Host celic invazijo in ustne okužba s Trypanosoma cruzi sevi genskih skupin TCI in TcIV iz chagasic patients

Host celični invaziji in ustne infekcije s Trypanosoma cruzi
sevi genskih skupin TCI in TcIV iz chagasic bolnikov
Abstract
Ozadje
izbruhov akutnih bolezni Chagas z oralnim okužbo so pogosto poročali v zadnjih desetih letih, z večjo pojavnostjo v severni Južni Ameriki, kjer Trypanosoma cruzi
rodu TCI prevladuje, ki so odgovorni za glavni vzrok oživlja bolezni pri ljudeh in majhen odstotek je opredeljena kot TcIV. Mehanizmi peroralne okužbe in gostitelj celic invazije s temi paraziti so slabo razumemo. Za reševanje tega vprašanja, smo analizirali T. cruzi
sevov izoliranih iz chagasic bolnikov v Venezueli, Gvatemali in Braziliji.
Metode
Trypanosoma cruzi
metacyclic trypomastigotes so ustno vcepimo v miši. Želodec miš zbrali štiri dni kasneje, kot tudi želodec in srce zbrali 30 dni po infekciji, so bili obdelani za histološko analizo. Testi za posnemanje parazit migracije skozi želodčne sluzi plasti so bile izvedene s štetjem parazite zapeljeta želodčne-mucin obložene transwell filtrov. Za celično invazijo teste, so bili človeški epitelnih HeLa celice inkubirana z metacyclic oblikah in je prešteti število ponotranjenih parazitov.
Rezultati
Vse TCI in TcIV T. cruzi
sevi so slabo kužen po oralni poti. Paraziti so bili bodisi neopazna ali pa so bili odkriti v majhnem številu v želodcu miške štiri dni po peroralni uporabi. Posnema paraziti so našli v želodcu in /ali v centru 30 dni po okužbi. V primerjavi z TCI rodu, sposobnost migracije TcIV paraziti z želodčno mucin obložene filtra je bila višja, vendar nižja od tiste, ki jo TcVI metacyclic oblikah je že pokazala, da so zelo kužni oralno razstavljena. Izražanje pepsin odporna gp90, molekule površine, ki zmanjša število celic invazijo, je bila višja v TCI kot TcIV parazitov, in zato je bila invazija zmogljivost TcIV oblik metacyclic višje. Gp90 molekule spontano sprosti s TCI oblike metacyclic zaviral vstop parazit v gostiteljske celice. TCI paraziti razstavljena nizko znotrajcelično stopnjo replikacije.
Sklepe
Naše ugotovitve kažejo, da je slaba zmogljivost TCI rodu, in v manjši meri v TcIV paraziti, vdrla v želodcu epitelija po peroralni okužbi miši lahko povezana z neučinkovitostjo od metacyclic oblik, zlasti iz TCI parazitov, da migrirajo skozi želodčne sluzi plasti, napadel epitelne celice ciljne in znotrajcelično posnemati.
Ključne besede
Trypanosoma cruzi
TCI in TcIV rodovi Metacyclic trypomastigotes Oral okužba Host mobilni invazija Ozadje
izid infekcije s Trypanosoma cruzi
, zastopnik Chagas bolezni, se lahko zelo razlikujejo: 20-30% kronično okuženih bolnikih pojavi huda miokarditis, spremembe prebavnega trakta (megaesophagus in /ali megakolon) pojavljajo manj pogosto, medtem ko je večina še vedno asimptomatsko za življenje. Genetska ozadja in imunološki status gostitelja kot tudi heterogenost populacije parazitov lahko prispeva k temu raznolikosti [1] in eventuelno poti okužbe in infekcijskega odmerka. Glede na znotraj vrst nomenklature s sedežem v letu 2009, so T. cruzi
sevov razdeljeni v šest ločenih tipkanje enot (DTUs), TCI-TcVI [2]. V državah severno od Južne Amerike in v regiji Amazon, kjer so megaesophagus in megakolonom redki in chagasic kardiomiopatija je običajno, TCI je prevladujoča zastopnik Chagas bolezni, v nasprotju z TCII, ki so ga izolirali iz večini bolnikov v brazilski osrednji vzhodni regiji kjer je T. cruzi
okužbe običajno povezana z mega sindromi [1, 3]. TCI je bilo poudarjeno kot glavni vzrok oživlja bolezni pri ljudeh v severni Južni Ameriki, na podlagi genotipizacije za reševanje v majhnem merilu na geografsko porazdelitev, z velikim ploščo polimorfnih markerjev mikrosatelitskih [4]. V zadnjih letih, so poročali izbruhi akutne bolezni Chagas po peroralni okužbi v Venezueli [5, 6], Kolumbiji [7, 8] in v brazilskem Amazon [9, 10], kjer je TCI prevladuje in majhen odstotek je bil opredeljeni kot TcIV.
Metacyclic trypomastigotes so vpleteni v zgoraj navedenih primerih oralno T. cruzi
okužbe. Na podlagi prisotnosti amastigote gnezda v oddelkih želodčne sluznice, vendar brez dokazov za T. cruzi
invazije v orofarinksa ali požiralniku živali izpodbijanih oralno-žuželk izvira metacyclic oblik, je bila invazija želodčne sluznice epitela predlagal, da bi edinstven portal za vnos sistemsko okužbo T. cruzi
[11]. Poskusi z TCII in TcVI sevov iz chagasic bolnikov so pokazale, da se metacyclic fazi specifične površinske molekule gp82 in gp90, ki deluje kot promotor in zaviralec ciljne celice invazije, oziroma [12, 13], igra osrednje vloge v peroralni okužbi [14, 15]. Gp82, ki selektivno veže na želodčne mucin [16], je zelo ohranjena med gensko različno T. cruzi
linij [17] in je odporen na prebavo, ki ga pepsin pri kislem pH, medtem ko se gp90 izooblike z diferencialno občutljivostjo za čira na prebavo lahko izrazimo v različnih sevov, da je visoka ali nizka okužbe z zaužitjem povezana z izražanjem pepsinom občutljive ali pepsinom odporna proti gp90 izooblike [14, 15]. Ali taka raznolikost gp90 izražanja in ustni kužnosti je tudi v TCI in TcIV DTUs treba še raziskati. Ni podatkov o eksperimentalni oralno okužbo s temi paraziti, razpoložljivi podatki se nanašajo na miših vbrizgali kri trypomastigotes ali metacyclic obrazcih, ki jih je intraperitonealni način [18], ki je nenaravna način okužbe. Tukaj smo analizirali metacyclic trypomastigotes iz TCI in TcIV sevov izoliranih iz chagasic bolnikov v različnih geografskih regijah, kar zadeva gp82 in gp90 izražanja, sposobnost za selitev skozi želodčne mucin plasti in vdor želodčne sluznice epitelija po peroralni aplikaciji na miših. Za pojasnitev mehanizmov parazitov invazije, in vitro
mobilni invasion teste smo izvedli s pomočjo epitelijskih celic človeških. Kot površinski antigeni spontano odcepi od trypomastigotes tkivno kulturo izhaja [19], so poročali, da igrajo vlogo pri T. cruzi
okužbe [20], smo pregledali, ali so bile površinske molekule sprosti metacyclic oblikah in pod vplivom celic invazijo gostitelja.
metod
Paraziti in celične invazije gostitelj test
Trypanosoma cruzi
seve od Trypanosomatid Culture Collection (TCC), Oddelek za parazitologijo, Universidade de Sao Paulo, so sami pripravili dr Marta MG Teixeira. Bili so izolirani od chagasic bolnikov v različnih geografskih območjih: TCC: 28 (Amazon, Brasil) TCC: 515 (Venezuela), TCC: 588 (Gvatemala), TCC: 1522 (Paraíba, Brasil) TCC: 1434 (Amapá, Brasil ). Sevov 28, 515, 588 in 1522 so bili TCI in seva 1434, izolirano od posameznika okužene po oralni poti, je TcIV. Kot kontrolo smo CL sev (TcVI) uporablja v več poskusih. Paraziti so se ciklično ohranila pri miših in jeter infuzijo triptozi mediju. Za spodbujanje diferenciacije, so paraziti zrasla za en prehod v TC100 (Vitrocell, Brazilija) ali mediju Grace (Invitrogen) in metacyclic oblike so očistimo s prehodom skozi DEAE-celulozne kolone, kot je opisano v [21]. HeLa celice, so epitelne celice človeških-karcinoma izvira, smo gojili pri 37 ° C v minimalni esencialni medij Dulbeccovem (DMEM), dopolnjenem z 10% fetalnega telečjega seruma (FCS), streptomicin (100 ug /ml) in penicilin (100 U /ml) v navlaženi 5% CO 2 atmosferi. Celično invazijo teste smo izvedli, kot je opisano drugje [22], s sejanjem prečiščene metacyclic trypomastigotes na vsako vdolbino 24 vdolbinami, ki vsebuje 13 mm premera okrogle steklene coverslips premazan s 1,4 x 10 5 HeLa celice, bodisi v DMEM z 10 % FCS (D10) ali v PBS ++ (PBS, ki vsebuje na liter: 140 mg CaCl 2, 400 mg KCI, 100 mg MgCl 2.6H 2O, 100 mg MgSO 4.7H 2O, 350 mg NaHCO 3). Po 1 h inkubaciji s paraziti, so podvojeni coverslips določen v raztopini Bouin, obarvane z Giemsa in zaporedno dehidrirali v acetonu, stopenjsko serija acetona: Ksilol (9: 1, 7: 3, 3: 7) in Ksilol. Število znotrajceličnih parazitov je všteta v skupno 250 celic.
Ustni okužbo
, so bili uporabljeni pet do šest tednov stare samice BALB /c miši, ki so gojene v objektu živali na Universidade Federal de Sao Paulo. Vsi postopki in poskusi, skladna z ureditvijo institucionalnega etični odbor za poskuse na živalih, in študija je odobril odbor (Protokol št 0234/12). Miši so bile okužene z T. cruzi
metacyclic oblike z zaužitjem (5 x 10 7 paraziti v 0,1 ml PBS na žival) s pomočjo 1 ml brizgo z gavaža iglo, ki je bila vstavljena v ustih živali. Za odkrivanje parazitov v želodčne sluznice epitela je bil želodec miši inokuliranih oralno metacyclic oblikami zbrali 4 dni po infekciji, določen z 10% nevtralnega formaldehida za 24 h. Po predelavi s postopnim dehidracije stopenjski seriji raztopino etanola, sledi ksilen potapljanjem in vključitvijo v parafin, so serijske 5 mikrometrov odseki tkiva cut in obarvali s hematoksilinom in eozinom. V drugi seriji eksperimentov so metacyclic oblike podana ustno na miših (1 × 10 6 paraziti v 0,1 ml PBS na žival) in se začne na dan 10. post-inokulacijo, parazitemija so spremljali dvakrat na teden, ki jih preučuje 5 vzorcev ul krvi zbrani od repa na fazno kontrastnim mikroskopom. Na 30-dnevnem obdobju po okužbi, so želodec, srce in jetra zbirajo in obdelujejo za histoloških preparatov, kot je opisano zgoraj.
Vsebnost parazitnih migracije skozi želodčne mucin sloj
polikarbonatne transwell filtri (3 um pore, premera 6,5 ​​mm , Costar) prekrijemo s 50 ul pripravka, ki vsebuje 10 mg /ml želodčne mucin v vodi. Metacyclic oblike, suspendirane v 600 ul PBS, dodamo na dno 24-vdolbinami (1 x 10 7 parazitov /vdolbinico), so bile-mucin obložene transwell filtri postavi na vrtinah, ki vsebuje parazitom in 100 ul PBS bilo dodamo k filtrirni komori. Po 30 minutah in /ali 1 h inkubacije pri 37 ° C, smo 10 ml vzorce zberemo iz filtrirne komore za parazitsko štetje.
Pretočna citometrija in posredne imunofluorescenca testi
živo metacyclic trypomastigotes (1 x 10 7 ) inkubiramo na ledu 1 h z monoklonsko protitelo 3 F6 ali 1G7, usmerjenim oziroma do metacyclic stadiju specifične površinske molekule gp82 ali gp90. Zatem so paraziti pritrjen s 4% para-formaldehida v 20 min. Po izpiranju v PBS, so paraziti inkubirana z Alexa Fluor 488-konjugiranega anti-IgG 1 uro pri sobni temperaturi in številom fluorescentnih parazitov je bila ocenjena z BD AccuriTM C6 pretočnim citometrom. Kontrolo parazitov inkubiramo le sekundarnega protitelesa. Za vizualizacijo HeLa celične lizosome, coverslips s smo adherentne celice inkubiramo 1 uro pri 37 ° C v D10 ali PBS ++ ali inkubiramo s paraziti v D10 za 1 h. Po posnetka s 4% p-formaldehida v PBS 30 minut, smo celice obdelali s 50 mM NH 4Cl v PBS 30 minut in sprali v PBS. Celice smo nato inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi z miško anti-humani LAMP2 razredčenega 1: 8 (vol /vol) v raztopini PBS, ki vsebuje 0,15% želatine, 0,1% natrijevega azida in 1% saponina (PGN-saponina). Po izpiranju v PBS, so coverslips inkubiramo 1 uro z Alexa Fluor 568-konjugiranim anti-mišji IgG (Invitrogen), razredčili 1: 300 v PGN, saponin, ki vsebuje 500 ng /ml phalloidin-FITC in 10 g /m DAPI (4 ', 6'-1-diamino-2-phenylindole dihidroklorid), čemur sledi izpiranjih v PBS in naknadno vgradnjo coverslips v podaljšali Gold (Invitrogen). Konfokalni slike so bile pridobljene v Leica TCS SP8 lasersko skeniranje mikroskopom (Leica, Nemčija) z uporabo Plan-Apochromat 63x cilj je Potopitev v olje (številčna zaslonke 1.4). Serija slik, pridobljen iz konfokalnim z-nizov smo obdelali in analizirali z Leica LAS AF (Leica, 2012, Nemčija) in programske opreme IMARIS (Bitplane).
Priprava parazitsko kondicioniranega medija
oblik Metacyclic (10 8) inkubiramo pri 37 ° C za 1 uro pri 100 ul popolna D10 medij, hranili odvzeta PBS ++ ali PBS. Po centrifugiranju smo pelet zavrgli in supernatant (pogojene medij) zberemo. Za uporabo v celici invazije teste ob bila pogojena medij razredčimo v razmerju 1: 100 v D10 ali PBS ++ in zahodni blot 10 ml je bil naložen
proizvodnjo in čiščenje rekombinantnega gp82 beljakovin
rekombinantnega proteina, ki vsebuje. celovečerni T. cruzi
gp82 zaporedje (GenBank osnovno TM podatkov, dostopno številko L14824) v okvirju z gluthatione s-transferaze (GST), je bil izdelan v E. coli
DH5-a in čistimo, kot je podrobnega drugje [23].
Statistična analiza
testa t
študenta, kot se izvaja v GraphPad programska oprema (verzija 6.01), je bil zaposlen.
Rezultati
Oral okužbo miši s T. cruzi
metacyclic oblike
sposobnost TCI parazitov, da okužijo miši oralno bila preučena v nizu poskusov. Štirideset miši ločimo v 8 skupinah po pet živali. V eni seriji eksperimentov, namenjenih preverjanju invazijo želodčnega epitela z metacyclic trypomastigotes smo uporabili 4 skupine in vsaka skupina petih miši je prejela drugo parazit sev (5 x 10 7 paraziti na žival). Štiri dni po oralnem dajanju, je želodec miši zbirajo in obdelujejo pri histoloških preparatov. Visoko število parazitov je bila uporabljena v tem primeru, ker v predhodnih študijah z TCI seva G, od divjega prenosnega cikla, smo ugotovili, da tudi z visokim inokulum zelo malo amastigote gnezdi, ki ustrezajo intracellulary razmnoževati amastigotes bili odkriti na 4 dan po ustni okužbe. Kljub velikemu inokuluma nismo mogli odkriti amastigote gnezda z mikroskopsko analizo histoloških odsekov želodca (tabela 1). Drugi sklop poskusov je bila izvedena za ugotavljanje, ali obstaja kakšna razlika v tkivni tropizem med T. cruzi
sevov. Za ta namen smo uporabili preostali 4 skupine in vsaka skupina petih miši je prejela drugo parazit sev (1 x 10 6 paraziti na žival) Sledila in potek okužbe za 30 dni. Začetkom na dan 10, so bile koncentracije parazitemijo dvakrat spremljajo na teden, in na dan 30. želodcu, zberemo srce in jetra za histološko analizo. V tem primeru je bil inokulum manjši, ker smo obrazloženo, da bi amastigote gnezda se po več krogih celične invazije in intracelularno replikacijo zaznati. Parazitemija je nezaznavno ves čas opazovanja toda infekcija je bil potrjen v vseh skupinah z odkrivanjem amastigote gnezda v želodcu in /ali v srcu miših (tabela 1), vendar ne v jetrih. Omeniti je, da je v želodcu miši, okuženih s sevom 1522, ki izhaja iz kronično chagasic bolniku z odpovedjo končni fazi popuščanja [24] so paraziti najdemo v srcu, vendar ne v želodcu, medtem ko nasprotno velja za okužbo s sevom 28 (tabela 1). Amastigote gnezda so bili prisotni v velikem številu v želodcu nekaterih miših, okuženih s sevom 28 ali 588 (tabela 1), verjetno izhaja iz več krogov invazije in znotrajcelično replikacije v želodcu epitela. Dejstvo, da so paraziti niso bili odkriti v želodcu miške na 4. dan po peroralni uporabi, vendar le v kasnejši časovni točki, ko znotrajceličnih ciklov podvajanja predlagal bodisi neučinkovito migracije metacyclic oblik skozi sluzi plasti, neučinkovita invazijo epitelnih celic ciljnih in /ali znotrajcelični parazit razmnoževanje. Poleg sevov TCI, smo pregledali eno TcIV sev, 1434, izhaja iz oralno okuženega bolnika. Amastigote gnezda, v manjšem številu, so odkrili pri 3 miši na 4. dan po infekciji v histoloških delih želodcu, ampak paraziti niso bile ugotovljene v želodcu ali v centru 30 dni po okužbi (tabela 1). Parazitemija je bil negativen v celotnem poteku okužbe 30 dni. Pozitivna hemoculture potrjena okužba z vsemi sevi. Histološki preparati so bile pregledane tudi prisotnost vnetnih procesov. Ne glede na sev parazitov so vnetna žarišča komaj zaznaven v želodcu na dan, 4 ali 30 post-infekcijo, ali v srcu na dan 30.Table 1 ustni okužbo miši s metacyclic oblikami T. cruzi
strainsa
T. cruzi
sev
(izvora)
Mouse
Amastigote gnezda (število oddelkov tkivo)
želodca (4. dan)

Želodec (30. dan)
Heart (30. dan)
28
(Brazilija Amazon)
1
0 (20)
0 (20)
0 (20)
2
0 (20)
60 (20)
0 (21)
3
0 (20)
285 (20)
0 (20)
4
0 (20)
11 (18)
0 (23)
5
0 (20)
NDB
0 (20)
515
(Venezuela)
1
0 (21)
0 (24)
0 (20)
2
0 (19)
0 (13)
0 (25)
3
0 (20)
0 (21)
0 (23)
4
0 (20)
45 (11)
0 (21)
5
0 (20)
5 (21)
0 (24)
588
(Gvatemala)
1
0 (09)
31 (19)
10 (21)
2
0 (12)
17 (18)
0 (20)
3
0 (09)
6 (20)
3 (15)
4
0 (12)
87 (19)
0 (19)
5
0 (16)
990 (20)
0 (16)
1522
(Brazilija Northeast)
1
0 (16)
0 (17)
0 (20)
2
0 (19)
0 (15)
4 (20)
3
0 (20)
0 (17)
0 (20)
4
0 (21)
0 (20)
6 (20)
5
0 (21)
0 (16)
4 (18)
1434
(Brazilija Amazon)
1
5 (40)
0 (18)
0 (20)
2
3 (40)
0 (24)
0 (20)
3
0 (36)
0 (20)
0 (20)
4
0 (35)
0 (20)
0 (21)
5
5 (40)
0 (20)
0 (21)
aMetacyclic oblike označenih zajedavcev sevov je bila dana ustno na miših. V enem poskusu, miši prejela 5 × 107 parazitov in 4 dni kasneje je bil želodec, zbranih za histoloških preparatov. V drugem poskusu, miši prejel 1 x 106 parazitov in 30 dni kasneje so želodec in srce zberejo za histoloških preparatov
b ND ne
določena
migracije T. cruzi
metacyclic oblik skozi želodca mucin sloj
preizkus za posnemanje parazit translokacijo skozi sluzi plasti v želodcu smo izvedli s pomočjo transwell filtrov prevlečene z želodčno mucin, ki je glavni makromolekularna sestavina sluz. Prejšnje študije so pokazale, da TcVI oblike metacyclic, ki učinkovito napadejo želodca epitelija ko damo oralno v miši, prečkanje želodčne-mucin obložene transwell filter tako učinkovito kot nov filter in ta lastnost je povezana z izražanjem pepsinom odpornim g82 molekule, ki selektivno veže na želodcu mucin [16, 25]. Želodca-mucin obložene transwell filtri so postavljeni na vrhu vrtin, ki vsebujejo metacyclic oblike. Po 30 do 60 minutah inkubacije pri 37 ° C smo prešteti število parazitov, ki doseže zgornjo komoro. TCI paraziti prikazana zmanjšana sposobnost migrirajo skozi želodčne mucin plasti, v primerjavi z obremenitvijo CL (TcVI), ki je služil kot nadzor (sl. 1a), ki potrjuje, da je v želodcu mucin delovala kot ovira za migracije. Metacyclic oblike TcIV seva 1434 vodi tudi želodčne-mucin obložene filtri bolj učinkovito kot TCI paraziti, vendar še vedno na nižjih stopnjah kot CL seva (sl. 1a). Proučili smo izražanje gp82 in njegovo odpornost na pepsina v TCI in TcIV sevov. Metacyclic oblike obdelujemo 1 uro z 2 mg /ml pepsina v raztopini citrata pri pH 3,5, kar je pogoj, da je v veliki meri poslabšanih BSA (sl. 1b) in detergent topne ekstrakte smo analizirali z Western blot, skupaj z nezdravljenimi paraziti, z uporabo monoklonskih protitelesa (mAb) 3 F6 usmerjen na gp82. Pred reakcijo z mAb 3 F6, je bila enaka obremenitev vzorcev parazitskimi preveriti rdeče-S barvanjem (Dodatni datotek 1: Slika S1A). Izražanje gp82, ki je ohranila nedotaknjena po zdravljenju pepsin, je bila podobna v vseh sevov, očitno na nekoliko višjih ravneh seva 1434 kot v sevov TCI (sl. 1b). Saj bi to lahko pojasni višjo migracije sposobnost seva 1434, smo primerjali gp82 izražanje tega seva s tistim CL sev, ki učinkovito vodi želodčno-mucin obložene filter (sl. 1a). Gp82 izraz je bil primerljiv v 1434 in sevov CL (Dodatni datotek 1: Slika S1B zgornja ploskev). Prisotnost gp82 molekul na površini parazitov je potrdil pretočna citometrija analizo (sl. 1c). Da bi še dodatno preučiti, ali sev 1434 izrazil višje gp82 ravni kot sevi TCI, je blot analiza Western ponovimo seva 515 kot predstavnik TCI rodu. MT vzorci dveh sevov, pripravljene na isti dan in elektroforezo v istem SDS-PAGE gelu, je pokazala podoben profil (Dodatne datoteke 1: Slika S1C). Iz vseh teh podatkov in dodatnih FACS analizo dveh sevov, ki kažejo nekoliko višje gp82 ravni v sevu 1434 (Dodatni datoteka 1: Slika S1D), ni mogoče sklepati, da je relativna učinkovitost sev 1434 metacyclic oblik pri prehodu skozi želodca mucin plast je posledica diferencialno izražanje gp82. Kot je T. cruzi
znano, da spontano javnost površinske molekule [19, 20, 26],-parazit skladišče molekule lahko odgovoren tudi za opaženih učinkov. Preverili smo, ali je gp82 odcepi v medij med 1 h inkubacije pri PBS, pogoj, ki se uporablja v želodčnem mucin migracij testom. Western blot analiza supernatanta po odstranitvi parazitov, ki so pridobljeni kot je opisano v poglavju metode, je pokazala, da obremeni 515 in 1434 shed velike količine gp82, v nasprotju s CL sev, ki se sprošča gp82 na komaj zaznavne ravni, medtem ko je gp90 skladišče na visoki ravni s sev 515 in pri zelo nizkih nivojih sevov 1434 in CL (sl. 1D). Če molekule različno sprosti s sevi, 515, 1434 in CL dejansko vplivajo na migracijo parazit skozi želodčne mucin plašč, da bi pojasnila visoke in nizke učinkovitosti sevov CL in 515, v tem zaporedju, kot tudi vmesno možnost, ki jo seva razstavljal 1434 (sl. 1a). Poskus, da se dokaže vpliv sproščene gp90 na sev 515 migracija je bila izvedena z dajanjem želodčne-mucin obložene transwell filtrov na vrhu vrtin, ki vsebujejo samo metacyclic oblike, ali mešati z anti-gp90 mAb 5E7, ki ne priznava živih parazitov ali mešati z nepovezani mAb 2c2 usmerjena v T. cruzi
amastigote molekule [27]. Po 30 in 60 minutah inkubacije, so bili odvzeti vzorci iz filtrirni komori parazitov štetje. Paraziti mešati z anti-gp90 mAb 5E7, ne pa tudi tistih, ki mešajo z nepovezano mAb 2c2, vodi želodca mucin plašča pri večjem številu kot nadzora parazitov (sl. 1e), kar kaže, da shed gp90 moti parazit migracije prek neznanega mehanizma, ki ne vključuje vezavo, pod pogojem, da gp90 ne veže na želodčne mucin [28]. Poseganje gp82, ki jih ni bilo mogoče dokazati, ker je anti-gp82 mAb 3 F6 veže živeti parazitov, bi bilo razumljivo, saj se veže na želodčne mucin. tudi preučili bomo, ali so bili gp90 in gp82 različno sprosti v nevtralnem in kislem pH. Pogojena medij pridobljen iz metacyclic oblik seva 515 inkubiranih v PBS, pH 7,2, ali v citratnem pufru, pH 3,5, smo analizirali z Western blot. Sprostitev gp82 je bila podobna pri obeh pH, ​​medtem ko je gp90 ukinitev nižje pri kislem pH (Dodatni datotek 1: Slika S1B nižja plošče). Fig. 1 Migracija-gp82 izražanje T. cruzi
metacyclic oblik skozi želodčne mucin plasti. a Transwell filtri, prevlečene z želodčnih mucin so bili dani na vrtin, ki vsebujejo označene seve parazite. Vzorci so bili zbrani iz komore filtra na 30 min in 60 min za parazitsko štetje. Vrednosti so sredstva ± SD treh neodvisnih poskusov. V primerjavi z CL seva, znatno nižji migracije sevov TCI (** P
< 0,0005) in TcIV sev 1434 (* P
< 0,005) so opazili pri 60 min. b Metacyclic oblike, neobdelano (-) ali zdraviti (+) z 2 mg /ml pepsinom, pri pH 3,5, smo analizirali z Western blot uporabo mAb 3 F6 usmerjena na gp82. Kot kontrolo pepsin dejavnosti, kaže BSA s Coomassie modro obarvane. c Žive paraziti inkubiramo na ledu 1 h, v odsotnosti ali prisotnosti mAb 3 F6. Po posnetka, so paraziti inkubirali z Alexa Fluor 488-konjugiranega anti-IgG in je bil ocenjen število fluorescentnih parazitov. d paraziti inkubiramo 1 uro v PBS. Po centrifugiranje za odstranitev parazitov, je pogojena PBS analizirali z metodo Western blot uporabo mAb 3 F6 in mAb 5E7, usmerjena na gp82 in gp90 oz. e Transwell filtri, prevlečene z želodčnih mucin so bili dani na vrtin, ki vsebujejo metacyclic oblike seva 515 sam ali v prisotnosti anti-gp90 mAb 5E7, ki ne priznava živih parazitov ali nepovezanih mAb 2c2. Po 30 in 60 minutah inkubacije, so bili odvzeti vzorci iz filtrirni komori parazitov štetje. Vrednosti so sredstva ± sprememba dvojnikov
Host celični invaziji T. cruzi
metacyclic oblik PODJETJA
Zmanjšanje zmogljivosti metacyclic oblik v vdrla v želodcu epitelija po peroralni aplikaciji na miših je bila povezana z izražanjem pepsin odporna gp90 na visoki ravni, in povezana s slabim kužnosti proti gojenih epitelnih celic človeških [14, 15]. Proučili smo sposobnost TCI in TcIV metacyclic oblik za vstop celic gostiteljic. Paraziti smo inkubirali s celicami HeLa 1 h pri polnem DMEM hranil in preštejemo število znotrajceličnih paraziti. Nizka kapaciteta invazija je skupna značilnost vseh sevov, TcIV sev 1434 sev kažejo večjo učinkovitost kot sevi TCI (sl. 2a). Western blot analizo, s pomočjo monoklonsko protitelo, usmerjeno k gp90, je pokazala, da so vsi paraziti izraženo pepsina odporen proti gp90 (sl. 2b). Prisotnost gp90 na parazitsko površini smo preverili s pretočno citometrijo analize sevov 515 in 1434. V ponovljenih poskusih z različnimi vzorci na parazite, je gp90 na voljo na precej nižjih ravneh seva 1434 (slika 2c, Dodatna datotek 1:. Slika S1E). Pričakovali smo večjo celično invazijo sposobnost seva 1434, saj je zaslediti profil gp90 je podoben tistemu iz CL oblik seva metacyclic (Dodatni datoteka 1: Slika S1B zgornja plošča), ki so jih proti gp90 monoklonskih protiteles (mAb) ne prepozna, gp90 da zaznati v izvlečku detergent, ki ga Western blot. Fig. 2 Host celic invazija gp90-izražajo T. cruzi
metacyclic oblikah. a HeLa celice inkubiramo 1 uro z označenimi parazitskimi sevov v polnem DMEM hranil. Po fiksacijo in obarvanjem Giemsa, je število znotrajceličnih paraziti preštetih v skupno 250 celic. Vrednosti so sredstva ± SD štirih neodvisnih preiskavah, opravljenih v dveh izvodih. V primerjavi z CL seva, znatno nižji invazijo sevov 28, 588 in 1522 (*** P
< 0,0005), sev 515 (** P
< 0,001) in sev 1434 (* P
< 0,005) je bila odkrita s Student t testom
. b Metacyclic oblike, neobdelano (-) ali zdraviti (+) z 2 mg /ml pepsinom, pri pH 3,5, smo analizirali z Western blot uporabo anti-gp90 mAb 1G7. Kot kontrolo pepsin dejavnosti, kaže BSA s Coomassie modro obarvane. c Žive paraziti inkubiramo na ledu 1 h, v odsotnosti ali prisotnosti mAb 1G7. Po posnetka, so paraziti inkubirali z Alexa Fluor 488-konjugiranega anti-IgG in število fluorescentnih parazitov je bila ocenjena
Vpliv površinskih molekul T. cruzi sproščenih
metacyclic oblik v gostiteljske celice invazije
Ugotovili smo ali so bili gp82 in gp90 odcepi v medij med 1 h inkubaciji v popolni D10, in sicer pod pogojem, ki se uporabljajo v mobilni invazijo testom. Western blot analiza klimatiziranem medij, pripravljen, kot je opisano v poglavju metode, je pokazala, da je gp90 skladišče na najvišji ravni, ki seva 515 in na najnižjih ravneh, ki jih seva CL, ker gp82 javnost, ki ga sevi 515 in 1434 je bila popolnoma jasna, vendar je bila komaj zaznati v CL sev supernatant (sl. 3a). Dalje, smo testirali možnost, da je bila invazivna zmogljivost metacyclic oblik vplivati ​​gp90 izpuščenih v medij. CL lističi metacyclic oblike smo inkubirali 1 uro s HeLa celic samostojno ali v D10 plus 1% pripravljenih medija 515 seva D10 mediju, predinkubira ali ne, z anti-gp90 mAb 1G7 ali nepovezani mAb 2c2. CL sev je bil uporabljen zaradi svoje celične višja invazijo zmogljivosti in pomanjkanja reakcije z mAb 1G7. Kot je prikazano na sliki. 3b, pogojena srednje bistveno zmanjšalo parazit invazija, njegovo inhibitorno aktivnost je predvsem nevtraliziran z anti-gp90 mAb 1G7 ne pa nepovezani mAb 2c2. Verjetno je gp82 prisotne v pripravljenih mediju prav tako prispevali k opazovanem zaviralnega učinka, vendar je bilo to težko dokazati, ker anti-gp82 mAb, ki ne priznava živih parazitov ni na voljo. V HeLa celicah inkubirana v D10 30 minut z metacyclic oblikami seva 515 ali 1434, je bilo nekaj širjenja lizosomih (sl. 3c), ki je lahko posledica interakcije z gp82 sproščene na mediju. Rekombinantni gp82 protein se je izkazalo, da povzroči lizosomska razprševalne na celično periferijo [29], in dogodek, ki je dosegla vrhunec v eksocitoze in prispeva za parasitophorous tvorbo vakuole, potrebne za T. cruzi
invazijo [30-32]. Fig. 3. Učinek gp90 T. cruzi sprosti
metacyclic oblik v gostiteljske celice invazijo. Fig. Kot je prikazano na sliki. Fig. Vsi avtorji prebral in odobril končno verzijo rokopisa.

• Sistematični pregled in metaanaliza laparoskopsko in odprto želodca zaradi napredovalega raka želodca
• Serum CD26 vrednosti pri bolnikih z rakom želodca: roman potencialno diagnostično dvojno podajo