Importancia del receptor señuelo 3 (DcR3) y de la señal externa quinasa regulada 1/2 (Erk1 /2) en el cáncer gástrico

Importancia del receptor señuelo 3 (DcR3) y la señal externa quinasa regulada 1/2 (ERK1 /2) en el cáncer gástrico
Resumen Antecedentes

receptor señuelo 3 (DcR3), un miembro del factor de necrosis tumoral receptor (TNFR) superfamilia, se asocia con la supresión de la inmunidad anti-tumor. Es altamente expresada en muchos tumores, y su expresión puede ser regulada por la vía de señalización MAPK /MEK /ERK. La vía /MEK /ERK MAPK se ha informado que es un regulador en la aparición del tumor, el desarrollo y la expansión clonal. -Señal externa regulada quinasa (ERK) es un miembro vital de esta vía.
Resultados
La expresión de DcR3 y ERK1 /2 en los tejidos tumorales de pacientes con cáncer gástrico fue significativamente mayor que el grupo no canceroso (P
< 0,05). No hubo diferencia estadística entre los tejidos tumorales de pacientes con diferentes edades o sexos, e incluso de diferentes diferenciación (P Hotel > 0,05). Sin embargo, en pacientes con estadio I cáncer gástrico, el DcR3 y ERK1 /2 niveles fueron significativamente más bajos que los pacientes con estadios más avanzados.
Conclusiones
DcR3 y ERK1 /2 juegan un papel vital en el desarrollo de cáncer gástrico, y que pueden ser nuevos marcadores para indicar la eficacia del tratamiento del cáncer gástrico en el futuro.
Antecedentes
receptor señuelo 3 (DcR3) es un miembro del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) superfamilia. Se ha demostrado que el receptor señuelo para el ligando de Fas (FasL), la luz y TL1A [1-3], también conocido como TR6 [4]. DcR3 se expresa principalmente en las células tumorales y competitivamente inhibe la señalización de TNF. La sobreexpresión de DcR3 en células tumorales los protege de la apoptosis. DcR3 protege a las células tumorales de la vigilancia inmune, ya que contribuye a la supresión de la inmunidad del huésped anti-tumor.
DcR3 ARNm y proteínas se amplifican en diversos tejidos malignos, tales como cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer gástrico, carcinoma de esófago, páncreas cáncer y el melanoma maligno [1, 5, 6]. Wu et al.
[7] informó de que DcR3 no se pudo detectar en los pacientes no tumorales, pero se pudo detectar en 98,8% (82/83) de los pacientes con cánceres malignos.
Este fenómeno demuestra que la elevada DcR3 expresión se correlaciona significativamente con la tumorigénesis y la progresión tumoral. Wu et al.
[8] informó de que DcR3 fue altamente expresado en el cáncer gástrico humano (GC), y positivamente correlacionado con el desarrollo y la metástasis de las lesiones gástricas. pacientes con cáncer gástrico con una alta expresión DcR3 presentan una enfermedad más avanzada pN2-3 que aquellos con una baja expresión DcR3. Francia El DcR3 para FasL puede estar implicada en la progresión del cáncer gástrico. La evaluación adicional de las posibles funciones de DcR3 y la regulación de la expresión DcR3 en células malignas es muy importante para el desarrollo de nuevas estrategias para controlar el crecimiento de células malignas que escapan a la vigilancia inmune del huésped.
En la primera fase, la MAPK /ERK se activa en los tumores, que es un signo notable para muchos tipos de cánceres en los seres humanos. Recientemente, varias líneas de evidencia sugieren que ERK podría ser un parámetro para predecir el pronóstico de diversos tipos de cáncer como el cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de páncreas y colangiocarcinoma. Wang et al.
[9] informó de que la expresión de ERK1 /2 era alta en colangiocarcinoma, que se correlaciona con los estadios TNM.
Kim et al.
[10] encontró que LPS induce la liberación DcR3 en las células epiteliales intestinales humanas (IEC), que parecían ser a través de la activación de las quinasas activadas por mitógenos proteína (MAPK), como señal extracelular regulada quinasa-1 y 2 (ERK1 /2) y la proteína quinasa c-Jun NH2-terminal ( JNK). Inducida por LPS de liberación DcR3 en células SW480 fue abolida por ERK1 /2 y inhibidores de JNK. Por otra parte, Yang et al.
[11] informó de que 3 g /ml DcR3 marcadamente indujo la fosforilación de ERK y p38.
De acuerdo con estos informes, proponemos que DcR3 y ERK1 /2 están estrechamente relacionados. Los genes DcR3 estrechamente correlacionada con la aparición y el desarrollo de muchos tipos de tumores. En este estudio se investigó el nivel de expresión y la localización de DcR3 y ERK1 /2 en pacientes con cáncer gástrico de diferentes edades, sexo, estadio y la diferenciación, para explorar la relación entre DcR3 /ERK1 /2 y el cáncer gástrico aparición y el desarrollo. Además, ofrecemos sugerencias para el diagnóstico clínico de los cánceres gástricos.
Métodos
muestras clínicas
tumores eran de pacientes con cáncer gástrico que fueron sido sometidos a biopsia endoscópica o curativos operaciones en el hospital Zhongshan afiliado a la Universidad de Xiamen. tejidos tumorales de las que se aislaron ADN y proteínas procedían de muestras frescas de la cirugía de resección. Todas las muestras se obtuvieron con el consentimiento del paciente y la aprobación del Comité de Ética Médica de Zhongshan Hospital de la Universidad de Xiamen.
Ratones
Todos los experimentos se realizaron con 6-8 semanas ratones desnudos macho adquiridas de Modelo Centro de Investigación Animal del Colegio Médico Universidad de Xiamen. Todos los animales se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos con un acceso constante a agua y pienso. Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo después de la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Xiamen.
Cultivo de células México La línea celular de cáncer gástrico humano BGC823 se mantuvo en nuestro laboratorio, que se cultivó en matraces con Dulbecco modificado Eagle medio (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.
Reactivos
se compraron DMEM, FBS y penicilina-estreptomicina de Hyclone Corporation (Utah, EE.UU.). Hematoxilina y eosina (H & E) kit de ensayo se adquirieron de Chemicon International, Inc (Temecula, CA, EE.UU.). ERK1 /2 y Abs DcR3 se adquirieron de Santa Cruz tecnología Bio. reactivos RT-RCR se adquirieron de Takara (Dalian, China). La secuencia del cebador se sintetiza a partir de Sangon (Shanghai, China). Hoteles en modelos tumorales animales in vivo
Los tumores se generaron en ratones desnudos masculinos por inyección intramuscular (im) de BGC823 células (1,0 x 105 células en 100 pl de PBS) en el flanco derecho. medidas de los tumores se convirtieron en el volumen del tumor (V) mediante la fórmula (L x W2 × 0,52), donde L y W son la longitud y anchura, respectivamente. Las mediciones se realizaron con un pie de rey. Todos los ratones portadores de tumores se dividieron aleatoriamente en los grupos (2 ratones /grupo).
RT-PCR y análisis de Western blot para examinar la expresión de DcR3 /ERK
RNA total de DcR3 y ERK1 /2 se extrajo de estimulada células utilizando Trizol. Para medir la ERK /DcR3 número de copias de genes, el ADN de muestras de tumor fresco se analizó con RT-PCR. Los cebadores aguas arriba y aguas abajo para ERK1 mRNA fueron 5'-CCTGCTCATCAACACCACC-3 'y 5'-CGTAGCCACATACTCCGTCA-3', y para ERK2 mRNA fueron 5'-TCTTCC AGCCCTCCTTCCTG-3 'y 5'-CGTTTCTGCGCCGTTAGGT-3'. Las muestras se desnaturalizaron a 95 ° C durante 4 min, seguido de 35 ciclos de amplificación (95 ° C, 45 seg; 55 ° C, 45 s; y 72 ° C, 60 seg). Los productos eran de 300 pb y 400 pb fragmentos respectivamente. Para DcR3 mRNA, el cebador aguas arriba era 5 'GCAAAGCCAAGGATTCCCCCTG -3' y el cebador corriente abajo fue 5 'GGCACTGCTCTGAGCTGGAGCTG-3'. Las muestras se desnaturalizaron a 95 ° C durante 4 min, seguido de 30 ciclos de amplificación (95 ° C, 45 seg; 55 ° C, 45 s; y 72 ° C, 60 seg). El producto era un fragmento de 921 pb. Se recogieron y se lisaron en tampón de lisis celular (1% (v /v) de Nonidet P-40, NaCl 150 mM, 50 mM Tris-HCl (pH 8), 1
BGC823 células PMSF mM, 2 g /ml de aprotinina, y 2 g /ml de leupeptina), que podría liberar DcR3 y ERK1 /2 proteínas. Veinticinco microgramos de lisado total se fraccionaron mediante SDS-PAGE y se sometieron a análisis de transferencia de Western usando el anticuerpo anti-ERK o anti DcR3-mAb (clon 3 H5).
Transferencia de Western y ensayo ELISA para examinar la expresión de DcR3 /ERK después del tratamiento inhibidores
BGC823 células sobrenadantes de cultivo se recogieron en varios intervalos, y los niveles de U0126, PD98059, APDC, MEK1 /2 y ERK1 /2 interferencias fueron cuantificados usando kits ELISA comerciales, de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las células tratadas con ERK1 /2 shRNA (5: 2, 6: 2), U0126 /PD98059 (0 mol /L, 5 mmol /L, 10 mmol /L, 20 mmol /L, 40 mmol /L) y APDC (0 mol /L, 10 mmol /L, 20 mmol /L, 40 mmol /L, 80 mmol /L), respectivamente. Después de una incubación de 5 ó 7 días, las células se sometieron a las citocinas como de ensayo indicado. Veinticinco microgramos de lisado total se fraccionaron mediante SDS-PAGE y se sometieron a análisis de transferencia de Western usando el anticuerpo anti-ERK o anti DcR3-mAb (clon 3 H5).
Análisis inmunohistoquímico para la expresión de DcR3 y ERK1 /2
Los tejidos tumorales se fijaron en un medio de formaldehído y embebidos en parafina. Secciones 6 mm de espesor se montaron en portaobjetos de vidrio pretratados con 0,1% de poli-L-lisina. Luego fueron deparaffinaged en xy-lene, se deshidrataron en etanol graduado y empapado en 3% H 2O 2 durante 10 minutos para eliminar la actividad peroxidasa endógena. A continuación, los portaobjetos se sumergieron en tampón citrato (pH 6,0) y se hierve a 92-98 ° C en un horno de microondas durante 10 min. Posteriormente, se lavaron 3 veces con PBS durante 10 min cada uno y se bloquearon con 10% de suero de cabra normal en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Los portaobjetos se hicieron reaccionar a continuación con el conejo purificado por afinidad anti-TR6 Ab (1,67 g /ml) a temperatura ambiente durante 2 hr. Después del lavado, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo de cabra anti-conejo biotinilado durante 10 min. señal TR6 fue revelado por estreptavidina-peroxidasa utilizando DAB como sustrato de acuerdo a las instrucciones del kit Histostain-Plus (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). DcR3 señales fueron reveladas en marrón. Por último, las diapositivas se counterstained con hematoxilina y sellados con medios acuosos de montaje (Zymed).
El análisis estadístico
Los datos se presentaron como media ± DE. La importancia de la diferencia entre los grupos se evaluó mediante la prueba t de dos colas s del estudiante. valor de probabilidad menor de 0,05 fue considerado significativo. Todos los medios se calcularon a partir de al menos tres experimentos independientes.
Resultados
Los pacientes con cáncer tienen niveles elevados DcR3
Para estudiar la correlación entre la expresión y el tumor DcR3 aparición y el desarrollo, se recogieron y se ensayaron los tumores de 50 pacientes con cáncer gástrico para DcR3 ARNm y los niveles de proteína. Como se muestra en la Figura 1a, las bandas de DcR3 921 pb fueron generados por RT-PCR a partir de los tejidos tumorales de la mayoría de los pacientes (36/50), en comparación con los tejidos no cancerosos (2/50) de los mismos órganos de estos pacientes. Estos resultados demuestran que los niveles de DcR3 se incrementaron significativamente (ocho muestras clínicas escogidas al azar se muestran en la Figura 1a). Para confirmar aún más nuestros resultados, los niveles de proteína DcR3 se examinaron mediante transferencia Western. Los resultados demuestran que la proteína DcR3 se pudo detectar en la mayoría de los pacientes de cáncer; se detectó la proteína DcR3 en 74% (37/50) de los tejidos tumorales, pero sólo en 6% (3/50) de los tejidos no cancerosos (Tabla 1 y la Figura 1b; ocho muestras clínicas escogidas al azar se muestran en la Figura 1b ). Figura 1 La expresión de DcR3 en el cáncer gástrico y los tejidos no cancerosos analizado por RT-PCR (Figure1a) y Western Blot (Figure1b). A: Carril M, marcadores de ADN; lanes1-7, los tejidos tumorales; carril 8, los tejidos no cancerosos; DcR3 ARNm fue positiva en 36 de los 50 tejidos tumorales (1-7) y negativa en los tejidos no cancerosos (8). b:, tejidos tumorales lanes1-7; carril 8, los tejidos no cancerosos. proteína DcR3 fue positiva en 37 de 50 muestras de tejido tumoral (1-7), que sólo 3 de 50 en los tejidos no cancerosos (8).
Tabla 1 Análisis de pacientes con cáncer gástrico con DcR3 y ERK1 /2 en la expresión tejidos tumorales y normales

Casos
número positivo
tasa positiva (%)
tumor
50
ARNm
proteína
+ /+
ARNm
proteína
+ /+
DcR3
36
37
28
72,0
74,0 56,0

ERK1
37
42
36
74,0 84,0

72,0
P Hotel > 0.05
ERK2
32
37
27
64,0
74,0 54,0

no cancerosos
50
DcR3
2 3
0
4.0 6.0

0
ERK1 página 6 página 5
1

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