Isäntä soluinvaasiota ja suun infektion Trypanosoma cruzi kantojen geneettisen ryhmien TCI ja TcIV alkaen chagasic patients

Host soluinvaasiota ja suun infektion Trypanosoma cruzi
kantojen geneettisen ryhmien TCI ja TcIV alkaen chagasic potilaista
tiivistelmä
Background
tautitapauksia akuutin Chagasin tauti suun infektio on raportoitu usein viimeisten kymmenen vuoden aikana, ja esiintyi enemmän Pohjois Etelä-Amerikassa, jossa Trypanosoma cruzi
linjaa TCI vallitseva, vastaten suurin syy kiihtyvää ihmisten sairauksien ja pieni osa on tunnistettu TcIV. Mekanismeja suun infektio ja isäntä-solun invaasiota nämä loiset ovat huonosti tunnettuja. Tämän kysymyksen, analysoimme T. cruzi
eristettyjen kantojen chagasic potilaiden Venezuelassa, Guatemalassa ja Brasiliassa. Tool Menetelmät
Trypanosoma cruzi
metacyclic trypomastigotes oraalisesti ympättiin hiiriin. Hiiren mahassa kerättiin neljä päivää myöhemmin, sekä vatsan ja sydämen kerättiin 30 päivää infektion jälkeen, käsiteltiin histologista analyysiä. Analyysit matkia loinen läpi kulkeutumista mahan limaa kerros tehtiin laskemalla loisten kulkenut mahalaukun limaa päällystetty transwell suodattimia. Solujen invaasiota määrityksissä, ihmisen epiteelisolujen HeLa-soluja inkuboitiin metacyclic muodot ja lukumäärä internalized loisia laskettiin.
Tulokset
Kaikki TCI ja TcIV T. cruzi'in
kannat huonosti infektoiva suun kautta. Loiset olivat joko havaittavissa tai havaittu pieniä määriä hiiren vatsassa neljä päivää lähettää suun kautta. Jäljittelevän loiset havaittiin vatsassa ja /tai sydämessä 30 päivää infektion jälkeen. Verrattuna TCI linjaa, siirtyminen kapasiteetti TcIV loisia kautta mahan limaa käsitelty suodatin oli suurempi, mutta pienempi kuin näytteillä TcVI metacyclic muodot aiemmin osoitettu olevan erittäin infektoiva suun kautta. Expression pepsiiniä vastustuskykyisten gp90, pinta-molekyyli, joka downregulates soluinvaasion, oli suurempi TCI kuin TcIV loisia ja näin ollen hyökkäys kapasiteetti TcIV metacyclic muotojen oli korkeampi. Gp90 molekyylit spontaanisti vapauttaa TCI metacyclic muotoja esti parasiitin tuloa isäntäsoluihin. TCI loiset osoittautunut alhaiseksi solunsisäisen replikaation korko.
Johtopäätökset
Tutkimuksemme osoittavat, että huono kapasiteetti TCI linjaa, ja vähemmässä määrin TcIV loisten, valtaavat mahalaukun epiteelin suun kautta infektio hiirillä voi liittyä tehottomuus of metacyclic muotoja, erityisesti TCI loisten kulkeutumaan mahalaukun lima kerros, hyökätä tavoite epiteelisolujen ja toistamaan solun.
avainsanat
Trypanosoma cruzi
TCI ja TcIV suvusta Metacyclic trypomastigotes Suun infektio Isäntäsolu invaasio Taustaa
tulos infektion Trypanosoma cruzi
, asiamiehen Chagasin tauti, voi vaihdella suuresti: 20-30% kroonisesti tartunnan saaneiden potilaiden kehittyy vakava sydänlihastulehdus, korjauksilla ruoansulatuskanavan (megaesophagus ja /tai megakoolon) esiintyy harvemmin, kun taas suurin osa jää oireettomia elämää. Geneettisen taustan ja immunologinen tila vastaanottavan sekä heterogeenisyys loispopulaatio voivat edistää tätä monimuotoisuutta [1] ja mahdollisesti infektioreitti ja tarttuvan annoksen. Mukaan lajin sisäinen nimikkeistön perustettiin vuonna 2009, T. cruzi
kannat luokitellaan kuuteen erillisiin kirjoittamalla yksikköä (DTUs), TCI-TcVI [2]. Maissa Pohjois Etelä-Amerikan ja Amazonin alueella, jossa megaesophagus ja megacolon ovat harvinaisia ​​ja chagasic kardiomyopatia on yleistä, TCI on hallitseva asiamiehen Chagasin tauti, toisin kuin TCII, joka on eristetty useimmista potilaista Brasilian Keski- ja Itä-alue jossa T. cruzi
infektio liittyy yleensä mega oireyhtymät [1, 3]. TCI on todettu, koska suurin syy elpyvä ihmisten sairauksien Pohjois Etelä-Amerikassa, joka perustuu genotyypitys hienoksi mittakaavan resoluutio maantieteellinen levinneisyys, käyttäen suurta paneelia polymorfisten mikrosatelliittimarkkerin [4]. Viime vuosina puhkeamisen akuutin Chagasin taudit suun infektio on raportoitu Venezuelan [5, 6], Kolumbia [7, 8] ja Brasilian Amazonin [9, 10], jossa TCI on yleistä ja pieni osa on ollut tunnistettu TcIV.
Metacyclic trypomastigotes ovat osallisina edellä tarkoitettujen tapauksissa suun T. cruzi
infektio. Perustuu läsnäolo amastigote pesiä sisällä osissa mahalaukun limakalvon, mutta mitään näyttöä T. cruzi
hyökkäystä sisällä suunielun tai ruokatorveen eläinten altistetaan suun kautta hyönteisten johdettuja metacyclic muotoja, hyökkäys mahalaukun limakalvon epiteelin ehdotettiin olevan ainutlaatuinen portaali tulon systeemisiä T. cruzi
infektio [11]. Kokeet TCII ja TcVI kannat chagasic potilaista ovat osoittaneet, että metacyclic vaiheessa-spesifinen pinta-molekyylien gp82 ja gp90, jotka toimivat promoottorin ja estäjä kohdesolun invaasio, vastaavasti [12, 13], pelata keskeisiä rooleja suun infektion [14, 15]. Gp82, joka sitoutuu selektiivisesti mahan musiinia [16] on erittäin konservoitunut geneettisesti erilaisten T. cruzi
suvusta [17], ja se on vastustuskykyinen ruoansulatusta pepsiini happamassa pH: ssa, kun taas gp90-isomuotoja ero herkkyys maha- ruoansulatusta voidaan ilmaista eri kantoja jotta korkea tai matala infektiivisyys suun kautta liittyy ilmaus pepsiiniä herkkien tai pepsiinillä kestävästä gp90 isoformi [14, 15]. Onko tällainen monimuotoisuus gp90 ilmentyminen ja suullinen tarttuvuuden löytyy myös TCI ja TcIV DTUs vielä tutkittava. Ei ole tietoa kokeellisen suullinen infektion nämä loiset, saatavilla olevat tiedot viittaavat hiiriin injektoitiin verta trypomastigotes tai metacyclic muodoiksi vatsaonteloon [18], joka on luonnotonta tilassa infektion. Täällä analysoimme metacyclic trypomastigotes TCI ja TcIV eristettyjen kantojen chagasic potilaiden eri maantieteellisillä alueilla, osalta gp82 ja gp90 ilmentyminen, kyky kulkeutua mahalaukun musiinin kerroksen ja hyökätä mahalaukun limakalvon epiteelin suun kautta annettaessa hiiriin. Selventää mekanismeja loinen hyökkäystä, in vitro
soluinvaasiota analyysit suoritettiin käyttäen ihmisen epiteelisoluja. Koska pinta-antigeenejä spontaanisti irtoa kudosviljelmän johdettuja trypomastigotes [19] on raportoitu olevan rooli T. cruzi
infektio [20], tutkimme onko pinta molekyylit vapautuu metacyclic muotoja ja vaikuttavat isäntäsolun hyökkäystä.
menetelmät
loiset ja isäntäsolun invaasiomääritys
Trypanosoma cruzi
kannat Trypanosomatid Culture Collection (TCC), Department of parasitologia, Universidade de São Paulo, ystävällisesti tri Marta MG Teixeira. Ne eristettiin chagasic potilaiden eri maantieteellisillä alueilla: TCC: 28 (Amazon, Brasilia), TCC: 515 (Venezuela), TCC: 588 (Guatemala), TCC: 1522 (Paraíba, Brasil), TCC: 1434 (Amapá, Brasilia ). Kantoja 28, 515, 588 ja 1522 olivat TCI ja rasitusta 1434, eristetty yksittäisen tartunnan suun kautta, oli TcIV. Kontrollina, CL-kanta (TcVI) käytettiin useissa kokeissa. Loiset pidettiin syklisesti hiirillä ja maksassa infuusio tryptoosin välineellä. Edistää erilaistumista, loiset kasvatettiin yksi passage TC100 (Vitrocell, Brasilia) tai Gracen alustaa (Invitrogen) ja metacyclic muodot puhdistettiin läpi DEAE--selluloosakolonnia kuvatulla [21]. HeLa-soluja, ihmisen karsinooman johdettu epiteelisolujen, kasvatettiin 37 ° C: ssa Dulbeccon Minimum Essential Medium (DMEM), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS), streptomysiiniä (100 ug /ml) ja penisilliiniä (100 U /ml) kosteutetussa 5% CO 2 ilmakehässä. Soluinvaasion määritykset suoritettiin, kuten on yksityiskohtaisesti muualla [22], ymppäämällä puhdistettu metacyclic trypomastigotes päälle kussakin kuopassa 24 kuopan levyille, jotka sisälsivät 13-mm halkaisijaltaan pyöreä lasipeitinlevyille päällystettiin 1,4 x 10 5 HeLa-solut, joko DMEM, jossa 10 % FCS (D10) tai PBS: ++ (PBS, joka sisälsi litraa kohti: 140 mg CaCI 2, 400 mg KCI, 100 mg MgCl 2,6H 2O, 100 mg MgSO 4.7H 2O, 350 mg NaHCO 3). 1 tunnin inkubaation loisia, kaksoiskappale peitelaseja vahvistettu Bouin liuokseen, värjätään Giemsa, ja peräkkäin kuivattu asetoniin, luokiteltujen sarjojen asetonia: ksyleenissä (9: 1, 7: 3, 3: 7) ja ksyleenissä. Lukumäärä solunsisäisiä loisia laskettiin yhteensä 250 solua.
Suullinen infektio
Viisi kuuden viikon ikäiset BALB /c-hiiriä, kasvatettu eläin laitokseen Universidade Federal de São Paulo, käytettiin. Kaikki menettelyt ja kokeita noudatti sääntelyn institutionaalisten eettisen komitean eläinkokeiden ja hyväksyi tutkimuksen komitea (pöytäkirja N: o 0234/12). Hiiret infektoitiin T. cruzi
metacyclic muotoja suun kautta (5 x 10 7 loisia 0,1 ml: aan PBS eläintä kohti), käyttäen 1 ml ruiskua letkuruokintaneulan joka työnnettiin eläimen suuhun. Havaitsemiseksi loisia mahalaukun limakalvon epiteelin, mahan hiirillä, jotka inokuloitiin oraalisesti metacyclic muotoja kerättiin 4 päivää infektion jälkeen, kiinnitettiin 10% neutraaliin formaldehydiä 24 tuntia. Käsittelyn jälkeen asteittainen nestehukka luokiteltujen sarjojen etanoliliuosta, jonka jälkeen ksyleeni upottamalla ja upotettuja parafin, sarja 5 um kudos leikattiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. Toisessa koesarjassa metacyclic lomakkeita annettiin suun kautta hiiriin (1 x 10 6 loisia 0,1 ml: aan PBS eläintä kohti) ja alkaa päivänä 10 inokulaation, parasitemialla tarkkailtiin kahdesti viikossa tutkimalla 5 ui verinäytettä kerättiin hännän klo faasikontrastimikroskooppia. Klo 30 päivää infektion jälkeen, vatsan, sydämen ja maksan kerättiin ja käsitellään kudospreparaatit, kuten edellä on kuvattu.
Määritys loisen maahanmuuton mahan musiinia kerroksen
polykarbonaatti transwell suodattimet (3 um huokosia, 6,5 mm halkaisijaltaan , Costar) päällystettiin 50 ui valmistetta, joka sisälsi 10 mg /ml mahan musiinia veteen. Metacyclic muotoja, suspendoitiin 600 ui PBS: ää, lisättiin pohjalle 24-kuoppalevyille (1 x 10 7 loisten /kuoppa), limakalvon päällystetyt transwell suodattimet asetettiin loista sisältävät kuopat ja 100 ui PBS: ää oli lisätään kammio. 30 minuutin kuluttua ja /tai 1 h inkubaation jälkeen 37 ° C: ssa, 10 ui näytettä kerättiin suodattimen kammio parasiittimäärän.
Virtaussytometria ja epäsuoralla immunofluoresenssilla määrityksissä
Elävät metacyclic trypomastigotes (1 x 10 7 ) inkuboitiin jäillä 1 tunti monoklonaalisella vasta-aineella 3 F6 tai 1G7, joka on suunnattu vastaavasti metacyclic vaiheeseen-spesifinen pinta-molekyylin gp82 tai gp90. Sen jälkeen, loiset fiksoitiin 4% paraformaldehydiä 20 min. Seuraavat pesut PBS: ssä, loiset inkuboitiin Alexa Fluor 488-konjugoidulla anti-IgG: tä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja määrä fluoresoivaa loisten arvioitiin BD AccuriTM C6 -virtaussytometrillä. Ohjaus loiset inkuboitiin toissijaisen vasta-ainetta ainoastaan. Visualisoida HeLasoluista lysosomeihin peitinlaseista tarttuneen soluja inkuboitiin 1 h 37 ° C: ssa D10 tai PBS ++ tai inkuboitiin loisia D10 1 h. Kiinnityksen jälkeen 4% p-formaldehydiä PBS: ssa 30 min, solut käsiteltiin 50 mM NH 4CL PBS: ssä 30 minuutin ajan ja pestiin PBS: ssä. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin 1 h huoneenlämpötilassa hiiren anti-humaani LAMP2 laimennettu 1: 8 (v /v) PBS-liuosta, joka sisälsi 0,15% gelatiinia, 0,1% natriumatsidia ja 1% saponiinia (PGN-saponiini). Pesun jälkeen PBS: ssä, peitelasit inkuboitiin 1 h Alexa Fluor 568-konjugoidulla anti-hiiri-IgG: tä (Invitrogen), joka oli laimennettu 1: 300 PGN-saponiini, joka sisältää 500 ng /ml phalloidin-FITC ja 10 ug /m DAPI (4 ', 6'-1-diamino-2-fenyyli-dihydrokloridi), mitä seurasivat pesut PBS: ssä, ja sen jälkeen asennus peitelaseilla pidentää Gold (Invitrogen). Konfokaaliset kuvat hankittiin Leica TCS SP8 laser-skannaus mikroskooppi (Leica, Saksa) käyttämällä öljyssä Plan-Apochromat 63x tavoite (numeerinen aukko 1,4). Kuvasarja saatu konfokaali z-pinot käsiteltiin ja analysoitiin käyttämällä Leica LAS AF (Leica, 2012, Saksa) ja Imaris (Bitplane) ohjelmisto.
Valmistus loisen kunnostetun alustan
Metacyclic lomakkeet (10 8) inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan 100 ui täydellistä D10 keskipitkän, ravintoaine-riistää PBS ++ tai PBS. Sentrifugoinnin jälkeen pelletti heitettiin pois ja supernatantti (conditioned medium) otettiin talteen. Käytettäväksi soluinvaasion määrityksissä elatusaine laimennettiin 1: 100 D10 tai PBS: ++ ja Western blot 10 ui ladattiin.
Tuotanto ja puhdistus rekombinantti gp82-proteiinin
rekombinanttiproteiini, joka sisältää täyspitkä T. cruzi
gp82-sekvenssi (GenBank TM tietokanta, hakunumero L14824), lukukehyksessä gluthatione S-transferaasi (GST), tuotettiin E. coli
DH5-α ja puhdistettiin yksityiskohtainen muualla [23].
tilastollinen analyysi
Studentin t
testiä, kuten se on toteutettu GraphPad ohjelmiston (versio 6.01), käytettiin.
tulokset
Oral infektio hiirten T. cruzi
metacyclic muodot
kyky TCI loisten hiirien suun kautta tutkittiin joukko kokeita. Neljäkymmentä hiiret erotettiin 8 ryhmässä viiden eläimen. Yhdessä koesarjassa, jonka tarkoituksena on tarkistaa invaasio mahalaukun epiteelin metacyclic trypomastigotes, 4 ryhmää käytettiin ja kunkin ryhmän viidestä hiiret saivat eri loinen kantaa (5 x 10 7 parasiitit eläintä kohti). Neljän päivän kuluttua suun kautta, mahan hiiriä kerätä ja käsitellä kudospreparaatit. Suuri määrä loisia käytettiin tässä tapauksessa, koska aiemmissa tutkimuksissa TCI kanta G, luonnosta lähetysjakso, olimme havainneet, että vaikka on korkea siirrosainetta hyvin harvat amastigote pesiä, jotka vastaavat solunsisäisesti jäljittelevän amastigotes, oli havaittavissa 4 jälkeisen päivän suun infektio. Huolimatta suuresta inokulaatti, emme voineet havaita amastigote pesiä mikroskooppinen analyysi histologista osien mahassa (taulukko 1). Toinen koesarja suoritettiin sen määrittämiseksi, oliko mitään eroa kudostropismi väliin T. cruzi
kantoja. Tätä tarkoitusta varten, jäljellä olevat 4 ryhmää käytettiin ja kunkin ryhmän viidestä hiirestä sai eri loisen kanta (1 x 10 6 loisten eläintä kohti) ja infektion kuluessa seurattiin 30 päivää. Alkaen päivänä 10, parasitemia tasot tarkkailtiin kahdesti viikossa, ja päivänä 30 mahassa, sydämen ja maksan kerättiin histologista analyysiä varten. Tällöin ymppi oli pienempi, koska päättelimme, että on käyty useita soluinvaasiota ja solunsisäinen replikaatio, amastigote pesiä olisi havaittavissa. Parasitemialla oli havaittavissa koko ajan havainnon mutta tartunta vahvistettiin kaikissa ryhmissä havaitsemalla amastigote pesiä vatsassa ja /tai keskellä hiirtä (taulukko 1), mutta ei maksassa. Huomionarvoista oli, että vatsassa hiirten tartunnan kanta 1522, joka on johdettu krooninen chagasic potilas on loppuvaiheen sydämen vajaatoiminta [24], loiset havaittiin sydämessä, mutta ei mahalaukussa taas päinvastainen sovellettu infektion rasitusta 28 (taulukko 1). Amastigote pesät olivat läsnä suuri määrä vatsassa joidenkin hiirten tartunnan rasitusta 28 tai 588 (taulukko 1), oletettavasti johtuvat useita kierroksia hyökkäyksen ja solunsisäisen replikaation mahalaukun epiteelin. Se, että loiset ei havaittu hiiren vatsassa 4 päivänä suun kautta, vaan vasta myöhemmässä aikapisteessä, kun solunsisäinen replikointi syklit, ehdotti joko tehoton kulkeutumista metacyclic muotojen kautta limakerroksessa, tehoton hyökkäys kohde- epiteelisolujen ja /tai solunsisäisiä loinen kertominen. Lisäksi TCI kantoja, tutkimme yksi TcIV rasitusta, 1434, johdettu suullisesti tartunnan potilaalle. Amastigote pesiä, pieniä määriä, havaittiin 3 hiirillä 4. päivä infektoinnin jälkeen histologista osissa vatsassa, mutta loiset ei havaittu vatsassa tai sydämessä 30 päivää infektion jälkeen (taulukko 1). Parasitemialla oli negatiivinen koko aikana 30 päivää infektion. Positiivinen hemoculture vahvistanut infektiota kaikki kannat. Kudospreparaatit tutkittiin myös läsnäolon tulehduksellisten prosessien. Riippumatta loisen kanta, tulehduksellinen pesäkkeitä olivat tuskin havaittavia mahassa päivänä 4 tai 30 infektion tai sydämessä päivänä 30.Table 1 Suun infektiota hiirten metacyclic muotoja T. cruzi
strainsa
T. cruzi
kannan
(alkuperä)
Mouse
Amastigote pesiä (lukumäärä kudosleikkeiden)
Vatsa (päivä 4) B
Vatsa (päivä 30)
Heart (päivä 30)
28
(Brasilia Amazon) B 1
0 (20) B 0 (20)
0 (20) B-2
0 (20) B 60 (20) B 0 (21)
3
0 (20) B-285 (20)
0 (20) B-4
0 (20) B 11 (18) B 0 (23) B 5
0 (20) B NDB
0 (20) B 515
(Venezuela)
1
0 (21) B 0 (24) B 0 (20) B-2
0 (19)
0 (13) B 0 (25)
3
0 (20) B 0 (21) B 0 (23) B-4
0 (20)
45 (11) B 0 (21) B 5
0 (20) B-5 (21) B 0 (24) B 588
(Guatemala)
1
0 (09) B 31 (19) B 10 (21) B-2
0 (12) B 17 (18) B 0 (20)
3
0 (09) B-6 (20) B-3 (15) B-4
0 (12) B 87 (19) B 0 (19)
5
0 (16) B-990 (20) B 0 (16) B-1522
(Brasilia Northeast) B 1
0 (16) B 0 (17) B 0 (20) B-2
0 (19) B 0 (15) B-4 (20) B-3
0 (20)
0 (17) B 0 (20) B-4
0 (21) B 0 (20) B-6 (20) B 5
0 (21)
0 (16) B-4 (18) B-1434
(Brasilia Amazon) B 1
5 (40) B 0 (18) B 0 (20) B-2
3 (40) B 0 (24) B 0 (20) B-3
0 (36) B 0 (20) B 0 (20) B-4
0 (35) B 0 (20) B 0 (21) B 5
5 (40) B 0 (20) B 0 (21) B aMetacyclic muodot ilmoitettu loiskantojen annettiin suun kautta hiiriin. Yhdessä kokeessa hiiret saivat 5 x 107 loisia ja 4 päivää myöhemmin mahan kerättiin histologista valmisteet. Toisessa kokeessa hiiret saivat 1 x 106 loisia ja 30 päivää myöhemmin, vatsan ja sydämen kerättiin kudospreparaatit
b ND
ei määritetty
Migration T. cruzi
metacyclic muotoja läpi mahan musiinista kerros
määritys jäljitellä loisen translokaation kautta limakerroksen mahassa suoritettiin käyttäen transwell suodattimet on päällystetty mahalaukun musiinin, joka on tärkein makromolekulaarisen osa limaa. Aikaisemmat tutkimukset olivat osoittaneet, että TcVI metacyclic muotoja, jotka tehokkaasti hyökätä mahalaukun epiteelin suun kautta hiiriin, kulkevat mahan musiinia päällystetty transwell suodatin yhtä tehokkaasti kuin tyhjä suodattimen ja tämä ominaisuus liittyy ilmaus pepsiiniä kestävä G82 molekyyli, joka valikoivasti sitoutuu mahan musiinia [16, 25]. Mahalaukun musiini-päällystetyt transwell suodattimet laitettiin päälle sisältäviin kuoppiin metacyclic muotoja. 30 ja 60 min inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, määrä loisia, jotka saavutettiin ylemmän kammion laskettiin. TCI loiset näkyy heikentynyt kyky siirtyä läpi mahalaukun musiinin kerros, verrattuna kanta CL (TcVI), joka toimi kontrollina (kuvio. 1a), joka vahvistaa, että mahan musiinia toiminut esteenä muuttoliikettä. Metacyclic muodot TcIV kannan 1434 kulki mahan limaa päällystettyjä suodattimia tehokkaammin kuin TCI loisia, mutta silti alhaisemmalla tasolla kuin CL-kannan (Fig. 1a). Tutkimme ilmaus gp82 ja sen kestävyys pepsiiniä TCI ja TcIV kantoja. Metacyclic muotoja käsiteltiin 1 tunnin ajan 2 mg /ml pepsiiniä sitraattipuskurissa pH: ssa 3,5, tila, joka hajoa BSA: ta (Fig. 1b), ja pesuaineen liukoisen uutteet analysoitiin Western blot, yhdessä käsittelemättömän loisia, käyttäen monoklonaalisia vasta-ainetta (mAb) 3 F6 suunnattu gp82. Ennen reaktiota mAb 3 F6, yhtä suuri kuormitus Loisnäytteet tarkistettiin Ponceau-S värjäys (Additional tiedosto 1: Kuva S1A). Expression of gp82, joka oli säilynyt koskemattomana jälkeen pepsiini hoidon, oli samanlainen kaikissa kannoissa, ilmeisesti jonkin verran korkeammalla tasolla kannan 1434 kuin vuonna TCI kannoissa (Fig. 1b). Koska tämä voisi selittää korkeamman muuttoliike kapasiteetti kannan 1434 vertasimme gp82 ilmentyminen tämän kannan kuin CL kanta, joka tehokkaasti kulkenut mahalaukun limaa käsitelty suodatin (Fig. 1a). Gp82 ilmentyminen oli verrattavissa 1434 ja CL kantoja (Additional tiedosto 1: Kuva S1B yläpaneeli). Läsnäolo gp82-molekyylien loisen pintaan vahvistettiin virtaussytometrialla analyysi (Fig. 1 c). Edelleen tutkia kannan 1434 ilmaistu korkeampi gp82 tasoja kuin TCI kannat, Western blot-analyysi toistettiin käyttäen kannan 515 edustajana TCI linjaa. MT näytteitä kaksi kantaa, valmistettu samana päivänä ja elektroforeesi samalla SDS-PAGE-geelissä, osoittivat samanlaisia ​​profiilin (Additional tiedosto 1: Kuva S1C). Kaikista Näiden tietojen ja muiden FACS kaksi kantaa, osoittaa hieman korkeampi gp82 tasoilla kannan 1434 (Additional tiedosto 1: Kuva S1D), ei ole mahdollista päätellä, että suhteellinen tehokkuus kannan 1434 metacyclic muotoja siirryttäessä läpi mahalaukun musiinin kerros johtuu ero ilmentymisen gp82. Kuten T. cruzi
tiedetään vapauttavan spontaanisti pinnalle molekyylit [19, 20, 26], parasiitti-irtoa molekyylejä voisi myös olla vastuussa havaituista vaikutuksista. Me tarkistanut gp82 vuodatettiin sisällyttämistä keskipitkän aikana 1 tunnin inkuboinnin PBS, kunto käytetty mahalaukun musiinia migraatiokokeessa. Western blot-analyysi supernatantin jälkeen loinen poiston, joka oli saatu, kuten on kuvattu menetelmät-osiossa paljasti, että kannat 515 ja 1434 irtoa merkittäviä määriä gp82, toisin kuin CL-kantaa, joka julkaistiin gp82 on tuskin havaittavissa, kun taas gp90 vuodatettiin korkeilla tasoilla kannan 515 ja hyvin alhaiset kannoilla 1434 ja CL (Fig. 1 d). Jos molekyylit differentiaalisesti vapauttaa kantoja 515, 1434 ja CL itse asiassa häiritä loisen läpi kulkeutumista mahan musiinin takki, joka selittää korkean ja matalan tehokkuudet kantojen CL ja 515, vastaavasti, samoin kuin väli- kyky näytteillä kannan 1434 (Fig. 1a). Kokeilu osoittaa vaikutuksen julkaistiin gp90 kantaan 515 muuttoliikettä suoritettiin asettamalla mahalaukun limaa päällystetty transwell suodattimet päälle, jotka sisälsivät metacyclic muodoissa yksinään tai sekoitettuna anti-gp90 mAb 5E7, joka ei tunnista eläviä loisia tai sekoitettuna toisiinsa liittymättömiä mAb 2C2 suunnattu T. cruzi
amastigote molekyylin [27]. Kun 30 ja 60 min inkuboinnin näytteitä suodatin kammiosta otettiin parasiittimäärän. Loiset sekoittaa anti-gp90 mAb 5E7, mutta ei niitä sekoittaa toisiinsa liittymättömiä mAb 2C2, kulki mahan musiinia turkki korkeammat numerot kuin ohjaus loiset (Fig. 1 e), mikä osoittaa, että irtoa gp90 häiritsee loinen maahanmuuton tuntematon mekanismi, joka ei liity sitova, että gp90 ei sitoudu mahalaukun musiinia [28]. Häiriöitä gp82, jota ei voitu osoittaa, koska anti-gp82 mAb 3 F6 sitoutuu elää loiset, olisi ymmärrettävää, koska se sitoutuu mahalaukun musiinia. Myös tutki gp90 ja gp82 oli differentiaalisesti julkaistiin neutraalissa ja happamassa pH: ssa. Väliaine on saatu metacyclic muodoista kannan 515 inkuboitiin PBS: ssä, pH 7,2, tai sitraattipuskurissa, pH 3,5, analysoitiin Western blot. Vapautuminen gp82 oli samanlainen molemmissa pH, kun taas gp90 irtoaminen oli pienempi happamassa (Additional tiedosto 1: Kuva S1B alempi paneeli). Kuva. 1 kulkeutuminen gp82 ilmentävien T. cruzi
metacyclic muotoja läpi mahalaukun musiinia kerros. Transwell suodattimet päällystetty mahalaukun mukiinia pantiin päälle, jotka sisälsivät ilmoitettu loiskantojen. Näytteet kerättiin suodatinkammion 30 min ja 60 min parasiittimäärän. Arvot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Verrattuna CL rasitusta, joka on huomattavasti alempi kulkeutumista TCI kantoja (** P
< 0,0005) ja TcIV kannan 1434 (* P
< 0,005) havaittiin 60 min. b Metacyclic muotoja, käsittelemättä (-) tai käsiteltiin (+) ja 2 mg /ml pepsiiniä, pH: ssa 3,5, analysoitiin Western blot käyttäen mAb 3 F6 suunnattu gp82. Koska valvonta pepsiiniaktiivisuutta, BSA värjättiin Coomassie blue näkyy. c Elävät loiset inkuboitiin jäissä 1 h, puuttuessa tai läsnä ollessa mAb 3 F6. Kiinnityksen jälkeen loiset inkuboitiin Alexa Fluor 488-konjugoitu anti-IgG: n ja määrä fluoresoivaa loisia arvioitiin. d Loiset inkuboitiin 1 h PBS: ssä. Sentrifugoinnin jälkeen poistaa loisia, vakioitu PBS analysoitiin Western-blottauksella käyttämällä mAb 3 F6 ja mAb 5E7, suunnattu gp82 ja gp90 vastaavasti. e Transwell suodattimet on päällystetty mahan musiinia pantiin päälle, jotka sisälsivät metacyclic muotoja kannan 515 yksin tai, kun läsnä on anti-gp90 mAb 5E7, joka ei tunnista eläviä loisia tai eivät liity mAb 2C2. Kun 30 ja 60 min inkuboinnin näytteitä suodatin kammiosta otettiin parasiittimäärän. Arvot ovat keskiarvoja ± vaihtelu kaksoiskappaleita
Host soluinvaasiota T. cruzi
metacyclic muotoja
Alennettu kapasiteetti metacyclic muotoja hyökkääviä mahalaukun epiteelin oraaliannossa hiiriin on liitetty ilmaisu pepsiiniä vastustuskykyisten gp90 korkealla tasolla, ja korreloi huonon tarttuvuuden kohti viljellyissä ihmisen epiteelisolujen [14, 15]. Tutkimme kyky TCI ja TcIV metacyclic lomakkeita syöttää isäntäsoluihin. Loiset inkuboitiin HeLa-solujen kanssa 1 tunnin täysin ravinteiden DMEM ja useita solunsisäisiä loisia laskettiin. Low hyökkäys kapasiteetti oli yhteinen piirre kaikille kantoja, TcIV kanta 1434 -kannan näytteille tehokkaammin kuin TCI kannat (Fig. 2a). Western blot -analyysi, käyttämällä monoklonaalista vasta-ainetta on suunnattu gp90, paljasti, että kaikki loiset ilmaistu pepsiini-resistenttejä gp90 (Fig. 2b). Läsnäolo gp90 on loinen pinnalla tarkastettiin virtaussytometrialla analyysi kannoissa 515 ja 1434. Toistuvien joissa käytetään eri loinen näytteitä, gp90 löydettiin paljon alemmilla tasoilla kannan 1434 (Fig. 2c, Additional tiedosto 1: Kuva S1E). Odotimme suurempaa soluinvaasiota kapasiteetti Kannan 1434, koska havaittua profiilia gp90 on samanlainen kuin CL-kannan metacyclic muotoja (Additional tiedosto 1: Kuva S1B yläpaneeli), jotka eivät tunnista anti-gp90 monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t), gp90 on havaittavissa pesuaineen ote Western blotilla. Kuva. 2 Isäntäsolu hyökkäystä gp90 ilmentäviä T. cruzi
metacyclic muotoja. HeLa-soluja inkuboitiin 1 h, jossa on valittu loiskantojen kokonaan ravinteiden DMEM. Kiinnityksen jälkeen ja Giemsa-värjäys, määrä solunsisäisiä loisia laskettiin yhteensä 250 solua. Arvot ovat keskiarvoja ± SD neljästä itsenäisestä jotka suoritettiin kahtena kappaleena. Verrattuna CL rasitusta, joka on huomattavasti alempi hyökkäyksen kantojen 28, 588 ja 1522 (*** P
< 0,0005), kanta 515 (** P
< 0,001) ja kannan 1434 (* P
< 0,005) havaittiin Student t
testiä. b Metacyclic muotoja, käsittelemättä (-) tai käsiteltiin (+) ja 2 mg /ml pepsiiniä, pH: ssa 3,5, analysoitiin Western blot käyttäen anti-gp90 mAb 1G7. Koska valvonta pepsiiniaktiivisuutta, BSA värjättiin Coomassie blue näkyy. c Elävät loiset inkuboitiin jäissä 1 tunnin ajan, tai ilman sitä, kun läsnä on mAb 1G7. Kiinnityksen jälkeen loiset inkuboitiin Alexa Fluor 488-konjugoitua anti-IgG- ja määrä fluoresoivaa loisten arvioitiin
vaikutus pinnan molekyylejä vapautuu T. cruzi
metacyclic muotoja isäntäsolussa invaasiota
Selvitimme onko gp82 ja gp90 vuodatettiin elatusaineeseen 1 tunnin aikana inkuboitiin täydellisessä D10, eli olosuhteissa, joita käytetään solusta invaasiomääritys. Western blot analyysi kunnostettu alusta, valmistettu kuten on kuvattu menetelmät jaksossa, paljasti, että gp90 vuodatettiin korkeimmalla tasolla Kannan 515 ja alimmilla tasoilla Kannan CL, kun taas gp82 julkaisu kantojen 515 ja 1434 selvästi näkyväksi, mutta oli tuskin havaittavissa CL -kannan supernatantissa (Fig. 3a). Seuraavaksi testasimme mahdollisuutta, että invasiivinen kapasiteetti metacyclic muotojen on vaikuttanut gp90 vapautuu väliaineeseen. CL-kannan metacyclic muotoja inkuboitiin 1 h Hela-solua D10 väliaineessa yksin tai D10 plus 1% kunnostettua alustaa 515 kanta, esi tai anti-gp90 mAb 1G7 tai toisiinsa liittymättömiä mAb 2C2. CL kantaa käytettiin, koska sen solun korkeamman hyökkäys kapasiteetti ja puute reaktion mAb 1G7. Kuten on esitetty kuviossa. 3b, väliaine vähentää merkittävästi loinen invaasio, sen estävä aktiivisuus oli enimmäkseen neutraloida anti-gp90 mAb 1G7 muttei etuyhteydettömien mAb 2C2. Oletettavasti gp82 läsnä kasvatusliuoksessa vaikutti myös havaittu estävän vaikutuksen, mutta tämä oli vaikea osoittaa, koska anti-gp82 mAb, joka ei tunnista live loisia ei ole käytettävissä. HeLa-soluissa, joita inkuboitiin D10 30 min metacyclic muotoja kannan 515 tai 1434, oli jonkin verran leviämisen lysosomeihin (Fig. 3c), jotka voivat johtua vuorovaikutuksesta gp82 vapautuu väliaineeseen. Yhdistelmä-DNA-gp82-proteiinin on osoitettu indusoivan lysosomiin sironnan solun kehälle [29], ja tapauksessa, että huipentuu eksosytoosin ja edistää varten parasitophorous onteloiden muodostumiseen tarvitaan T. cruzi
hyökkäys [30-32]. Kuva. 3 vaikutus gp90 vapauttaa T. cruzi
metacyclic muotoja isäntäsolussa hyökkäystä. Kuva. Kuten on esitetty kuviossa. Kuva. Kaikki kirjoittajat lukea ja hyväksyi lopullisen version käsikirjoituksen.

• Järjestelmällinen katsaus ja meta-analyysi laparoskooppisia ja avoin gastrectomy pitkälle mahasyövän
• Seerumin CD26 tasot potilailla, joilla on mahalaukun syöpä: uusi potentiaalinen diagnostinen markkeri