitabina no tratamento de primeira linha do avançado câncer gástrico HER2-positivo (CGOG1001): um estudo multicêntrico, de fase II…