Значение подсадной рецептора 3 (Dcr3) и внешнего сигнала регулируется киназы 1/2 (ERK1 /2) при раке желудка

Значение подсадной рецептора 3 (Dcr3) и внешнего сигнала регулируется киназы 1/2 (ERK1 /2) при раке желудка
Аннотация
фон
Приманка рецептор 3 (DcR3), член фактора некроза опухолей рецептор (ФНО) надсемейство, связан с подавлением иммунитета против опухоли. Он высоко экспрессируется во многих опухолях, и его экспрессия может регулироваться /MEK /ERK сигнального пути МАРК. МАРК /MEK /ERK путь, как сообщается, быть регулятором в возникновении опухолей, развития и клональной экспансии. Внешний сигнал-регулируемой киназы (ERK) является жизненно важным членом этого пути.

Результаты Экспрессия DcR3 и ERK1 /2 в опухолевых тканях больных раком желудка была значительно выше, чем нераковая группе (Р
&л; 0,05). Там не было никакой статистической разницы между опухолевой ткани у пациентов с разного возраста или пола, и даже различной дифференциации (P
> 0,05). Тем не менее, у пациентов со стадией I рака желудка, то DcR3 и ERK1 /2 уровня были значительно ниже, чем у пациентов с более продвинутой стадии.
Выводы
DcR3 и ERK1 /2 играют жизненно важную роль в развитии рака желудка, и они могут быть новые маркеры для указания на эффективность лечения рака желудка в будущем.
Предпосылки
Decoy рецептора 3 (DcR3) является членом рецептора фактора некроза опухолей (TNFR) надсемейства. Было показано, что приманкой рецептор Fas-лиганд (FasL), легкой и TL1A [1-3], также известный как TR6 [4]. DcR3 главным образом выражается в опухолевых клетках и конкурентно ингибирует передачу сигналов TNF. Избыточная экспрессия DcR3 в опухолевых клетках защищает их от апоптоза. DcR3 защищает клетки опухоли от иммунного надзора, поскольку это способствует подавлению иммунитета хозяина против опухоли.
DcR3 мРНК и белок усиливаются в различных злокачественных тканях, таких как рак легких, рак толстой кишки, рак желудка, рак пищевода, поджелудочной железы рак и злокачественную меланому [1, 5, 6]. Ву и др.
[7] сообщили, что DcR3 не может быть обнаружен у пациентов, неопухолевых, но могут быть обнаружены в 98,8% (82/83) пациентов со злокачественными рака.
Это явление показывает, что повышенная выражение DcR3 достоверно коррелирует с онкогенеза и опухолевой прогрессии. Wu и др.
[8] сообщили, что DcR3 была высоко выражена в рака желудка человека (GC), и положительно коррелирует с развитием и метастазами желудочных поражений. Больных раком желудка с высоким уровнем экспрессии DcR3 представил более поздних стадиях заболевания pN2-3, чем те, с низким уровнем экспрессии DcR3.
The DcR3 для FasL могут быть вовлечены в прогрессии рака желудка. Дальнейшая оценка возможной роли DcR3 и регуляции экспрессии DcR3 в злокачественных клетках является очень важным для разработки новых стратегий для борьбы с ростом злокачественных клеток, которые ускользают от иммунного надзора хозяина.
На ранней стадии, в МАРК /ЭРК путь активируется в опухолях, которое является заметным признаком для многих видов рака у человека. В последнее время, несколько линий доказательств предположить, что ЭРК может быть параметром для предсказания прогноза различных видов рака, таких как рак молочной железы, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы и холангиокарциномы. Ван и др.
[9] сообщили о том, что экспрессия ERK1 /2 была высокой в ​​холангиокарциномой, которое коррелировало с этапами TNM.
Kim и др.,
[10] обнаружили, что LPS, индуцированное высвобождение DcR3 в эпителиальные клетки кишечника человека (МЭК), которые оказались через активацию митоген-активируемой протеинкиназы (МАРК), такие как внеклеточной регулируемой киназы 1 и 2 (ERK1 /2) и C-Jun NH2-концевой протеинкиназы ( JNK). LPS-индуцированной DcR3 высвобождения в клетках SW480 была отменена ингибиторами JNK ERK1 /2 и. Кроме того, Ян и др.
[11] сообщили, что 3 г /мл DcR3 заметно индуцирует фосфорилирование ERK и р38.
В соответствии с этими сообщениями, мы предлагаем DcR3 и ERK1 /2 тесно связаны между собой. Гены DcR3 тесно связаны с возникновением и развитием многих видов опухолей. В данном исследовании мы исследовали уровень экспрессии и расположение DcR3 и ERK1 /2 в больных раком желудка разного возраста, пола, стадии и дифференциации, чтобы исследовать взаимосвязь между ERK1 /2 и желудка возникновения DcR3 /рака и развития. Кроме того, мы предлагаем предложения по клинической диагностике рака желудка.
Методы
клинических образцов
Опухоли из больных раком желудка, которые подверглись эндоскопической биопсии или лечебные операции в Чжуншань больнице не связан с Xiamen университета. Опухолевые ткани, из которой были выделены ДНК и белка были из свежих образцов резекции хирургии. Все образцы были получены с согласия и одобрения Комитета по медицинской этике Чжуншань больницы Сямынь университета пациента.
Мышей
Все эксперименты проводились с использованием 6-8 недель самцов голых мышей, приобретенные у модельных экспериментов на животных Научно-исследовательского центра медицинского колледжа Сямынь университета. Все животные были размещены в специфических патогенов условиях с постоянным доступом к воде и корму. Все экспериментальные процедуры были проведены после утверждения животных по уходу и использованию комитета Сямынь университета.
Культура клеток
Человеческий желудочный линии раковых клеток BGC823 поддерживали в нашей лаборатории, который культивировали в колбах с Дульбекко модифицированной Орлиное среда Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина, при 37 ° с в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2.
Реагенты
приобретались DMEM, FBS и пенициллин-стрептомицина от Hyclone Corporation (штат Юта, США). Гематоксилин-и-эозин (H &Amp; E), набор для анализа были приобретены у Chemicon International, Inc (Temecula, CA, USA). ERK1 /2 и DcR3 Абс были приобретены у технологии Santa Cruz Bio. RT-RCR реагенты были приобретены у TaKaRa (Далянь, Китай). Грунтовка последовательность синтезировали из Sangon (Шанхай, Китай).
В естественных условиях модели опухолей животных
Опухоли сгенерированные у самцов голых мышей путем внутримышечного (IM) инъекции BGC823 клеток (1,0 × 105 клеток в 100 мкл PBS) в правый фланг. Измерения опухоли были преобразованы в объем опухоли (V) по формуле (L × W2 × 0,52), где L и W длина и ширина соответственно. Измерения проводились с помощью штангенциркуля. Все опухоль мышей были случайным образом разделены на группы (2 мыши /группу).
RT-PCR и Вестерн-блоттинга для изучения экспрессии DcR3 /ERK
тотальной РНК DcR3 и ERK1 /2 извлеченную стимулировал клеток с использованием Trizol. Для измерения ERK /DcR3 числа копий гена, ДНК из свежих образцов опухоли анализировали с помощью ОТ-ПЦР. Верхнего и нижнего течения праймеры для мРНК ERK1 были 5'-CCTGCTCATCAACACCACC-3 'и 5'-CGTAGCCACATACTCCGTCA-3', так и для мРНК ERK2 были 5'-TCTTCC AGCCCTCCTTCCTG-3 'и 5'-CGTTTCTGCGCCGTTAGGT-3'. Образцы денатурировали при 95 ° С в течение 4 мин, затем 35 циклов амплификации (95 ° С, 45 сек; 55 ° С, 45 сек, и 72 ° С, 60 сек). Продукты были 300 п.о. и 400 п.о. фрагментов соответственно. Для мРНК DcR3, вверх по течению праймер 5'- GCAAAGCCAAGGATTCCCCCTG -3 'и праймер вниз по течению 5'-GGCACTGCTCTGAGCTGGAGCTG-3'. Образцы денатурировали при 95 ° С в течение 4 мин, затем 30 циклов амплификации (95 ° С, 45 сек; 55 ° С, 45 сек, и 72 ° С, 60 сек). Продукт был 921 п.н.-фрагмент.
BGC823 клетки собирали и подвергали лизису в буфере для лизиса клеток (1% (об /об) Нонидет Р-40, 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl (рН 8), 1 мМ ФМСФ, 2 мкг /мл апротинина и 2 мкг /мл лейпептина), которые могли бы освободить DcR3 и ERK1 /2 белков. Двадцать пять микрограмм общего лизата фракционировали с помощью SDS-PAGE и подвергали Вестерн-блоттинга с использованием анти-ERK или анти-DcR3 мАт (клон 3 H5).
Вестерн-блоттинга и ELISA анализа для изучения экспрессии DcR3 /ЭРК после лечения ингибиторами
BGC823 клеток супернатанты культуры отбирали через различные промежутки времени, а также уровни U0126, PD98059, APDC, MEK1 /2 и ERK1 /2 Интерференции количественно оценивали с использованием коммерческих наборов ELISA, в соответствии с инструкциями поставщика. Клетки, обработанные ERK1 /2 shRNA (5: 2, 6: 2), U0126 /PD98059 (0 мкмоль /л, 5 мкмоль /л, 10 мкмоль /л, 20 мкмоль /л, 40 мкмоль /л) и APDC (0 мкмоль /л, 10 мкмоль /л, 20 мкмоль /л, 40 мкмоль /л, 80 мкмоль /л), соответственно. После того, как 5- или 7-дневной инкубации клетки подвергали цитокины, как указанный анализ. Двадцать пять микрограмм общего лизата фракционировали с помощью SDS-PAGE и подвергали Вестерн-блоттинга с использованием анти-ERK или анти-DcR3 мАт (клон 3 Н5).
Анализ иммуногистохимии для экспрессии DcR3 и ERK1 /2
опухолевой ткани фиксировали в среде формальдегидом и заливали в парафин. Срезы толщиной 6 мм были установлены на предметные стекла, предварительно обработанных с 0,1% поли-L-лизином. Затем они были deparaffinaged в ху-Lene, обезвоживали в этаноле градуированной и замачивают в 3% H <> 2O к югу <югу> 2 в течение 10 мин для устранения эндогенной активности пероксидазы. Затем предметные стекла погружали в цитратном буфере (рН 6,0) и варят при 92-98 ° С в микроволновой печи в течение 10 мин. Впоследствии они были промыты 3 раза PBS в течение 10 минут каждый и блокировали 10% нормальной козьей сывороткой в ​​PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Срезы затем подвергают взаимодействию с аффинно очищенным кроличьим анти-TR6 Ab (1,67 г /мл) при комнатной температуре в течение 2 часов. После промывки предметные стекла инкубировали с биотинилированным антителом козы против кролика в течение 10 мин. Сигнал TR6 была обнаружена стрептавидин-пероксидазы с использованием DAB в качестве субстрата в соответствии с инструкциями из Histostain-Плюс комплект (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). DcR3 сигналы были выявлены в коричневом цвете. И, наконец, слайды были контрастно гематоксилином и запечатаны с помощью водного раствора монтажной Media (Zymed).
Статистический анализ
данные были представлены в виде среднего значения ± SD. Значимость различий между группами оценивали с помощью Студента Стьюдента-тест. Вероятность значение менее 0,05 считалось существенным. Все средства были рассчитаны по меньшей мере трех независимых экспериментов.
Результаты
больных раком имеют повышенные уровни DcR3
Для изучения корреляции между экспрессией и опухолевой возникновения и развития DcR3, были собраны и испытаны опухоли из 50 больных раком желудка для мРНК DcR3 и уровней белка. Как показано на рисунке 1а, в 921 п.о. DcR3 полосы были получены с помощью ОТ-ПЦР из опухолевых тканей большинства пациентов (36/50), по сравнению с нераковых тканей (2/50) из одних и тех же органов этих пациентов. Эти результаты показывают, что уровни DcR3 были значительно увеличены (восемь произвольно выбранных клинических образцов показаны на рисунке 1a). Для дальнейшего подтверждения наших результатов, уровни белка DcR3 были исследованы с помощью вестерн-блоттинга. Результаты показывают, что DcR3 белок может быть обнаружен у большинства пациентов с раком; DcR3 белок был обнаружен у 74% (37/50) из опухолевых тканей, но только в 6% (3/50) из незлокачественных тканей (таблица 1 и рисунок 1b; восемь произвольно выбранных клинических образцов показаны на рисунке 1b ). Рисунок 1 Выражение DcR3 при раке желудка и нераковых тканей анализировали с помощью ОТ-ПЦР (Figure1a) и Вестерн-блоттинга (Figure1b). а: Lane M, ДНК-маркеры; lanes1-7, ткани опухоли; полоса 8, незлокачественные ткани; DcR3 мРНК был положительным в 36 из 50 опухолевых тканей (1-7) и отрицательным в нераковых тканей (8). б: lanes1-7, опухолевые ткани; полоса 8, незлокачественные ткани. DcR3 белок был положительным в 37 из 50 образцов опухолевой ткани (1-7), что только 3 из 50 в нераковых тканей (8).
Таблица 1 Анализ больных раком желудка с DcR3 и ERK1 /2 в выражении опухолевые и нормальные ткани

случаи

Положительное число

Положительная ставка (%)


опухолевые
50
мРНК <бр> Белок
+ /+
мРНК
Белок
+ /+
DcR3
36
37
28
72,0
74,0
56,0
ERK1
37
42
36
74,0
84,0
72,0
P
> 0.05
ERK2
32
37
27
64,0
74,0
54,0
незлокачественный
50
DcR3 страница 2 3
0
4,0
6,0
0
ERK1
6 страница 5 1
12,0
15,0
2,0
ERK2
9
10 страница 3 18,0 20,0

6,0
Выражение ERK1 /2 в клинических образцах
чтобы идентифицировать сигнальные молекулы, связанные с DcR3, уровни экспрессии ERK1 /2, JNK и р38, были испытаны. Мы обнаружили, что только ERK1 /2 может быть обнаружена в образцах опухолей (данные не показаны для JNK и р38). ERK1 мРНК была обнаружена в 74% образцов (37/50), и ERK2 мРНК была обнаружена в 64% образцов (32/50, таблица 1 и рисунок 2а). На уровне белка, ERK1 был обнаружен у 84% (42/50) и ERK2 в 74% (37/50) тканей опухоли (таблица 1 и рисунок 2, б). Эти результаты указывают на то, что пациенты с желудочным раковых опухолей имеют более высокий ERK1 /2-положительное возникновение по сравнению с нераковых тканей (P
&л; 0,05). Был положительная корреляция между уровнями мРНК и белка, как и в 42 из 50 опухолевых тканей к ERK1 был повышен уровень белка, из которых 36 случаев были совместимы с экспрессии мРНК. В противоположность этому, экспрессия белка ERK1 был обнаружен только в пяти нормальных тканей. При рассмотрении ERK2, 37 из 50 случаев опухолевых тканей были положительными для экспрессии белка ERK2, из которых 27 случаев согласовывались с экспрессией мРНК ERK2, в то время как только десять случаев показали положительную экспрессию белка в нормальных тканях. Восемь произвольно выбранных образцов показаны на рисунке 2. Рисунок 2 Выражение ERK1 /2 при раке желудка и нераковых тканей анализировали с помощью ОТ-ПЦР (рис 2а) и вестерн-блоттинга (рис 2b). а: Lane M, ДНК-маркеры; lanes1-7, ткани опухоли; полоса 8, незлокачественные ткани; ERK1 и мРНК ERK2 были положительными в опухолевых тканях. б:. ERK1 и ERK2 белка были положительными в опухолевых тканях (1-8)
Расположение ERK1 /2 в больных раком желудка
Для изучения ERK1 /распределения 2, опухоли из 50 пациентов были протестированы с помощью иммуногистохимии. Результаты показывают, что ERK1 /2 были выражены в опухолевых тканях от большинства пациентов. Выражение ERK1 было обнаружено в цитоплазме. положительное выражение ERK2 было обнаружено в некоторых опухолевых клеток (рисунок 3). Рисунок 3 Расположение ERK1 2 белка /в желудочном раковых тканях анализировали с помощью иммуногистохимии. A: Контрольные, B: ERK1, C:. ERK2
/2 уровня DcR3 и ERK1 коррелирует с опухолевой инвазии, но не от возраста, пола или дифференциации
Положительные заболеваемости мРНК DcR3 в опухолевых тканях больных раком желудка было 72,0% (36/50), а также белка DcR3 74,0% (37/50), который был значительно выше, чем в нераковых тканях, показывая лишь 4% (2/50) и 6% (3/50), соответственно ( Р
≪ 0,05; таблица 1). Положительное возникновение экспрессии ERK1 /мРНК 2 составила 74,0% (37/50) и 64,0% (32/50), и экспрессии белка 84,0% (42/50) и 74,0% (37/50). Оба они были значительно выше, чем нераковых тканей, показывая на 12,0% (6/50) и 18,0% (9/50) и 10,0% (5/50) и 20,0% (10/50), соответственно (табл 1). Эти результаты свидетельствуют о том, что уровни экспрессии, DcR3 и ERK1 /2 коррелировали с возникновением опухоли и ее развития.
Как показано в таблицах 2, 3 и 4, не было никакой существенной разницы между опухолевой ткани от различного возраста, пола и групп пациентов с различной дифференциацией стадии рака желудка (P &
GТ; 0,05). Тем не менее, уровни экспрессии DcR3 и ERK1 /2 были значительно выше в стадии TNM-II-IV (таблица 5). Таким образом, выражения DcR3 и ERK1 /2 коррелирует с опухолевой инвазии и стадии TNM, но не от возраста, пола или differentiation.Table 2 Корреляция экспрессии DcR3 и ERK1 /2 с возрастом у больных раком желудка

случаи

Положительное число

Положительная ставка (%)


≥50
32
мРНК
Белок
+ /+
мРНК
протеин
+ /+
DcR3
25
28
21
78,1
87,5
65,6
ERK1
28
31
26
87,5
96,9
81,2
P
> 0.05
ERK2
20
22
16
62,5
68,8
50,0
&л; 50
18
DcR3
11
9 страница 5 из 61,1
50,0
27,8
erK1
13
11 страница 5 из 72,2
61,1
27,8
ERK2
12
15
6
66,7
83,3
33,3
Таблица 3 Соотношение экспрессии DcR3 и ERK1 /2 с полом в больных раком желудка

Случаи

Положительное число

Положительная ставка (%)


Male
39
мРНК
протеин
+ /+
мРНК
Белок
+ /+
DcR3
29
29
24
74,4
74,4
61,5
erK1
32
35
28
82,1
89,7
71,8
P
> 0.05
ERK2
26
30
23
66,7
76,9
59,0
Female
11
DcR3
7
8
5
63,6
72,7
45,6
ERK1
9
7
6
81,8
63,6
54,5
ERK2
6
7 4
54,6
63,6
36,4
Таблица 4 Соотношение экспрессии DcR3 и ERK1 /2 с дифференциацией опухоли у больных раком желудка

Случаи

Положительное число

Положительная ставка (%)


Ну
9
мРНК
протеин
+ /+
мРНК
Белок
+ /+
DcR3
7
7 страница 5 из 77,8
77,8
55,6
ERK1
7
9
6
77,8
100,0
66,7
P
> 0,05
ERK2
6
7 страница 5 из 66,7
77,8
55,6
Умеренно
28
DcR3
21
23
20
75,0
82,1
71,4
erK1
24
24
22
85,7
85,7
78,6
ERK2
19
24
17
67,9
85,7
60,7
Low
13
DcR3
8
7 страница 5 из 61,5
53,9
38,5
erK1
10
9
8
76,9
69,2
61,5
ERK2
7
6
5
53,9
46,2
38,5
Таблица 5 Соотношение экспрессии DcR3 и ERK1 /2 с патологической стадии опухоли у больных раком желудка
TNM стадии

Случаи <бр>
Положительное число

Положительная ставка (%)

Я
6
мРНК
протеин
+ /+
мРНК
Белок
+ /+
DcR3
1
1
1
16.7
16.7
16.7
ERK1 страница 2 из 2
1
33,3
33,3
16.7
P
> 0,05
ERK2
1
1
0
16.7
16.7
0.0
II
17
DcR3
12
13
10
70,6
76,5
58,8
erK1
14
14
11
82,4
82,4
64,7
P
> 0,05
ERK2
10
12
9
58,8
70,6
52,9
III
25
DcR3
21
21
21
84,0
84,0
84,0
erK1
23
24
22
92,0
96,0
88,0
P
> 0,05
ERK2
20
23
18
80,0
92,0
72,0
IV страница 2 DcR3 страница 2 из 2
2
100,0 100,0

100,0
ERK1 страница 2 из 2 страница 2 100,0 100,0

100,0
P
> 0,05
ERK2
1
1
1
50,0
50,0
50,0
Уровни экспрессии DcR3 и ERK1 /2 усиливаются в животных моделях
Как показано в таблице 6, после введения BGC823 клеток в правый бок голых мышей, опухоли росли каждый день. ОТ-ПЦР использовали для тестирования уровней DcR3 и ERK1 /2 мРНК в опухолях и Вестерн-блот-анализа использовали для выявления уровня белка. В желудочных животных моделях рака, DcR3, ERK1 и ERK2 были обнаружены в 921 п.н., 300 п.н. и 400 п.н., соответственно. В этих опухолевых тканях DcR3 мРНК была обнаружена из шести дней, достигло максимума на 10-й день, и оставался обнаружен на 12 день DcR3 был также обнаружен в шесть дней до 12 дней в печени, в то время как он был обнаружен только на 12-й день на сердце и легких ( На рисунке 4а). ERK1 /мРНК 2 выражения были обнаружены из четырех суток в опухолевых тканях, и ERK1 мРНК достигло максимума на 10-й день (фиг.4А и таблица 7) .table 6 Вес опухоли BGC823 в голой мыши (х ± s, n = 6)
Группа

Δ вес /мг


2 d

4d

6d

8d

10 d

12 d

Нормальный
-
-
-
-
-
-
модель
0. 47 ± 0. 17 △
0. 77 ± 0. 28 △
1. 01 ± 0. 39 △
1. 43 ± 0. 79 △
1. 65 ± 0. 68 △
1. 46 ± 0. 66 △
Примечание: △ P
&л; 0,01 по сравнению с
нормально; ** P
&л; 0,01 по сравнению с
модель.
Таблица 7. Экспрессия DcR3 и ERK1 /2 мРНК в опухолевых тканях животных моделях, проанализированных с помощью RT-PCR

2d

4d

6d

8d

10d

12d

DcR3
—
—
+
+
++
++
ERK1
—
+
+
+
++
++
ERK2
—
+
+
+
+
+
Рисунок 4 Выражение DcR3 и ERK1 /2 в мышиных моделях анализировали с помощью ОТ-ПЦР (рисунок 4а) и вестерн-блоттинга (фиг.4В). а: Lane M, ДНК-маркер; lanes1-6, сердца, печень, селезенка, легкие, почки и опухолевых тканей мышиных моделей на четвертый день; lanes7-12, что на восьмой день; lanes13-18, на двенадцатый день; ERK1 мРНК был положительным в lane2,8,9,12,14,15,18, ERK2 мРНК был положительным в lane1,2,6,9,10,12,13,14,15,17,18. мРНК DcR3 была обнаружена в lane8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. В: дорожка 1, сердце; lane2, печени; lane3, селезенка; lane4, легких; lane5, почек; lane6, ткани опухоли; Выражение ERK1 белка увеличилось в опухолевых тканях, как время шло, в сердце, печень и почки сохраняется в течение 12 дней, выражение ERK2 может быть обнаружен в селезенке и опухоли со второго дня, который был положительным в опухолевых тканях до четвертого дня и все пять органов на двенадцатый день. Экспрессия белка DcR3 был положительным в опухолевых тканях и печени на шестой день, и в селезенке на десятый день, который был отрицательным в сердце, легких, почек до двенадцатого дня.
DcR3 белок был обнаружен на шестой день в опухоли тканей и печени, а выражение осталось до дня 12. белок DcR3 не был обнаружен на 10-й день в селезенке и 12-й день в сердца, почек и легких. ERK1 белок был обнаружен на четвертый день в опухолевых тканях, и продолжает увеличиваться с каждым днем. ERK1 белок оставался на стабильном уровне в сердце, печень и почки, но она уменьшилась в легких и селезенке на 10 день, после достижения пика. ERK2 был обнаружен на второй день в селезенке и опухолевых тканей. С четырех дня, ERK2 белок был обнаружен во всех шести образцах, и продолжали расти до дня 12. Эти результаты свидетельствуют о том, что ERK1 и ERK2 может оказывать различное воздействие на возникновение опухоли, развитие и клональной экспансии.
Выражение DcR3 уменьшилось после ингибирования выражение или фосфорилирование ERK1 /2 в клетках BGC823
Для того, чтобы исследовать влияние экспрессии ERK1 /2 и фосфорилирования на экспрессию DcR3, BGC823 клетки обрабатывали ERK1 /2 shRNA или с ингибиторами, которые конкретно регулируют ERK путь. Вестерн-блот-анализ подтвердил, что ингибиторы эффективно блокировали фосфорилирование молекул МЕК /ERK токопровод, и что shRNA значительно снижала экспрессию ERK1 /2 (рисунок 5). Как показано на рисунке 5А, когда BGC823 клетки обрабатывали ERK1 /2 shRNA, ERK1 /2 и P-ERK1 /2 уровней снизилась по сравнению с контролем. Рисунок 5 Выражение ERK1 /2 и Р-ERK1 /2 в клеточной линии BGC823 плазмидной вмешательства и ингибитора обнаружены с помощью вестерн-блоттинга. а: Уровни экспрессии ERK1 /2 и P-ERK1 /2 снизилась по сравнению с контролем. 1) контрольная группа; 2) 5: 2 (плазмида: реагент); 3) 6: 2 (плазмида: реагент). B: ERK1 /2 фосфорилирования постепенно снижалась в концентрации ингибитора U0126, PD98059 увеличилась, но общий экспрессии белка ERK1 /2 практически не изменились. 1) 0 мкмоль /л; 2) 5 мкмоль /л; 3) 10 мкмоль /л; 4) 20 мкмоль /л; 5) 40 мкмоль /л. C: ERK1 /2 фосфорилирования постепенно снижалась в концентрации ингибитора APDC. 1) 0 мкмоль /л; 2) 10 мкмоль /л; 3) 20 мкмоль /л; 4) 40 мкмоль /л; 5) 80 мкмоль /л. d: PD98059, очевидно, может ингибировать уровень фосфорилирования MEK1 /2, но это не изменяет уровни экспрессии MEK1 /2 или NF-kB. 1) 0 мкмоль /л; 2) 5 мкмоль /л; 3) 10 мкмоль /л; 4) 20 мкмоль /л; 5) 40 мкмоль /л.
U0126 является очень эффективным ингибитором МЕК, что приводит к ингибированию фосфорилирования ERK, как это делает PD98059. ЭРК фосфорилирование постепенно снижалась в концентрации лекарственных средств увеличилось, хотя общее выражение ERK1 /2 белка практически не изменилось (Фиг.5В).
APDC могут ингибировать активацию NF-кВ клеток в различных клетках. Благодаря деградации IκB, APDC может уменьшить транслокацию NF-kB, таким образом блокируя активацию NF-кВ. Как показано на рисунке 5 С, при различных концентрациях APDC, изменение уровня ингибирования NF-kB может существенно затухнуть ERK1 /2 уровней фосфорилирования. Однако конкретный механизм требует дальнейшего изучения.
Для изучения влияния этих ингибиторов и shRNA на экспрессию DcR3 мы использовали анализ ELISA, которые показали, что секретируемый DcR3 в надосадочной жидкости уменьшилось после различных обработок (рисунок 6). Статистический анализ показал, что уровни секреции DcR3 значительно отличались между экспериментом группами и контрольными группами (P &
ЛТ; 0,05). Как показано на рисунке 6, интерференция с ERK1 /2 в BGC823 клеток приводило к снижению экспрессии белка DcR3 по сравнению с контрольной группой. Тенденция соответствует уровню экспрессии ERK на рисунке 5 и доказывает, что оба имеют положительную корреляцию. Кроме того, уровни экспрессии DcR3 и Р-ERK уменьшается, когда клетки обрабатывали различными концентрациями U0126, PD98059 и APDC. Эти данные показывают, что секреция DcR3 положительно коррелирует с P-ERK1 /2 уровней экспрессии в BGC823 клетках желудка. Стоит отметить, что в группе U0126, уровни секреции DcR3 увеличивается, когда концентрация препарата достигала 40 мкмоль /л; Однако конкретный механизм требует дальнейшего исследования. В группе APDC, уровни DcR3 не претерпела существенных изменений при концентрациях выше 20 мкмоль /л. Рисунок 6 Экспрессия белка DcR3 плазмидой помехе и ингибитора с помощью анализа ELISA. а: DcR3 уровни экспрессии в BGC823 культуре супернатанта уменьшается, когда клетки обрабатывали ERK1 интерференционной плазмиды. B: уровни экспрессии DcR3 уменьшается, когда клетки обрабатывали ERK2 интерференционной плазмиды. C: уровни экспрессии DcR3 уменьшается, когда клетки обрабатывали различными концентрациями U0126, PD98059 и APDC мкмоль /л
Обсуждение
Было показано, что ген DcR3 экспрессируется на низком уровне в человеческом эмбрионе, легких,. мозг, печень, селезенка, желудка, толстой кишки, лимфатические узлы и спинного мозга, в то время как она была выражена на высоком уровне в раковых заболеваний, таких как рак желудочно-кишечного тракта, гепатоцеллюлярной карциномы и рака поджелудочной железы [1, 12].
Wu и др.
[8] сообщили о том, что экспрессия DcR3 в больных раком желудка была значительно выше, чем обычно. Выражение DcR3 в хорошо дифференцированной рака желудка была значительно ниже, чем у малодифференцированных образцов (P &
л; 0,05).
Уровень экспрессии DcR3 был в значительной степени связано с метастазов в лимфатических узлах и патологической стадии, но не коррелировала с размером опухоли, метастатическим статус, или гистологических типов. Когда пациенты наблюдают в течение 63 месяцев, DcR3 суперэкспрессия было установлено, что связано со значительно сокращенным выживаемости [13, 14].
Много отчетов показали, что высокие уровни экспрессии ERK1 /2 тесно коррелировало с молочной железы, ободочной и прямой кишки и рак поджелудочной железы, а также злокачественная меланома, лейкоз и миксомы [15-18].
Наше исследование показало, что у пациентов с раком желудка, положительной заболеваемости DcR3 и ERK1 /2 мРНК была выше, чем в нереля- раковые ткани (P &л; 0,05). ОТ-ПЦР и Вестерн-блоттинга показал, что уровни мРНК и экспрессии белка из DcR3 и ERK1 /2 в опухолевых тканях, были значительно выше, чем в тканях нераковых, предполагая, что /2 уровня DcR3 и ERK1 коррелируют с развитием опухоли, но не с возрастом , пола или дифференциации (Р
> 0,05).
Наши результаты показали, что положительная частота экспрессии DcR3 и ERK1 /2 и мРНК DcR3 и ERK1 2 белка /сопоставленные друг с другом. Результаты иммуногистохимия также показали, что в опухолях желудка, была высоко выражена ERK1 /2.
Чен и др.
[19] сообщили, что положительная норма экспрессии DcR3 составила 74,4% (32/43) в гепатоцеллюлярной карциномы, и что существует значительная корреляция между экспрессией DcR3 и метастазирования, а также рецидива и дифференцировки.
в мышиной модели желудка, RT-PCR показал, что мРНК DcR3 могут быть обнаружены в опухолях с шести дней. ERK1 /2 мРНК и белка были также обнаружены в опухолях, и уровни ERK1 постепенно увеличивается в опухолях желудка. Кроме того, они были также обнаружены в сердце, печени, селезенки, легких и почек желудочной животной модели рака, предполагая, что они играют важную роль в опухолевой прогрессии. ERK1 /мРНК 2 был обнаружен с четырех дня в опухолевых тканях, и ERK1 мРНК достигла своего пика на день 10. ERK1 белка также могут быть обнаружены на четвертый день в опухолевых тканях, и продолжает увеличиваться с каждым днем. ERK1 оставалась на стабильном уровне в сердце, печень и почки, но она уменьшилась в легких и селезенке на 10 день, после достижения пика. ERK2 был обнаружен на второй день в селезенке и опухолевых тканей. С четырех дня, ERK2 был обнаружен во всех шести тканях, и продолжает увеличиваться до дня 12. ERK2 не мог быть обнаружен в сердце, легких и селезенке методом ОТ-ПЦР на 12-й день на животных моделях, но уровни белка могут быть обнаружены. Эти результаты свидетельствуют о том, что ERK1 и ERK2 может оказывать различное воздействие на возникновение опухоли, развитие и клональной экспансии. Многие исследования показали, что экспрессия мРНК ERK1 /2 и белка варьирует в различных опухолей и клеток [20, 21]. Некоторые недавние сообщения о том, что они могут быть совершенно противоположные в некоторых случаях.

• МикроРНК-206 подавляет желудочную рост раковых клеток и metastasis
• Оптимальный режим трастузумаба в комбинации с оксалиплатином /капецитабин в первой линии лечения HER2-положит…