Značaj Receptor mamac 3 (DcR3) i vanjskim signalom regulirane kinaze 1/2 (ERK1 /2) u želučanom cancer

Značaj Receptor mamac 3 (DcR3) i vanjskim signalom regulirane kinaze 1/2 (ERK1 /2) kod raka želuca pregled Sažetak pregled pozadini pregled Decoy receptor 3 (DcR3), član receptora za faktor nekroze tumora (TNFR) superobitelji, povezan s antitumorskim imunitet supresije. To je visoko izražen u mnogim tumorima, a ekspresija se može regulirati u MAPK /MEK /ERK signalnog puta. MAPK /MEK /ERK putanja je izvijestila da se regulator pojave tumora, razvoj i klonskom ekspanziju. Vanjski signala regulirana kinaza (ERK) je važan član ovog puta. Pregled Rezultati
izražavanju DcR3 i ERK1 /2 u tumorskim tkivima oboljelih od raka želuca bila je značajno viša od ne-kancerozne skupine (P
0,05). Nije bilo statistički značajne razlike između tumorskih tkiva kod pacijenata s različitim dobnim skupinama ili spol, pa čak i različite diferencijacije (P Netlogu > 0,05). Međutim, u bolesnika s pozornice sam rak želuca je DcR3 i ERK1 /2 bile su znatno niže od bolesnika s naprednijim stadijima. Pregled Zaključci
DcR3 i ERK1 /2 igraju vitalnu ulogu u razvoju raka želuca, i oni mogu biti nove markere za označavanje učinkovitosti želučane liječenja raka u budućnosti. pregled Pozadina pregled receptor mamac 3 (DcR3) je član receptora faktora nekroze tumora (TNFR) super. Pokazalo se da je mamac receptor za Fas liganda (FasL), svjetlost i TL1A [1-3], također poznat kao TR6 [4]. DcR3 uglavnom se eksprimira u tumorskim stanicama i kompetitivno inhibira TNF signalizacija. Pojačanom ekspresijom DcR3 u stanicama tumora ih štiti od apoptoze. DcR3 štiti stanice tumora imunološki nadzor jer pridonosi suzbijanju imuniteta domaćina protiv tumora.
DcR3 mRNA i proteina se pojačavaju u različitim malignim tkivima, kao što su rak pluća, rak debelog crijeva, raka želuca, jednjaka, gušterače karcinoma rak i maligni melanom [1, 5, 6]. Wu et al.
[7] izvijestili da DcR3 se ne može detektirati u ne-tumorske bolesnika, ali se može detektirati u 98.8% (82/83) pacijenata sa zloćudnim raka.
Ova pojava pokazuje da je povišena DcR3 izraz značajno korelira s tumorigenezi i progresiju tumora. Wu et al.
[8] izvijestili da DcR3 je visoko izražen u ljudskoj raka želuca (GC), te pozitivno korelira s razvojem i metastazama želučanih lezija. pacijenata s rakom želuca s visokom ekspresijom DcR3 predstavila je napredniji pN2-3 bolesti od onih s niskim DcR3 izražavanja.
DcR3 za FasL može biti uključen u progresiji karcinoma želuca. Daljnja procjena mogućih uloga DcR3 i reguliranju DcR3 izražavanja u malignim stanicama je vrlo važno za razvoj novih strategija za suzbijanje rasta malignih stanica koje Pobjeći imunosnog nadzora.
U ranoj fazi, MAPK /ERK ciklus je aktiviran u tumorima, što je značajan znak za mnoge vrste raka kod ljudi. Nedavno je nekoliko linija dokaza sugerira da ERK može biti parametar za predviđanje prognozu različitih oblika raka, poput raka dojke, raka debelog crijeva, rak gušterače i holangiokarcinomom. Wang et al.
[9] izvijestili su da je ekspresija ERK1 /2, bio je visoko holangiokarcinomom, koji korelira s fazama TNM.
Kim et al.
[10] su otkrili da LPS izazvanog DcR3 oslobadanje ljudske crijevne epitelne stanice (IEC), koji su se činili preko aktivacije mitogen-aktivirane protein kinaze (MAPK), kao što izvanstaničnim signalom-regulirane kinaze 1 i 2 (ERK1 /2) i c-Jun NH2-terminalne proteinske kinaze ( JNK). LPS-inducirana DcR3 puštanje u SW480 stanica je ukinuta od strane ERK1 /2 i JNK inhibitora. Nadalje, Yang i sur.
[11] izvijestili da je 3 g /ml DcR3 značajno inducira fosforilaciju ERK i p38.
U skladu s tim izvješćima, predlažemo da DcR3 i ERK1 /2 usko su povezani. U DcR3 gena usko povezana s pojavom i razvojem mnogih vrsta tumora. U ovom radu istraživan razinu ekspresije i mjesto DcR3 i ERK1 /2 u bolesnika različite dobi, spolu, stupnju i diferencijaciju rak želuca, istražiti odnos između DcR3 /ERK1 /2 i želuca pojavu i razvoj raka. Osim toga, pružamo prijedloge za kliničku dijagnozu želučanog karcinoma.
Metode
kliničkim uzorcima pregled Tumori su od pacijenata s rakom želuca koji su bili podvrgnuti endoskopskom biopsija ili kurativne operacija u Zhongshan bolnici povezan s Xiamen sveučilišta. Tumorskog tkiva iz kojeg su izolirane DNA i proteina su od svježih primjerka resekcija operacije. Svi uzorci su dobiveni uz pacijenta suglasnost i odobrenje Odbora za medicinsku etiku Zhongshan bolnice Sveučilište Xiamen.
Miševi
Svi pokusi su izvedeni primjenom 6-8 tjedna mužjaka golog miša kupljene od modela Animal Research Center of Medical College Sveučilište Xiamen. Sve životinje su držane pod režimom bez specifičnog patogena uvjetima konstantne pristup vodi i hrani. Svi eksperimentalni postupci su provedena nakon odobrenja njega i uporaba Odbora Sveučilište Xiamen životinja. Pregled Kultura stanica
ljudskog želučanog raka stanične linije BGC823 se održava u našem laboratoriju, koji je uzgaja se u tikvicama s Dulbeccovom modificiranom Eagle-a mediju (DMEM) uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS), i 1% penicilin-streptomicina na 37 ° C u vlažnoj atmosferi s 5% CO2.
reagensi pregled DMEM, FBS-a i penicilin-streptomicina su kupljene Hvclone Corporation (Utah, SAD). Hematoxylin-i-eozinom (H &E) test kit kupljeni su od Chemicon International, Inc (Temecula, CA, USA). ERK1 /2 i DcR3 Abs su kupljeni od Santa Cruz Bio tehnologije. RT-RCR reagensi nabavljeni su od Takara (Dalian, Kina). Početni odsječak je sintetiziran od Sangon (Shanghai Kina).
In vivo modelima tumora kod životinja pregled Tumori su generirane u mužjaka golog miša intramuskularno (im) injekcijom od BGC823 stanica (1,0 × 105 stanica u 100 ul PBS-a) u s desne strane. Mjerenja tumora su konvertirani u volumen tumora (V) formule (L × W2 x 0,52), pri čemu L i W je dužina i širina, redom. Mjerenja su izvedena s nonijus čeljust. Svi miševi koji nose tumor nasumično su podijeljeni u skupine (2 miševa /skupini).
RT-PCR i Western blotting analiza za ispitivanje ekspresije DcR3 /ERK pregled ukupne RNA DcR3 i ERK1 /2 je izvađen iz stimulirane stanice koriste Trizola. Za mjerenje ERK /DcR3 broj kopija gena, DNA iz uzoraka svježe tumora je analizirana s RT-PCR. Uzvodno i nizvodno primeri za ERK1 mRNA bile su 5'-CCTGCTCATCAACACCACC-3 'i 5'-CGTAGCCACATACTCCGTCA-3', i ERK2 mRNA bile su 5'-TCTTCC AGCCCTCCTTCCTG-3 'i 5'-CGTTTCTGCGCCGTTAGGT-3'. Uzorci denaturiran na 95 ° C tijekom 4 minute, a zatim 35 ciklusa amplifikacije (95 ° C, 45 sec 55 ° C, 45 s, i 72 ° C, 60 s). Proizvodi su 300 bp i 400 bp fragmenti respektivno. Za DcR3 mRNA, gornji primar je bio 5'-GCAAAGCCAAGGATTCCCCCTG 3 'i nizvodni primera je 5'-GGCACTGCTCTGAGCTGGAGCTG-3'. Uzorci denaturiran na 95 ° C tijekom 4 minute, a zatim 30 ciklusa amplifikacije (95 ° C, 45 sec 55 ° C, 45 s, i 72 ° C, 60 s). Produkt je 921-bp fragment.
BGC823 stanice su sakupljene i lizirane u puferu za lizu stanica (1% (v /v) Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM PMSF, 2 ug /ml aprotinina i 2 g /ml leupeptina), koji može osloboditi DcR3 i ERK1 /2 proteina. Dvadeset i pet mikrograma ukupnom lizatu je razdijeljen sa SDS-PAGE i podvrgnut Western blot analizom korištenjem anti-ERK ili anti-DcR3 mAb (klon 3 H5).
Western hibridizacija i ELISA testa za ispitivanje ekspresije DcR3 /ERK nakon inhibitori tretmana pregled BGC823 stanica supernatant kulture su sakupljeni u različitim intervalima, a razina U0126, PD98059, APDC, MEK1 /2 i ERK1 /2 smetnje su mjere pomoću komercijalnih ELISA kitova, u skladu s uputama proizvođača. Stanice tretirane ERK1 /2 shRNA (5: 2, 6: 2), U0126 /PD98059 (0 umol /L, 5 umol /L, 10 umol /L, 20 umol /L, 40 umol /L) i APDC (0 umol /L, 10 umol /L, 20 umol /L, 40 umol /L, 80 umol /L), redom. Nakon inkubacije od 5 ili 7 dana, stanice su podvrgnute citokina kao što je navedeno ispitivanje. Dvadeset i pet mikrograma ukupnom lizatu je razdijeljen sa SDS-PAGE i podvrgnut Western blot analizom korištenjem anti-ERK ili anti-DcR3 mAb (klon 3 H5).
Imunohistokemijski analiza za ekspresiju DcR3 i ERK1 /2
tumorskim tkivima su fiksirani u mediju formaldehidom i uklopljene u parafin. Sekcije debljine 6 mm su stavljeni na stakalca su prethodno tretirani s 0.1% poli-L-lizina. Zatim su u deparaffinaged xy-Lene, dehidrirana u gradijentnim etanolu i umočenog u 3% H <2O sub> 2 10 minuta kako bi se uklonili endogena aktivnost peroksidaze. Sljedeći, stakalca su uronjeni u citratnom puferu (pH 6,0) i kuha se 92-98 ° C u mikrovalnoj pećnici tijekom 10 minuta. Nakon toga, oni su isprane 3 puta s PBS-om 10 minuta svaki te blokirane s 10% normalnom kozjem serumu u PBS 1 sat na sobnoj temperaturi. Stakalca su potom reagirali s afinitetno pročistiti mišjim anti-TR6 Ab (1,67 g /ml), na sobnoj temperaturi tijekom 2 sata. Nakon ispiranja, slajdovi su inkubirani s biotiniliranim kozjim anti-zečjim antitijelom tijekom 10 min. TR6 signal je objavio streptavidin-peroksidaze koristeći DAB kao supstrat u skladu s uputama iz Histostain-Plus komplet (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). DcR3 signali su objavljeni u smeđe. Konačno, stakalca su prebrojane s hematoksilinom i zapečaćena vodene montiranje Media (Zymed).
Statistička analiza pregled Podaci su prikazani kao prosjek ± SD. Značaj razlika između skupina procijenjena je studentova dvokračne t-testom. Vjerojatnost vrijednost manja od 0,05 smatra se značajnom. Sva sredstva su izračunate iz najmanje tri neovisna pokusa. Pregled Rezultati
pacijenata oboljelih od raka imaju povišen DcR3 razine
Kako bi se ispitalo povezanost DcR3 izražavanja i tumora pojavu i razvoj, tumori iz 50 pacijenata s rakom želuca prikupljeni su i testirani za DcR3 mRNA i proteina. Kao što je prikazano na slici 1a, a 921 bp DcR3 vrpce dobivene su pomoću RT-PCR s tumorskim tkivima većine pacijenata (36/50), u usporedbi s ne-kanceroznim tkivima (2/50) od istih organa ovih pacijenata. Ovi rezultati pokazuju da DcR3 signifikantno povećana (osam nasumce izabrani kliničkih uzoraka su prikazani na slici 1a). Kako bi se dodatno potvrđuju naše rezultate, razine DcR3 proteina ispitano je pomoću Western blot pokusa. Rezultati pokazuju da DcR3 protein može se detektirati u većini pacijenata s karcinomom; DcR3 protein je otkriven u 74% (37/50), tumorskih tkiva, ali samo u 6% (3/50) od non-kancerogena tkiva (Tablice 1 i na slici 1b, osam nasumce izabrani kliničkih uzoraka su prikazani na slici 1b ). Slika 1. Ekspresija DcR3 u karcinomu želuca i ne-kancerogena tkiva analizirana je pomoću RT-PCR (Figure1a) i Western blotting-a (Figure1b). a: Lane M, DNA markeri; lanes1-7, tumorskih tkiva; linija 8, non-kancerogen tkiva; DcR3 mRNA bila je pozitivna u 36 od 50 tumorskih tkiva (1-7), a negativni u ne-kancerogen tkiva (8). b: lanes1-7, tumorskih tkiva; linija 8, non-kancerogen tkiva. DcR3 protein bio je u 37 od 50 uzoraka tkiva tumora (1-7), koji je samo 3 od 50 u ne-kancerogena tkiva (8). Pregled Tablica 1. Analiza oboljelih od raka želuca s DcR3 i ERK1 /2 u i tumorskog tkiva

Kućišta
Pozitivan broj
Pozitivna stopa (%)
tumor na pregled, 50 pregled mRNA
Proteini pregled + /+ pregled mRNA pregled Protein pregled + /+ pregled DcR3 pregled 36 pregled, 37 pregled, 28 pregled 72,0 pregled 74,0 pregled 56,0 pregled ERK1 pregled 37 pregled, 42 pregled, 36 pregled 74,0 pregled 84,0 pregled 72,0 pregled P izvoznici > 0,05 pregled ERK2 pregled, 32 pregled, 37 pregled, 27 pregled 64,0 pregled 74,0 pregled 54,0 pregled Non-kancerogen pregled 50 pregled DcR3 pregled 2 pregled 3
0 pregled 4.0 pregled 6.0 pregled, 0 pregled ERK1 pregled 6
5
1 pregled 12.0 pregled 15,0 pregled 2.0 pregled ERK2
9 pregled 10 pregled 3
18,0 pregled 20.0 pregled 6.0 pregled Izražavanje ERK1 /2 u kliničkim uzorcima
identificirati signalnim molekulama u vezi s DcR3, razina ekspresije ERK1 /2, JNK i p38 su ispitani. Pronašli smo da je samo ERK1 /2 može biti u uzorcima tumora (podaci nisu prikazani za JNK i p38). ERK1 mRNA detektirana je u 74% uzoraka (37/50) i ERK2 mRNA detektirana je u 64% uzoraka (32/50 Tablica 1 i Slika 2). Na razini proteina, ERK1 detektirana je u 84% (42/50) i ERK2 u 74% (37/50) tumorskih tkiva (tablica 1, a slika 2b). Ovi rezultati pokazuju da pacijenti sa gastričnih tumora raka imaju višu ERK1 /2-pozitivne pojava u usporedbi s ne-kancerogena tkiva (P pregled i 0.05). Postoji pozitivna korelacija između mRNA i proteina razinama, kao što je u 42 od 50 tumorskim tkivima na razini proteina ERK1 je povišen, od kojih je 36 slučajeva su bili u skladu s mRNA ekspresije. Za razliku od toga, ERK1 ekspresija proteina je otkriven tek u pet normalna tkiva. Pri ispitivanju ERK2, 37 od 50 slučajeva tumorskih tkiva pozitivna su za izražavanje ERK2 proteina, od kojih su 27 slučaja su u skladu s izrazom ERK2 mRNA, a samo deset slučajeva pokazala pozitivnu ekspresiju proteina u normalnim tkivima. Osam, nasumce izabrani uzoraka su prikazani na slici 2. Slika 2 Ekspresija ERK1 /2, rak želuca i ne-kancerogena tkiva analizirana je pomoću RT-PCR (slika 2a) i Western blotting (Slika 2b). a: Lane M, DNA markeri; lanes1-7, tumorskih tkiva; linija 8, non-kancerogen tkiva; ERK1 i ERK2 mRNA su bila pozitivna u tumorskim tkivima. b. ERK1 i ERK2 proteina bili su pozitivni u tumorskim tkivima (1-8) pregled Lokacija ERK1 /2 u bolesnika s rakom želuca
Ispitati ERK1 /2 distribucija, tumori iz 50 bolesnika su ispitane imunohistokemijski. Rezultati pokazuju da su ERK1 /2 izraženi u tumorskim tkivima od većine pacijenata. ERK1 ekspresija je pronađen u citoplazmi. ERK2 pozitivna ekspresija je nađen u nekim stanicama tumora (Slika 3). Slika 3 Položaj ERK1 /2 proteina u želučanim tkiva raka analizirane imunohistokemijski. A: Kontrola, B: ERK1, C:. ERK2
DcR3 i ERK1 /2 razine u korelaciji s invaziju tumorskih ali ne s dobi, spolu ili diferencijacije
pozitivnom učestalosti DcR3 mRNA u tumorskim tkivima oboljelih od raka želuca je 72,0% (36/50), te DcR3 proteina 74,0% (37/50), što je znatno više nego u ne-kancerogen tkiva pokazuju samo 4% (2/50) i 6% (3/50), odnosno ( P pregled i 0,05; Tablica 1). Pozitivna pojava ekspresije ERK1 /2 mRNA bila 74.0% (37/50) i 64.0% (32/50) i ekspresije proteina 84,0% (42/50) i 74.0% (37/50). Oboje su bili znatno veći od ne-kancerogen tkiva, što pokazuje 12,0% (6/50) i 18,0% (9/50) i 10,0% (5/50) i 20,0% (10/50), odnosno (tablica 1). Ovi rezultati ukazuju na to da DcR3 i ERK1 /2 izraz razina korelira s pojavom i razvojem tumora.
Kao što je prikazano u tablicama 2, 3 i 4, nije bilo značajne razlike između tumorskih tkiva iz različitih dobnih skupina, spolne skupine i bolesnika s različitim diferencijacije fazama raka želuca (P
i 0.05). Međutim, DcR3 i ERK1 /2 ekspresije bile su značajno visok u TNM stadij II-IV (Tablica 5). Tako su izrazi DcR3 i ERK1 /2 korelaciji s tumorskoj invaziji i TNM stadiju, ali ne s dobi, spolu ili differentiation.Table 2. Korelacija izražavanja DcR3 i ERK1 /2 s dobi u bolesnika s rakom želuca
Slučajevi
Pozitivan broj
Pozitivna stopa (%)
≥50 pregled 32 pregled mRNA pregled Protein pregled + /+
mRNA pregled Protein pregled + /+ pregled DcR3 pregled 25 pregled, 28 pregled, 21 pregled 78,1 pregled 87,5 pregled 65,6 pregled ERK1 pregled 28
31 pregled, 26 pregled 87,5 pregled 96,9 pregled 81,2 pregled P izvoznici > 0,05 pregled ERK2 pregled, 20 pregled, 22 pregled, 16 pregled 62.5 pregled 68,8 pregled 50.0 izvoznici < 50 pregled, 18 pregled DcR3 pregled 11 pregled 9 pregled 5
61,1 pregled 50.0 pregled 27.8 pregled ERK1 pregled, 13 pregled, 11 pregled 5
72,2 pregled 61.1 pregled 27.8 pregled ERK2
12 pregled, 15 pregled 6
66,7 pregled 83,3 pregled 33.3 pregled Tablica 3 Korelacija ekspresije DcR3 i ERK1 /2 sa spolu u bolesnika s rakom želuca
Kućišta
pozitivan broj
Pozitivna stopa (%)
muški pregled 39 pregled mRNA pregled Protein pregled + /+ pregled mRNA pregled Protein pregled + /+ pregled DcR3 pregled, 29 pregled, 29 pregled, 24 pregled 74.4 pregled 74.4 pregled 61.5 pregled ERK1 pregled 32 pregled 35 pregled, 28 pregled 82,1 pregled 89,7 pregled 71,8 pregled P izvoznici > 0,05 pregled ERK2 pregled, 26 pregled, 30 pregled, 23 pregled 66,7 pregled 76.9 pregled 59,0 pregled ženskih pregled 11 pregled DcR3 pregled 7 pregled 8
5 pregled 63,6 pregled 72,7 pregled 45,6 pregled ERK1 pregled 9
7
6
81,8 pregled 63,6 pregled 54,5 pregled ERK2 pregled 6. pregled 7
4
54,6 pregled 63,6 pregled 36,4 pregled Tablica 4. Korelacija ekspresije DcR3 i ERK1 /2 s tumora diferencijacije u bolesnika s rakom želuca
Kućišta
pregled Pozitivan broj
Pozitivna stopa (%)
Pa
9 pregled mRNA pregled Protein pregled + /+ pregled mRNA pregled Protein pregled + /+ pregled DcR3 pregled 7 pregled 7
5
77,8 pregled 77.8 pregled 55,6 pregled ERK1 pregled 7 pregled 9 pregled 6
77,8 pregled 100,0 pregled 66,7 pregled P izvoznici > 0.05 pregled ERK2 pregled 6
7
5
66,7 pregled 77.8 pregled 55,6 pregled Umjereno pregled 28. pregled DcR3 pregled 21 pregled 23
20 pregled 75,0 pregled 82,1 pregled 71,4 pregled ERK1 pregled, 24 pregled, 24 pregled, 22 pregled 85.7 pregled 85.7 pregled 78,6 pregled ERK2 pregled 19 pregled, 24 pregled, 17 pregled, 67.9 pregled 85.7 pregled 60,7 pregled, Low pregled 13 pregled DcR3 pregled 8
7
5 pregled 61.5
53,9 pregled 38,5 pregled ERK1 pregled, 10 pregled, 9
8
76,9 pregled 69.2 pregled 61.5 pregled ERK2 pregled 7
6 pregled 5. pregled 53.9 pregled 46.2 pregled 38,5 pregled Tablica 5. Korelacija ekspresije DcR3 i ERK1 /2 s patološkim fazama tumora u bolesnika s rakom želuca
TNM stadiju

Kućišta
pregled Pozitivan broj
Pozitivna stopa (%)
sam
6 pregled mRNA pregled Protein pregled + /+ pregled mRNA
Proteini pregled + /+ pregled DcR3 pregled 1 pregled 1 pregled 1 pregled 16.7 pregled 16.7 pregled 16.7 pregled ERK1 pregled 2 pregled 2
1 pregled 33.3 pregled 33.3 pregled 16.7 pregled P izvoznici > 0.05 pregled ERK2 pregled 1 pregled 1 pregled 0 pregled 16.7 pregled 16.7 pregled 0.0 pregled II pregled, 17 pregled DcR3 pregled 12 pregled 13
10 pregled 70,6 pregled 76,5 pregled 58,8 pregled ERK1 pregled, 14 pregled, 14 pregled, 11 pregled 82,4 pregled 82,4 pregled 64,7 pregled P pregled > 0.05 pregled ERK2 pregled, 10 pregled, 12 pregled, 9
58,8 pregled 70,6 pregled 52.9 pregled III
25 pregled DcR3 pregled 21
21
21 pregled 84,0 pregled 84,0 pregled 84,0 pregled ERK1 pregled, 23 pregled, 24 pregled, 22 pregled 92.0 pregled 96,0 pregled 88,0 pregled P pregled > 0.05 pregled ERK2 pregled 20 pregled, 23 pregled, 18 pregled 80,0 pregled 92.0 pregled 72,0 pregled IV pregled 2 pregled DcR3 pregled 2 pregled 2
2. pregled 100,0 pregled 100,0 pregled 100,0 pregled ERK1 pregled 2 pregled, 2 pregled, 2 pregled 100,0 pregled 100,0 pregled 100,0 pregled P pregled > 0.05 pregled ERK2 pregled 1 pregled 1 pregled 1 pregled 50.0 pregled 50.0 pregled 50.0 pregled Razina ekspresije DcR3 i ERK1 /2 pojačavaju se životinjskim modelima
Kao što je prikazano u tablici 6, nakon ubrizgavanja BGC823 stanica u desnu slabinu golih miševa, tumori rastao svaki dan. RT-PCR je korištena za testiranje DcR3 i ERK1 /2 razine mRNA u tumorima i Western blot analize je korištena za ispitivanje proteina. U želučanim rak životinjskim modelima, DcR3, ERK1 i ERK2 su detektirani pri 921 bp, 300 bp i 400 bp, po istom redoslijedu. U tim tumorskih tkiva DcR3 mRNA je otkrivena od šest dana, nalazio se na dan 10, a ostalo je otkrivena na dan 12. DcR3 također je otkrivena od šest dana do 12. dana u jetri, dok je otkriven samo na dan 12. srca i pluća ( slika 4a). ERK1 /2 mRNA izrazi se određuju četiri dana u tumorskim tkivima i ERK1 mRNA nalazio na dan 10 (Slika 4a i Tablica 7) .table 6 masenih BGC823 tumora u golih miševa (x ± s, n = 6) pregled Grupa
Δ težina /mg
2 d
4d
6D
8d
10 d
12 d
Normalno
- - pregled -
- -
- Model pregled 0. 47 ± 0. 17 △ pregled 0. 77 ± 0. 28 △ pregled 1. 01 ± 0. 39 △ pregled 1. 43 ± 0. 79 △ pregled 1. 65 ± 0. 68 △ pregled 1. 46 ± 0. 66 △ pregled Napomena: △ P izvoznici < 0.01 vs pregled normalna; ** P izvoznici < 0.01 vs
modelu. Pregled Tablica 7. Ekspresija DcR3 i ERK1 /2 mRNA u tumorskim tkivima životinjskih modela analizirana pomoću RT-PCR

2d

4d

6d

8d

10d

12d

DcR3
—
—
+
+
++
++
ERK1
—
+
+
+
++
++
ERK2
—
+
+
+
+
+
Slika 4 Ekspresija DcR3 i ERK1 /2 mišjim modelima analizirani pomoću RT-PCR (Slika 4a) i Western blotting-a (slika 4b). a: Lane M, čiji DNK; lanes1-6, srce, jetra, slezena, pluća, bubrezi i tumorskih tkiva modela miša na četvrti dan; lanes7-12, koji na snagu osmog dana; lanes13-18, dvanaestoga dana; ERK1 mRNA bila je pozitivna na lane2,8,9,12,14,15,18, ERK2 mRNA bila je pozitivna na lane1,2,6,9,10,12,13,14,15,17,18. DcR3 mRNA detektirana je u lane8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 b: liniji 1, srca lane2, jetre; lane3, slezene; lane4, pluća; lane5, bubrega; lane6, tumorskih tkiva; Ekspresija ERK1 proteina povećana u tumorskim tkivima kako je vrijeme prolazilo, u srce, jetra i bubrega trajao 12 dana, Ekspresija ERK2 mogao biti otkriven u slezeni i tumor od drugog dana koji je bio pozitivan u tumorskim tkivima do četvrtog dana i sve pet organa do dvanaestog dana. Ekspresija DcR3 proteina bio je pozitivan u tumorskim tkivima i jetri na šesti dan iu slezeni na deseti dan, što je negativno u srce, pluća, bubrega do dvanaestog dana.
DcR3 protein je otkriven na šest dana u tumor tkiva i jetru, te ekspresija do dana 12. DcR3 protein detektiran je na dan 10 u slezeni i 12 dana, srca, bubrega i pluća. ERK1 protein je otkriven na četiri dana u tumorskim tkivima, i dalje u porastu svaki dan. ERK1 proteina ostala na stabilnu razinu u srca, jetre i bubrega, ali manji u pluća i slezena na dan 10, nakon što dosegne vrh. ERK2 otkriven je na dva dana u slezeni i tumorskih tkiva. Od četiri dana, ERK2 protein je otkriven u svih šest uzoraka, a nastavljeno sve do dana 12. Ovi rezultati ukazuju na to da ERK1 i ERK2 može imati različite učinke na pojavu tumora, razvoj i klonske ekspanzije.
DcR3 izraz smanjila nakon inhibirati ekspresija ili fosforilacija ERK1 /2 u BGC823 stanicama
da se istraži djelovanje ERK1 /2, ekspresiju i fosforilacije na DcR3 izražavanja BGC823 stanice su tretirane s ERK1 /2 shRNA ili inhibitora koji specifično reguliraju ERK staze. Western blot analiza je potvrdila da su inhibitori učinkovito blokira fosforilaciju puteva molekule MEK /ERK i da shRNA značajno smanjio ekspresiju ERK1 /2 (slika 5). Kao što je prikazano na slici 5A, kada BGC823 Stanice su tretirane s ERK1 /2 shRNA, ERK1 /2 i P-ERK1 /2 razine smanjen u usporedbi s kontrolom. Slika 5 Ekspresija ERK1 /2 i P-ERK1 /2 u BGC823 stanične linije s plazmida smetnji i inhibitora je određeno 'Western blot-a. a: Razina ekspresije ERK1 /2 i P-ERK1 /2 smanjen je u usporedbi s kontrolom. 1) kontrolna skupina; 2) 5: 2 (plazmid: reagens); 3) 6: 2 (plazmid: reagens). b: ERK1 /2 fosforilacije postepeno smanjivala kako se koncentracija inhibitora U0126, PD98059 povećao, ali ukupni ERK1 /2 ekspresija proteina teško mijenjati. 1) 0 umol /L; 2) 5 umol /L; 3) 10 umol /L; 4) 20 umol /L; 5) 40 umol /L. c: ERK1 /2 fosforilacije postupno je opadao kao koncentracija inhibitora APDC. 1) 0 umol /L; 2) 10 umol /L; 3) 20 umol /L; 4.) 40 umol /L; 5) 80 umol /L. d: PD98059 očito mogu inhibirati nivo MEK1 /2 fosforilacije, ali nije promijenio MEK1 /2 ili NF-kB razine ekspresije. 1) 0 umol /L; 2) 5 umol /L; 3) 10 umol /L; 4) 20 umol /L; 5) 40 umol /L. Pregled U0126 je vrlo djelotvoran inhibitor MEK, što rezultira inhibicijom ERK fosforilacije, kao i PD98059. ERK fosforilacije postepeno smanjivala kako se koncentracija lijeka povećati, ali ukupni ekspresija ERK1 /2 protein teško mijenjati (slika 5B).
APDC može inhibirati aktivaciju NF-kB stanica u različitim stanicama. Kroz razgradnje IκB, APDC može smanjiti translokacije NF-kB, čime se blokira NF-kB aktivaciju. Kao što je prikazano na slici 5 ° C, u različitim koncentracijama APDC, promjena razine NF-kB inhibicije može značajno ublažiti ERK1 /2 nivoa fosforilacije. Međutim, specifični mehanizam zahtijeva daljnju istragu.
Ispitati učinak tih inhibitora i shRNA na DcR3 izraza koje smo upotrijebili ELISA analize, koji je pokazao da luči DcR3 u supernatant se smanjila nakon različitih tretmana (Slika 6). Statistička analiza je pokazala da DcR3 nivou sekrecije bila značajno različita između eksperimentalnih skupina i kontrolnih skupina (P
0,05). Kao što je prikazano na slici 6, uplitanje ERK1 /2, BGC823 stanica dovela do smanjene DcR3 ekspresiju proteina u usporedbi s kontrolnom skupinom. Trend odgovara razini ERK izraz u slici 5 i dokazuje da su dvije u pozitivnoj korelaciji. Nadalje, DcR3 i P-ERK razine ekspresije smanjen kada su stanice tretirane sa različitim koncentracijama U0126, PD98059 i APDC. Ovi podaci pokazuju da izlučivanje DcR3 pozitivnoj korelaciji s P-ERK1 /2 razine ekspresije u BGC823 stanica želuca. Važno je napomenuti da je u U0126 skupini, DcR3 razina sekrecije povećava kada je koncentracija lijeka dostigne 40 umol /L; Međutim, specifični mehanizam zahtijeva daljnju istragu. U APDC skupini, DcR3 razina nije se značajno promijenila u koncentracijama većim od 20 umol /L. Slika 6 Ekspresija DcR3 proteina s plazmida smetnji i inhibitora ELISA analize. a: DcR3 Razine ekspresije kod BGC823 kulture supernatant smanjena kada su stanice tretirane sa ERK1 smetnji plazmida. b: Razine ekspresije DcR3 smanjen kada su stanice tretirane sa ERK2 smetnji plazmida. c: DcR3 razine ekspresije smanjen kada su stanice tretirane sa različitim koncentracijama U0126, PD98059 i APDC Pmol /pregled Rasprava pregled Pokazano je da DcR3 gen izražen na niskoj razini u ljudskog embrija, pluća,. mozak, jetra, slezena, želudac, debelo crijevo, limfni čvorovi i leđne moždine, dok je izražen na visokoj razini u raka, kao što su gastrointestinalni rak, hepatocelularnog karcinoma i karcinoma gušterače [1, 12]. pregled, Wu i sur.
[8] je izvijestio da je izraz DcR3 u bolesnika s rakom želuca bila je značajno viša od normalne. DcR3 izraz u dobro diferenciranog karcinoma želuca bila je značajno niža od one slabo diferenciranih uzoraka (P izvoznici < 0,05).
Razinu ekspresije DcR3 je značajno povezana s limfni čvor metastazama i patoloških fazi, ali nije u korelaciji s veličinom tumora, metastatskim status, ili histoloških tipova. Kad su uslijedila se pacijenti za 63 mjeseci, DcR3 prekomjerna ekspresija je utvrđeno da je povezan sa značajno skraćen stopa preživljavanja [13, 14].
Mnogi izvještaji pokazuju da visoka razina ekspresije ERK1 /2 usko povezana s karcinomom dojke, debelog crijeva i rak gušterače, kao i maligni melanom, leukemija i miksom [15-18].
Naše istraživanje je pokazalo da se u bolesnika s rakom želuca, pozitivan učestalosti DcR3 i ERK1 /2 mRNA bila je veća od one u ne- kanceroznih tkiva (p < 0.05). RT-PCR i Western blot je pokazala da je mRNA i proteina nivoi DcR3 i ERK1 /2 u tumorskim tkivima bile su značajno više od onih u tkivima nekanceroznih, sugerirajući da DcR3 i ERK1 /2 razine koreliraju s razvojem tumora, ali ne i s godinama , spol ili diferencijacije (P izvoznici > 0,05).
Naši rezultati pokazuju da je pozitivan učestalost ekspresije DcR3 i ERK1 /2 mRNA i DcR3 i ERK1 /2 proteina podudaraju jedni druge. Rezultati su imunohistokemijski je također pokazalo da se u želučanom tumora, ERK1 /2 vrlo izražena. Pregled, Chen i sur. Pregled, [19] je izvijestio da je pozitivna stopa DcR3 izražavanja bila je 74,4% (32/43) u hepatocelularnog karcinoma, te da postoji značajna korelacija između DcR3 ekspresije i metastaza, kao i pojavljivanja i diferencijaciju.
u želučanom mišjem model, RT-PCR je pokazao da DcR3 mRNA se može detektirati u tumorima od šest dana. ERK1 /2 mRNA i proteina također otkrivene su u tumorima, a razina ERK1 postupno povećavati u želučanim tumora. Nadalje, oni su također su nađeni u srcu, jetri, slezeni, pluća i bubrega želučanog raka životinjskom modelu, ukazuje na to da imaju važnu ulogu u napredovanju tumora. ERK1 /2 mRNA je otkrivena od četiri dana u tumorskim tkivima, a ERK1 mRNA nalazio na dan 10. ERK1 proteina također mogao biti otkriven na četiri dana u tumorskim tkivima, i dalje u porastu svaki dan. ERK1 ostao na stabilnu razinu u srca, jetre i bubrega, ali manji u pluća i slezena na dan 10, nakon što dosegne vrh. ERK2 otkriven je na dva dana u slezeni i tumorskih tkiva. Od četiri dana ERK2 detektirana je u svih šest tkiva, te nastavljeno sve do dana 12. ERK2 se ne može detektirati u srce, pluća i slezene pomoću RT-PCR na dan 12. u životinjskim modelima, ali je razina proteina je mogla razabrati. Ovi rezultati sugeriraju da ERK1 i ERK2 mogu imati različite učinke na pojavu tumora, razvoj i klonalne ekspanzije. Mnoge studije pokazale su da je ekspresija ERK1 /2 mRNA i proteina varira kod različitih tumora i stanica [20, 21]. Neki nedavni izvještaji ukazuju da bi mogla biti u potpunosti suprotno, u nekim slučajevima. Svi autori pročitali i odobrili konačnu rukopis. Pregled

• Mikrornk-206 potiskuje želučane rast stanica raka i metastaza
• Optimalna režim trastuzumab u kombinaciji s oksaliplatin /kapecitabin u prvoj liniji liječenja HER2-pozitivnim napredni rak želuca (CGOG1001): multicentrično ispitivanje faze II suđenje