Merkitys valereseptori 3 (DcR3) ja ulkoisen signaalin säännelty kinaasi 1/2 (Erk1 /2) mahalaukun cancer

merkitys valereseptori 3 (DcR3) ja ulkoisen signaalin säännelty kinaasi 1/2 (Erk1 /2) mahasyövän
Abstract
tausta
Decoy-reseptorin 3 (DcR3), jäsen tuumorinekroositekijän reseptorin (TNFR) superperheen, liittyy kasvaimen vastaisen immuniteetin suppression. Se ilmentyy erittäin monissa kasvaimissa, ja sen ilmentymistä voidaan säädellä MAPK /MEK /ERK signalointireitille. MAPK /MEK /ERK-reitin on raportoitu olevan säädin kasvaimen esiintyminen, kehittäminen ja kloonilaajenemisen. Ulkoinen-signaali säännelty kinaasi (ERK) on elintärkeä jäsen tämän reitin.
Tulokset
ilmentyminen DcR3 ja ERK1 /2 kasvainkudoksissa mahasyövän potilaiden määrä oli merkitsevästi suurempi kuin ei-syöpä (p
< 0,05). Ei ollut tilastollista eroa keskuudessa tuumorikudoksista potilaista, joilla eri-ikäisiä tai sukupuolta, ja jopa eri erilaistumisen (P
> 0,05). Kuitenkin potilailla, joilla on vaiheen I mahasyövän, DcR3 ja ERK1 /2-tasot olivat merkittävästi alhaisemmat kuin potilailla, joilla on edenneessä vaiheessa.
Johtopäätökset
DcR3 ja ERK1 /2 on tärkeä rooli kehitettäessä mahasyövän, ja ne voivat olla uusia merkkiaineita osoittaa tehokkuutta mahalaukun syövän hoitoon tulevaisuudessa.
tausta
Decoy-reseptorin 3 (DcR3) on jäsen, tuumorinekroositekijän reseptorin (TNFR) superperheen. Sen on osoitettu olevan valereseptori Fas-ligandin (FasL), LIGHT ja TL1A [1-3], joka tunnetaan myös nimellä TR6 [4]. DcR3 on useimmiten ilmaistu kasvainsoluissa ja estää kompetitiivisesti TNF signalointi. N yli-ilmentyminen DcR3 kasvainsoluissa suojaa niitä apoptoosin. DcR3 suojaa syöpäsolujen immuunivalvonnalta koska se myötävaikuttaa tukahduttaminen isännän kasvaimen vastaisen immuniteetin.
DcR3-mRNA ja proteiini monistetaan eri pahanlaatuinen kudoksissa, kuten keuhkosyöpä, paksusuolen syöpä, mahasyöpä, ruokatorven syöpä, haima syöpä ja pahanlaatuinen melanooma [1, 5, 6]. Wu et ai.
[7] on raportoitu, että DcR3 ei voitu havaita ei-kasvain potilailla, mutta voidaan havaita 98,8% (82/83) potilailla, joilla on pahanlaatuisia syöpiä.
Tämä ilmiö osoittaa, että kohonnut DcR3 ilmentyminen korreloi merkitsevästi kasvaimen kehittymisen ja syövän etenemiseen. Wu et ai.
[8] kertoi, että DcR3 on erittäin ilmaistu ihmisen mahasyövän (GC), ja korreloi positiivisesti kehittämiseen ja etäpesäkkeet mahavaurioita. Mahalaukun syöpäpotilailla, joilla on korkea DcR3 ilme esitellään kehittyneempi pN2-3 sairaus kuin ne, joilla on alhainen DcR3 ilme.
DcR3 varten FasL saattaa olla mukana etenemistä syöpään. Lisäksi arvioinnin mahdollisista rooleista DcR3 ja asetus DcR3 ilmentymisen pahanlaatuisissa soluissa on erittäin tärkeää kehittää uusia strategioita ohjaamiseksi pahanlaatuisten solujen kasvuun, joka paeta isännän immuunijärjestelmän valvonnan.
Alkuvaiheessa, MAPK /ERK -systeemi aktivoituu kasvaimissa, mikä on merkittävä merkki monenlaisia ​​syöpiä ihmisissä. Viime aikoina useita rivejä näyttö viittasi siihen, että ERK voisi olla parametri ennustamiseksi ennuste erilaisten syöpien, kuten rintasyövän, paksusuolisyövän, haimasyöpä ja kolangiokarsinooma. Wang et ai.
[9] on raportoitu, että ilmaisu ERK1 /2 oli korkea kolangiokarsinooma, joka korreloi TNM vaiheissa.
Kim et ai.
[10] havaitsivat, että LPS-indusoitua DcR3 vapautumista ihmisen suolen epiteelisolujen (IEC), joka näytti olevan aktivaation kautta mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasien (MAPK), kuten ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasi 1 ja 2 (ERK1 /2), ja c-Jun NH2-pään proteiinikinaasin ( JNK). LPS-indusoidun DcR3 vapautumista SW480-soluissa poistettiin ERK1 /2 ja JNK estäjiä. Lisäksi Yang et al.
[11] ilmoitti, että 3 g /ml DcR3 merkittävästi indusoi fosforylaatiota ERK ja p38.
Mukaisesti näistä raporteista, ehdotamme, että DcR3 ja ERK1 /2 liittyvät läheisesti toisiinsa. DcR3-geenit korreloi läheisesti esiintyminen ja kehittäminen monenlaisia ​​kasvaimia. Tässä tutkimuksessa selvitettiin ekspressiotason ja sijainti DcR3 ja ERK1 /2 mahasyövän eri ikäisiä potilaita, sukupuoli, vaihe ja erilaistumista, tutkia suhdetta DcR3 /ERK1 /2 ja mahasyövän esiintyminen ja kehitystä. Lisäksi tarjoamme ehdotuksia kliininen diagnoosi mahasyövistä. Tool Menetelmät
Kliiniset näytteet
Kasvaimet olivat mahasyöpä potilailla, jotka olivat läpikäyneet endoskooppinen biopsia tai parantavaa toimintaa Zhongshan sairaalassa sidoksissa Xiamen yliopisto. Tuumorikudoksista josta DNA ja proteiini eristettiin olivat tuoreista näyte resektio leikkauksen. Kaikki näytteet saatiin potilaan suostumuksella ja hyväksynnän komitean Medical Ethics Zhongshan sairaalan Xiamen University.
Hiiret
Kaikki kokeet suoritettiin käyttäen 6-8 viikkoa nude-hiirten ostettu Model Animal Research Center of Medical College Xiamen University. Kaikki eläimet asutettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa jatkuvasti veden saantia ja Chow. Kaikki kokeelliset menetelmät suoritettiin seuraava hyväksynnän Animal Care ja käyttö komitean Xiamen yliopiston.
Soluviljely
ihmisen mahasyöpä solulinjaa BGC823 pidettiin laboratoriossamme, joka viljeltiin pulloissa Dulbeccon modifioitu Eaglen (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), ja 1% penisilliini-streptomysiinillä 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO2.
Reagenssit
DMEM, FBS: ää ja penisilliini-streptomysiiniä hankittiin Hyclone Corporation (Utah, USA). Hematoksyliini- ja eosiini (H &E) iinianalyysikitissä hankittiin Chemicon International, Inc. (Temecula, CA, USA). ERK1 /2 ja DcR3 Abs ostettiin Santa Cruz Bio tekniikkaa. RT-RCR reagenssit hankittiin TaKaRa (Dalian, Kiina). Alukesekvenssillä syntetisoitiin Sangon (Shanghai, Kiina).
In vivo eläin- kasvainmuodoista
Kasvaimet tuotettiin nude-hiirten lihakseen (im) injektio BGC823 soluja (1,0 x 105 solua 100 ui PBS) osaksi oikeaan kylkeen. Kasvaimen mittaukset muutettiin kasvaimen tilavuus (V), jolla on kaava (L x W2 x 0,52), jossa L ja W ovat pituus ja leveys, vastaavasti. Mittaukset tehtiin mikrometrillä. Kaikki tuumoreita kantavaa hiirtä jaettiin satunnaisesti ryhmiin (2 hiirtä /ryhmä).
RT-PCR: llä ja Western blot-analyysi ilmentymistason tutkimisen DcR3 /ERK
Kokonais-RNA DcR3: n ja ERK1 /2 uutettiin stimuloitiin soluihin käyttäen Trizol. Mitata ERK /DcR3 geenikopiomäärä, DNA tuoreista kasvainnäytteestä analysoitiin RT-PCR. Alku- ja loppupään alukkeita ERK1 mRNA olivat 5'-CCTGCTCATCAACACCACC-3 'ja 5'-CGTAGCCACATACTCCGTCA-3', ja ERK2: n mRNA oli 5'-TCTTCC AGCCCTCCTTCCTG-3 'ja 5'-CGTTTCTGCGCCGTTAGGT-3'. Näytteet denaturoitiin 95 ° C: ssa 4 minuutin ajan, jota seurasi 35 sykliä monistusta (95 ° C, 45 sekuntia; 55 ° C, 45 sekuntia; ja 72 ° C, 60 s). Tuotteet olivat 300 bp ja 400 bp fragmentit vastaavasti. DcR3-mRNA, ylävirran aluke oli 5'GCAAAGCCAAGGATTCCCCCTG -3 'ja alavirran aluke oli 5'-GGCACTGCTCTGAGCTGGAGCTG-3'. Näytteet denaturoitiin 95 ° C: ssa 4 minuutin ajan, jota seurasi 30 sykliä monistusta (95 ° C, 45 sekuntia; 55 ° C, 45 sekuntia; ja 72 ° C, 60 s). Tuote oli 921 bp: n fragmentti.
BGC823 solut kerättiin ja lyysattiin soluhajotuspuskurin (1% (v /v) Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI (pH 8), 1 mM PMSF, 2 g /ml aprotiniini, ja 2 g /ml leupeptiiniä), jotka voivat vapauttaa DcR3: n ja ERK1 /2-proteiineja. Kaksikymmentäviisi mikrogrammaa kokonais-lysaatti fraktioitiin SDS-PAGE: lla ja alistettiin Western blotting -analyysillä käyttämällä anti-ERK tai anti-DcR3-mAb (klooni 3 H5).
Western blotting ja ELISA-määritystä varten ilmentymistason tutkimisen DcR3 /ERK jälkeen estäjät hoidon
BGC823 solujen supernatantit kerättiin eri aikavälein, ja tasot U0126, PD98059, APDC, MEK1 /2 ja ERK1 /2 häiriöiden kvantitoitiin käyttäen kaupallista ELISA, mukaan myyjän ohjeita. Solut, jotka käsitelty ERK1 /2 shRNA (5: 2, 6: 2), U0126 /PD98059 (0 umol /l, 5 umol /l, 10 umol /l, 20 umol /l, 40 umol /l) ja APDC (0 umol /l, 10 umol /l, 20 umol /l, 40 umol /l, 80 umol /l), vastaavasti. Sen jälkeen, kun 5- tai 7-päivän inkubaation, solut altistettiin sytokiinien kuten määrityksessä. Kaksikymmentäviisi mikrogrammaa kokonais-lysaatti fraktioitiin SDS-PAGE: lla ja alistettiin Western blotting -analyysillä käyttämällä anti-ERK tai anti-DcR3-mAb (klooni 3 H5).
Immunohistokemia analyysi ekspression DcR3 ja ERK1 /2
Kasvaimen kudokset fiksoitiin formaldehydi keskipitkällä ja upotettiin parafiiniin. Kohdat 6 mm paksut asetettiin lasilevyille esikäsitelty 0,1% poly-L-lysiini. Sitten ne deparaffinaged xy-Lene, vesi väkevyydeltään etanolia ja liotetaan 3% H 2O 2 10 minuuttia poistaa endogeenisen peroksidaasin. Seuraavaksi levyt upotettiin sitraattipuskurissa (pH 6,0) ja keitettiin 92-98 ° C: ssa mikroaaltouunissa 10 minuutin ajan. Sen jälkeen ne huuhdeltiin 3 kertaa PBS: llä 10 minuuttia kutakin, ja blokattiin 10% normaalia vuohen seerumia PBS: ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Levyjä sitten reagoimaan affiniteettipuhdistetun kanin anti-TR6 Ab (1,67 g /ml) huoneen lämpötilassa 2 tunnin ajan. Pesun jälkeen laseja inkuboitiin biotinyloidulla vuohen anti-kani-vasta-ainetta 10 minuutin ajan. TR6 signaali paljasti streptavidiini-peroksidaasia käyttäen DAB: n mukainen alusta ohjeiden Histostain-Plus -kittiä (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). DcR3 signaaleja paljastuivat ruskea. Lopuksi objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä ja sinetöity vesiliuosta Kiinnitys Media (Zymed).
Tilastollinen analyysi
Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD. Merkityksen erosta ryhmien välillä määritettiin OPISKELIJAN kaksisuuntaisella t-testillä. Todennäköisyyden arvo on vähemmän kuin 0,05 katsottiin merkitseväksi. Kaikki keinot laskettiin vähintään kolmen erillisen kokeen.
Tulokset
Syöpäpotilaat ovat kohonneet DcR3 tasoilla
Tutkia korrelaatio DcR3 ilmaisun ja kasvaimen esiintyminen ja kehittämiseen, kasvaimia 50 mahasyöpäpotilaista kerättiin ja testattiin DcR3-mRNA ja proteiini tasoilla. Kuten on esitetty kuviossa 1 a, 921 bp: n DcR3 bändejä muodostettiin RT-PCR: llä kasvainkudoksessa useimpien potilaiden (36/50), verrattuna ei-syöpä kudoksiin (2/50) samasta elimet näistä potilaista. Nämä tulokset osoittavat, että DcR3-tasot olivat huomattavasti (kahdeksan sattumanvaraisesti kliinisistä näytteistä on esitetty kuviossa 1 a). Edelleen vahvistaa tulostamme, DcR3-proteiinin tasot tutkittiin western blottauksella. Tulokset osoittavat, että DcR3-proteiini voitiin havaita useimmilla syöpäpotilailla; DcR3-proteiini havaittiin 74% (37/50) kasvaimen kudokset, mutta vain 6% (3/50) ja ei-syöpä kudoksissa (taulukko 1 ja kuvio 1 b, kahdeksan sattumanvaraisesti kliinisistä näytteistä on esitetty kuviossa 1b ). Kuva 1: n ilmentyminen DcR3 mahasyövän ja ei-syöpä kudoksia analysoitiin RT-PCR: llä (Figure1a) ja Western-blottauksella (Figure1b). a: Lane M, DNA-markkereita; lanes1-7, kasvain kudosten kaista 8, ei-syöpä kudoksiin; DcR3-mRNA oli positiivinen 36 50 tuumorikudoksista (1-7) ja negatiivinen ei-syöpä kudoksiin (8). b: lanes1-7, kasvain kudosten kaista 8, ei-syöpä kudoksiin. DcR3-proteiini oli positiivinen 37 50 näytettä kasvainkudoksen (1-7), joista vain 3 50 ei-syöpäkudoksiin (8).
Taulukko 1 Analyysi mahasyövän potilailla, joilla on DcR3 ja ERK1 /2 ekspressiota kasvain ja normaaleissa kudoksissa
asiat
Positiivinen numero
Positiivinen aste (%)
kasvain
50
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
36
37
28
72,0
74,0
56,0
ERK1
37
42
36
74,0
84,0
72,0
P
> 0.05
ERK2
32
37
27
64,0
74,0
54,0
ei-syöpä
50
DcR3
2
3
0
4,0
6,0
0
ERK1
6
5
1
12,0
15,0
2,0
ERK2
9
10
3
18,0
20,0
6,0
Expression ERK1 /2 Kliiniset näytteet
tunnistamiseksi molekyylejä, jotka liittyvät DcR3, ilmentymistasojen ERK1 /2, JNK ja p38 testattiin. Huomasimme, että vain ERK1 /2 voitiin havaita kasvaimen näytteissä (tuloksia ei ole esitetty JNK ja p38). ERK1 mRNA havaittiin 74% näytteistä (37/50), ja ERK2: n mRNA: ta havaittiin 64% näytteistä (32/50, taulukko 1 ja kuvio 2a). Proteiinitasolla, ERK1 havaittiin 84% (42/50) ja ERK2: n 74% (37/50) ja kasvainkudoksessa (taulukko 1 ja kuvio 2b). Nämä tulokset osoittavat, että potilailla, joilla on mahalaukun syövän kasvaimia on korkeampi ERK1 /2-positiivinen esiintyminen verrattuna ei-syöpä kudoksiin (P
< 0,05). Oli positiivinen korrelaatio mRNA ja proteiini tasoilla, kuten 42 50 kasvaimen kudokset ERK1 proteiinin taso oli kohonnut, joista 36 tapaukset olivat yhdenmukaisia ​​mRNA ilme. Sen sijaan, ERK1-proteiinin ekspressio havaittiin ainoastaan ​​viisi normaaleissa kudoksissa. Tutkiessaan ERK2, 37 50 tapauksissa kasvaimen kudokset oli positiivinen ERK2-proteiinin ilmentymisen, joista 27 tapauksia olivat yhdenmukaisia ​​ERK2 mRNA: n ekspression, kun taas vain kymmenen tapausta positiivisesti proteiinin ilmentyminen normaaleissa kudoksissa. Kahdeksan sattumanvaraisesti näytteitä on esitetty kuviossa 2. Kuvio 2: n ilmentyminen ERK1 /2 mahasyövän ja ei-syöpä kudoksia analysoitiin RT-PCR: llä (kuvio 2a) ja Western-blottauksella (kuvio 2b). a: Lane M, DNA-markkereita; lanes1-7, kasvain kudosten kaista 8, ei-syöpä kudoksiin; ERK1 ja ERK2 mRNA olivat positiivisia tuumorikudoksissa. b: ERK1 ja ERK2 proteiini oli positiivinen kasvainkudoksissa (1-8).
sijainti ERK1 /2 mahalaukun syöpäpotilailla
Tutkia ERK1 /2 jakelu, kasvaimia 50 potilasta testattiin immunohistokemiallisesti. Tulokset osoittavat, että ERK1 /2 ilmaistiin tuumorin kudosten suurin osa potilaista. ERK1 ekspressio havaittiin sytoplasmassa. ERK2 positiivinen ekspressio havaittiin joissakin kasvainsoluissa (kuvio 3). Kuva 3 sijainti ERK1 /2-proteiinin mahasyövän kudoksissa analysoitiin immunohistokemiallisesti. V: Ohjaus, B: ERK1, C: ERK2.
DcR3 ja ERK1 /2 tasossa korreloivat kasvaimen invaasio, mutta ei iän, sukupuolen tai erilaistuminen
positiivinen ilmaantuvuus DcR3-mRNA kasvainkudoksissa mahalaukun syövän potilaiden oli 72,0% (36/50), ja DcR3 proteiinia 74,0% (37/50), joka oli merkittävästi suurempi kuin ei-syöpäkudokset näytetään vain 4% (2/50) ja 6% (3/50), vastaavasti ( P
< 0,05, taulukko 1). Positiivinen esiintyminen ERK1 /2: n mRNA: n ilmentyminen oli 74,0% (37/50) ja 64,0% (32/50), ja proteiinin ilmentymisen 84,0% (42/50) ja 74,0% (37/50). Molemmat olivat huomattavasti korkeampia kuin ei-syöpä kudoksiin, joka osoittaa 12,0% (6/50) ja 18,0% (9/50), ja 10,0% (5/50) ja 20,0% (10/50), (taulukko 1). Nämä tulokset viittaavat siihen, että DcR3 ja ERK1 /2 ekspressiotasoja korreloivat kasvaimen esiintymiseen ja kehittämiseen.
Taulukoissa 2, 3 ja 4, ei ollut merkitsevää eroa tuumorikudoksista eri ikäisille, sukupuoli ryhmät ja potilailla, joilla on eri erilaistumista vaiheissa mahasyöpä (P
> 0,05). Kuitenkin DcR3 ja ERK1 /2 ekspressiotasot olivat merkittävästi korkeita TNM vaiheen II-IV (taulukko 5). Siten ilmauksia DcR3 ja ERK1 /2 korreloivat kasvaimen invaasio ja TNM-luokitus, mutta ei iän, sukupuolen tai differentiation.Table 2 korrelaatio ilmentymisen DcR3 ja ERK1 /2 iän mahalaukun syöpäpotilailla
tapaukset
Positiivinen numero
Positiivinen aste (%)
≥50
32
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
25
28
21
78,1
87,5
65,6
ERK1
28
31
26
87,5
96,9
81,2
P
> 0.05
ERK2
20
22
16
62,5
68,8
50,0
< 50
18
DcR3
11
9
5
61,1
50,0
27,8
ERK1
13
11
5
72,2
61,1
27,8
ERK2
12
15
6
66,7
83,3
33,3
Taulukko 3 Korrelaatio ilmaisun DcR3 ja ERK1 /2 sukupuoleen mahalaukun syöpäpotilailla
Kotelot
Positiivinen numero
Positiivinen aste (%)
Mies
39
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
29
29
24
74,4
74,4
61,5
ERK1
32
35
28
82,1
89,7
71,8
P
> 0.05
ERK2
26
30
23
66,7
76,9
59,0
Female
11
DcR3
7
8
5
63,6
72,7
45,6
ERK1
9
7
6
81,8
63,6
54,5
ERK2
6
7
4
54,6
63,6
36,4
Taulukko 4 Korrelaatio ilmaisun DcR3 ja ERK1 /2 kasvaimen erilaistumista mahasyöpäpotilaista
asiat

Positiivinen numero
Positiivinen aste (%)
No
9
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
7
7
5
77,8
77,8
55,6
ERK1
7
9
6
77,8
100,0
66,7
P
> 0.05
ERK2
6
7
5
66,7
77,8
55,6
Kohtalaisen
28
DcR3
21
23
20
75,0
82,1
71,4
ERK1
24
24
22
85,7
85,7
78,6
ERK2
19
24
17
67,9
85,7
60,7
Low
13
DcR3
8
7
5
61,5
53.9
38,5
ERK1
10
9
8
76,9
69,2
61,5
ERK2
7
6
5
53,9
46,2
38,5
Taulukko 5 Korrelaatio ilmentymisen DcR3 ja ERK1 /2 pathologic vaiheissa kasvain mahasyöpäpotilaista
TNM
Kotelot

Positiivinen numero
Positiivinen aste (%)
I
6
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
1
1
1
16,7
16,7
16,7
ERK1
2
2
1
33,3
33,3
16,7
P
> 0.05
ERK2
1
1
0
16,7
16,7
0,0
II
17
DcR3
12
13
10
70,6
76,5
58,8
ERK1
14
14
11
82,4
82,4
64,7
P
> 0.05
ERK2
10
12
9
58,8
70,6
52,9
III
25
DcR3
21
21
21
84,0
84,0
84,0
ERK1
23
24
22
92,0
96,0
88,0
P
> 0.05
ERK2
20
23
18
80,0
92,0
72,0
IV
2
DcR3
2
2
2
100,0
100,0
100,0
ERK1
2
2
2
100,0
100,0
100,0
P
> 0.05
ERK2
1
1
1
50.0
50,0
50,0
ekspressiotasot DcR3 ja ERK1 /2 monistetaan eläinmalleissa
Kuten taulukossa 6, kun suonensisäinen BGC823 soluja oikeaan kylkeen nude-hiirten tuumorit kasvoivat joka päivä. RT-PCR: ää käytettiin testaamaan DcR3 ja ERK1 /2-mRNA-tasoja kasvaimissa ja western blot-analyysiä käytettiin tutkimaan proteiinin tasoja. Mahasyövän eläinmalleissa, DcR3, ERK1 ja ERK2 havaittiin hyvin 921 emäsparin, 300 emäsparin ja 400 emäsparin, vastaavasti. Näiden tuumorikudoksissa DcR3-mRNA: n havaittiin alkaen kuudentena päivänä, oli korkeimmillaan päivänä 10, ja pysyi havaittiin päivänä 12. DcR3 havaittiin myös päivästä kuuteen päivään 12 maksassa, kun taas se oli vain havaittu päivänä 12 sydämen ja keuhkojen ( kuvio 4a). ERK1 /2: n mRNA ilmaisuja havaittiin päivästä neljä kasvainkudoksissa, ja ERK1-mRNA saavutti huipun päivänä 10 (kuvio 4a ja taulukko 7) .table 6 paino BGC823 kasvaimen nude-hiirtä (x ± s, n = 6) B- Ryhmä
Δ paino /mg
2 d
4d
6d
8d
10 d
12 d
Normal -
- -
- -
-
Model
0. 47 ± 0. 17 △
0. 77 ± 0. 28 △
1. 01 ± 0. 39 △
1. 43 ± 0. 79 △
1. 65 ± 0. 68 △
1. 46 ± 0. 66 △
Huom △ P
< 0,01 vs
normaali; ** P
< 0,01 vs
malli.
Taulukko 7 DcR3: n ekspressio ja ERK1 /2: n mRNA kasvainkudoksissa eläinmalleissa analysoitiin RT-PCR: llä

2d

4d

6d

8d

10d

12d

DcR3
—
—
+
+
++
++
ERK1
—
+
+
+
++
++
ERK2
—
+
+
+
+
+
Kuva 4 DcR3: n ekspressio ja ERK1 /2 hiiren mallia analysoitiin RT-PCR: llä (kuvio 4a) ja Western-blottauksella (kuvio 4b). a: Lane M, DNA markkeri; lanes1-6, sydämen, maksan, perna, keuhkot, munuaiset ja kasvain kudosten hiirimalleissa neljäntenä päivänä; lanes7-12, joka kahdeksantena päivänä; lanes13-18, kahdentenatoista päivänä; ERK1 mRNA oli positiivinen lane2,8,9,12,14,15,18, ERK2 mRNA oli positiivinen lane1,2,6,9,10,12,13,14,15,17,18. DcR3-mRNA: n havaittiin lane8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 b: kaista 1, sydän; lane2, maksa; lane3, perna; lane4, keuhko; lane5, munuainen; lane6, kasvain kudosten Ilmaisu ERK1 proteiinin lisääntyminen kasvainkudoksissa ajan mittaan, sydämen, maksan ja munuaisten kesti 12 päivää, ilmentymistä ERK2 voitiin havaita pernassa ja kasvaimen toisena päivänä, joka oli positiivinen tuumorikudoksissa asti neljäntenä päivänä ja kaikki viisi elinten kahdentenatoista päivänä. Ilmaisu DcR3-proteiini oli positiivinen kasvain kudosten ja maksa kuudentena päivänä ja perna kymmenentenä päivänä, joka oli negatiivinen sydän-, keuhko-, munuais-, kunnes kahdentenatoista päivänä.
DcR3-proteiini havaittiin päivänä kuusi kasvain kudosten ja maksassa, ja ilmaisu pysyi vuoteen päivänä 12. DcR3-proteiini havaittiin päivänä 10 pernassa ja päivällä 12 sydän, munuainen ja keuhko. ERK1 proteiini havaittiin neljäntenä päivänä kasvaimen kudoksissa, ja kasvu jatkui joka päivä. ERK1 proteiini pysyi vakaana sydämen, maksan ja munuaisten, mutta se laski keuhkoissa ja pernassa päivänä 10, päästyään huippu. ERK2 havaittiin päivänä kaksi pernassa ja kasvaimen kudokset. Päivästä neljä, ERK2 proteiini havaittiin kaikissa kuusi näytettä, ja jatkoivat nousuaan asti päivänä 12. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ERK1 ja ERK2 saattaa olla erilaisia ​​vaikutuksia kasvainten esiintyminen, kehittäminen ja kloonilaajenemisen.
DcR3 ilmaisu väheni jälkeen estämällä ilmaus tai fosforylaatio ERK1 /2 BGC823 soluissa
vaikutuksen tutkimiseksi ERK1 /2 ilmaisun ja fosforylaatio DcR3 ilmaisun, BGC823 soluja käsiteltiin ERK1 /2 shRNA tai inhibiittorit, jotka nimenomaan säädellä ERK-reitin. Western blot-analyysi vahvisti, että inhibiittorit tehokkaasti estetty fosforylaation MEK /ERK-reitin molekyylejä, ja että shRNA vähensi merkittävästi ilmentymistä ERK1 /2 (kuvio 5). Kuten on esitetty kuviossa 5A, kun BGC823 soluja käsiteltiin ERK1 /2 shRNA, ERK1 /2 ja P-ERK1 /2 tasoa laski verrattuna kontrolliin. Kuva 5 Ilmaisu ERK1 /2 ja P-ERK1 /2 in BGC823 solulinjassa plasmidilla häiriöitä ja inhibiittori havaittiin Western blottauksella. a: Ilmaus tasot ERK1 /2 ja P-ERK1 /2 väheni kontrolliin verrattuna. 1) kontrolliryhmä; 2) 5: 2 (plasmidi: reagenssi); 3) 6: 2 (plasmidi: reagenssi). b: ERK1 /2-fosforylaation laskivat vähitellen, kun pitoisuudet inhibiittoria U0126, PD98059 lisääntynyt, mutta yhteensä ERK1 /2-proteiinin ilmentymisen juurikaan muuttunut. 1) 0 mikromol /l; 2) 5 umol /l; 3) 10 mikromol /l; 4) 20 mikromol /l; 5) 40 mikromol /l. c: ERK1 /2-fosforylaation laskivat vähitellen, kun pitoisuudet inhibiittoria APDC. 1) 0 mikromol /l; 2) 10 mikromol /l; 3) 20 mikromol /l; 4) 40 mikromol /l; 5) 80 mikromol /l. d: PD98059 voi tietenkin estää MEK1 /2 fosforylaation tasolla, mutta se ei ole muutettu MEK1 /2 tai NF-KB: n ekspressiotasot. 1) 0 mikromol /l; 2) 5 umol /l; 3) 10 mikromol /l; 4) 20 mikromol /l; 5) 40 umol /l.
U0126 on erittäin tehokas MEK-inhibiittori, jolloin eston ERK-fosforylaation, samoin PD98059. ERK-fosforylaation vähitellen laski, kun pitoisuudet huumeiden lisääntynyt, vaikka koko ERK1 /2-proteiinin ilmentymisen juurikaan muuttunut (kuvio 5B).
APDC voi estää NF-KB-solujen aktivaation eri soluja. Läpi hajoamisen IKB, APDC voi vähentää translokaatiota NF-KB: n, mikä estää NF-KB: n aktivaation. Kuten kuviossa 5 C, eri pitoisuuksia APDC, muuttamalla taso NF-KB: n inhibitio voi merkittävästi heikentää ERK1 /2-fosforylaation tasoa. Kuitenkin spesifinen mekanismi vaatii lisätutkimuksia.
Vaikutuksen tutkimiseksi näiden estäjien ja shRNA on DcR3 ilmaisun käytimme ELISA-analyysi, joka osoitti, että eritetyn DcR3 supernatantissa laski sen jälkeen, kun eri hoitoja (kuvio 6). Tilastollinen analyysi osoitti, että DcR3 erityksen tasot olivat merkittävästi toisistaan ​​kokeen ryhmien ja kontrolliryhmien (P
< 0,05). Kuten on esitetty kuviossa 6, häiriöitä ERK1 /2 BGC823 soluissa vähensivät DcR3-proteiinin ilmentymisen verrattuna kontrolliryhmään. Suuntaus vastaa ERK ilmentymistaso kuviossa 5 ja osoittaa, että molemmat korreloivat positiivisesti. Lisäksi DcR3: n ja P-ERK ekspressiotasot laskivat, kun soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla U0126, PD98059 ja APDC. Nämä tiedot osoittavat, että eritystä DcR3 korreloi positiivisesti P-ERK1 /2 ekspressiotasot BGC823 mahalaukun soluissa. On syytä huomata, että U0126 ryhmässä, DcR3 sekreetiotasot lisääntyi, kun lääkepitoisuus saavutettiin 40 mikromol /l; kuitenkin erityinen mekanismi vaatii lisätutkimuksia. Vuonna APDC ryhmässä, DcR3 tasot eivät muuttuneet merkittävästi pitoisuuksilla yli 20 mikromol /l. Kuva 6 ilmentyminen DcR3-proteiinin plasmidilla häiriöitä ja estäjä ELISA analyysi. a: DcR3 ekspressiotasot BGC823 kulttuuri supernatantti vähenee, kun solut käsiteltiin ERK1 häiriöitä plasmidi. b: DcR3 ekspressiotasot laskivat, kun soluja käsiteltiin ERK2 häiriöitä plasmidi. c: DcR3 ekspressiotasot laskivat, kun soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla U0126, PD98059 ja APDC umol /l.
Keskustelu
On osoitettu, että DcR3-geeni ilmentyy alhaisella tasolla ihmisalkion, keuhko-, aivot, maksa, perna, vatsa, paksusuoli, imusolmukkeiden ja selkäytimen, kun se ilmentyi korkealla tasolla syöpien, kuten mahasyövän, maksasyövän ja haimasyövän [1, 12].
Wu et al.
[8] on raportoitu, että DcR3: n ekspressio mahasyöpäpotilaista oli merkittävästi korkeampi kuin normaalisti. DcR3 ilmentymisen hyvin erilaistunut mahasyövän oli huomattavasti alhaisempi kuin huonosti eriytetty yksilöt (P
< 0,05).
DcR3 ekspressiotaso oli merkitsevästi yhteydessä imusolmuke etäpesäke ja patologinen vaiheessa, mutta ei korreloinut kasvaimen koon, metastaattinen tilan tai histologisia tyyppejä. Kun potilaita seurattiin 63 kuukautta, DcR3 yliekspressio havaittiin liittyvän merkitsevästi lyhentää eloonjäämisaste [13, 14].
Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että korkeat ekspressiotasot ERK1 /2 korreloi läheisesti rinta-, paksusuolen ja peräsuolen ja haimasyövän, sekä pahanlaatuinen melanooma, leukemia ja myksoomarokkovirusten [15-18].
Tutkimuksemme osoitti, että potilailla, joilla on mahalaukun syövän, positiivinen ilmaantuvuus DcR3 ja ERK1 /2-mRNA oli korkeampi kuin ei- syöpäkudoksiin (P < 0,05). RT-PCR ja Western blotting osoitti, että mRNA ja proteiini ekspressiotasot DcR3 ja ERK1 /2 kasvainkudoksissa olivat merkittävästi korkeampia kuin ei-syöpä kudoksiin, mikä viittaa siihen, että DcR3 ja ERK1 /2 tasossa korreloivat kasvaimen kehitystä, mutta ei iän , sukupuoleen tai erilaistumiseen (P
> 0,05).
Tuloksemme osoittivat, että positiivinen esiintyvyys ilmaisun DcR3 ja ERK1 /2 mRNA ja DcR3 ja ERK1 /2-proteiinin sovitettu toisiaan. Immunohistokemia Tulokset osoittivat myös, että mahalaukun kasvaimet, ERK1 /2 oli erittäin ilmaistiin.
Chen et al.
[19] ilmoitetaan, että positiivisten määrä DcR3 ilmaisun oli 74,4% (32/43) maksasolukarsinoomassa, ja että oli merkittävä korrelaatio DcR3 ilmaisun ja etäpesäke sekä toistuminen ja erilaistumista.
hiiren mahan malli, RT-PCR osoitti, että DcR3-mRNA voitiin havaita kasvaimia kuudentena päivänä. ERK1 /2 mRNA ja proteiini havaittiin myös kasvaimissa, ja ERK1 tasot vähitellen lisääntynyt mahalaukun kasvaimet. Lisäksi ne havaittiin myös sydän, maksa, perna, keuhkot ja munuainen mahalaukun syövän eläinmallissa, mikä viittaa siihen, että niillä on tärkeä rooli syövän etenemiseen. ERK1 /2 mRNA: ta havaittiin päivästä neljään kasvainkudoksissa, ja ERK1 mRNA saavutti päivänä 10. ERK1 proteiini voitiin havaita myös neljäntenä päivänä kasvaimen kudoksissa, ja jatkoi kasvuaan päivittäin. ERK1 pysyi vakaana sydämen, maksan ja munuaisten, mutta se laski keuhkoissa ja pernassa päivänä 10, päästyään huippu. ERK2 havaittiin päivänä kaksi pernassa ja kasvaimen kudokset. Päivästä neljä, ERK2 todettiin kaikissa kuudessa kudoksissa, ja jatkoivat nousuaan asti päivänä 12. ERK2 ei voitu havaita sydän-, keuhko- ja pernan RT-PCR päivänä 12 eläinmalleissa, mutta proteiinin tasot voitiin havaita. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ERK1 ja ERK2 saattaa olla erilaisia ​​vaikutuksia kasvainten esiintyminen, kehittäminen ja kloonilaajenemisen. Useat tutkimukset osoittivat, että ilmentyminen ERK1 /2 mRNA ja proteiini vaihtelee eri kasvaimissa ja solujen [20, 21]. Jotkut viimeaikaiset raportit ehdotti, että he voisivat olla täysin päinvastainen joissakin tapauksissa. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• MicroRNA-206 estää mahalaukun syöpäsolujen kasvua ja etäpesäkkeiden
• Optimaalinen hoito Trastutsumabin ja oksaliplatiinin /kapesitabiinilla ensilinjan hoitoon HER2-positiivisten edennyt mahasyöpä (CGOG1001): monikeskustutkimus, vaiheen II tutkimus