Sede de la invasión celular y la infección oral por Trypanosoma cruzi cepas de los grupos genéticos TCI y TCIV de pacientes chagásicos

Sede de la invasión celular y la infección oral por Trypanosoma cruzi
cepas de los grupos genéticos TCI y TCIV de pacientes chagásicos
Resumen Antecedentes

Los brotes de la enfermedad de Chagas aguda por infección oral se han reportado con frecuencia en los últimos diez años , con mayor incidencia en el norte de América del Sur, donde el Trypanosoma cruzi
linaje TCI predomina, siendo responsable de la principal causa de enfermedad humana resurgimiento, y un pequeño porcentaje se identifica como TCIV. Mecanismos de infección oral y la invasión de la célula huésped por estos parásitos son poco conocidos. Para abordar esta cuestión, analizamos T. cruzi
cepas aisladas de pacientes chagásicos en Venezuela, Guatemala y Brasil.
Métodos
Trypanosoma cruzi
metacyclic tripomastigotes se inocularon por vía oral en ratones. El estómago de ratón recogido cuatro días más tarde, así como el estómago y el corazón recolectado 30 días después de la infección, se procesaron para el análisis histológico. Los ensayos para imitar la migración parásito a través de la capa de moco gástrico se realizó contando el número de parásitos que atravesaban filtros transwell mucina recubierto gástricos. Para los ensayos de invasión de células, las células HeLa epiteliales humana se incubaron con formas metacyclic y se contó el número de parásitos internalizados.
Resultados MyBestPlay Todos los TCI y TCIV T. cruzi
cepas estaban mal infeccioso por vía oral. Los parásitos fueron ya sea indetectable o se detectaron en un pequeño número en el estómago de ratón cuatro días después de la administración oral. parásitos replicantes fueron encontrados en el estómago y /o en el corazón de los 30 días después de la infección. En comparación con TCI linaje, la capacidad de migración de TCIV parásitos a través del filtro de mucina gástrica recubierto fue mayor pero menor que la exhibida por formas metacíclicas TCVI previamente demostrado ser altamente infeccioso por vía oral. La expresión de gp90 pepsina-resistente, la molécula de superficie que regula a la baja la invasión de células, fue mayor en TCI que en parásitos TCIV y, en consecuencia, la capacidad de invasión de las formas metacíclicos TCIV fue mayor. moléculas de gp90 liberados espontáneamente por formas metacyclic TCI inhibieron la entrada del parásito en las células huésped. parásitos TCI exhibieron tasa de replicación intracelular baja.
Conclusiones
Nuestros hallazgos indican que la escasa capacidad de TCI linaje, y en menor grado de parásitos TCIV, al invadir el epitelio gástrico después de la infección oral de ratones puede estar asociada con la ineficiencia de formas metacíclicos, en particular de los parásitos TCI, a migrar a través de la capa de moco gástrico, para invadir las células epiteliales diana y replicar intracelularmente.
Palabras clave
Trypanosoma cruzi
TCI y TCIV linajes tripomastigotes metacíclicos infección Oral célula anfitrión Antecedentes invasión Francia el resultado de la infección por Trypanosoma cruzi
, el agente de la enfermedad de Chagas, puede variar mucho: 20-30% de los pacientes crónicamente infectados desarrollan miocarditis severa, alteraciones del tracto digestivo (megaesófago y /o megacolon) ocurrir con menos frecuencia, mientras que la mayoría permanece asintomática de por vida. El fondo genético y el estado inmunológico del huésped, así como la heterogeneidad de la población de parásitos pueden contribuir a esta diversidad [1] y, posiblemente, la ruta de la infección y la dosis infecciosa. De acuerdo con la nomenclatura intraespecífica establecida en 2009, T. cruzi
cepas se clasifican en seis unidades de mecanografía discretos (DTU), TCI-TCVI [2]. En los países del norte de América del Sur y en la región amazónica, donde megaesófago y megacolon son la miocardiopatía raro y chagásica es un lugar común, TCI es el agente predominante de la enfermedad de Chagas, en contraste con TC II, que ha sido aislado de la mayoría de los pacientes en la región central del este de Brasil donde la infección por T. cruzi
se asocia generalmente con síndromes de mega [1, 3]. TCI ha sido señalado como la causa principal de las enfermedades humanas resurgimiento en el norte de América del Sur, sobre la base de genotipado para la resolución a escala fina de la distribución geográfica, mediante un gran panel de marcadores polimórficos microsatélites [4]. En los últimos años, los brotes de enfermedades de Chagas aguda de la infección oral se han reportado en Venezuela [5, 6], Colombia [7, 8] y en la Amazonia brasileña [9, 10], donde TCI es prevalente y un pequeño porcentaje ha sido identificados como TCIV.
tripomastigotos están implicados en los casos de T. cruzi por vía oral
la infección antes mencionadas. Basándose en la presencia de nidos de amastigotes dentro de las secciones de la mucosa gástrica, pero no hay evidencia para T. cruzi
invasión dentro de la orofaringe o el esófago de animales estimulados por vía oral con formas metacíclicas derivados de insectos, se sugirió la invasión del epitelio de la mucosa gástrica para ser un portal único de entrada para sistémica T. cruzi
la infección [11]. Los experimentos con TCII y TCVI cepas de pacientes chagásicos han revelado que las moléculas de la superficie metacyclic etapa específica de gp82 y gp90, que actúan como promotor y el inhibidor de la invasión de destino celular, respectivamente [12, 13], desempeñan papeles fundamentales en la infección oral [14, 15]. Gp82, que se une selectivamente a mucina gástrica [16] está altamente conservada entre T. cruzi genéticamente divergente
linajes [17] y es resistente a la digestión por pepsina a pH ácido, mientras que las isoformas de gp90 con susceptibilidad diferencial a la digestión péptica pueden expresarse en diferentes cepas de modo que alta o baja infectividad por la vía oral se asocia con la expresión de la pepsina-susceptible o pepsina resistente gp90 isoforma [14, 15]. Ya sea tal diversidad en la expresión de gp90 e infectividad oral también se encuentra en TCI y TCIV DTU queda por investigar. No hay información sobre la infección oral experimental por estos parásitos, los datos disponibles se refieren a los ratones inyectados con tripomastigotes sanguíneos o formas metacíclicos por vía intraperitoneal [18], que es un modo no natural de la infección. Aquí analizamos tripomastigotes metacíclicos de TCI y TCIV cepas aisladas de pacientes chagásicos en diferentes regiones geográficas, en cuanto a la gp82 y gp90 expresión, la capacidad de migrar a través de la capa de mucina gástrica y para invadir el epitelio de la mucosa gástrica tras la administración oral en ratones. Para aclarar los mecanismos de invasión parasitaria, in vitro
se realizaron ensayos de invasión celular, utilizando células epiteliales humanas. A medida que los antígenos de superficie desprenden espontáneamente de tripomastigotes derivados de cultivos de tejidos [19] se han notificado a desempeñar un papel en la infección por T. cruzi
[20], se examinó si las moléculas de superficie fueron puestos en libertad por las formas metacyclic e influenciados invasión de la célula huésped.
Métodos de ensayo
parásitos y la invasión de la célula huésped
Trypanosoma cruzi
cepas de trypanosomatid Culture Collection (TCC), Departamento de Parasitología, Universidad de Sao Paulo, fueron amablemente proporcionados por el Dr. Marta MG Teixeira. Ellos fueron aislados de pacientes chagásicos en diferentes regiones geográficas: TCC: 28 (Amazonas, Brasil), TCC: 515 (Venezuela), TCC: 588 (Guatemala), TCC: 1522 (Paraíba, Brasil), TCC: 1434 (Amapá, Brasil ). Las cepas 28, 515, 588 y 1522 eran TCI y la cepa 1434, aislado de un individuo infectado por vía oral, fue TCIV. Como control, se utilizó la cepa CL (TCVI) en varios experimentos. Los parásitos se mantuvieron en función del ciclo en ratones y en el hígado de medio de infusión de triptosa. Para estimular la diferenciación, los parásitos se cultivaron durante un pasaje en TC100 (Vitrocell, Brasil) o de medio de Grace (Invitrogen) y las formas metacíclicos se purificaron mediante el paso a través de la columna DEAE-celulosa, como se describe [21]. células HeLa, las células epiteliales de carcinoma de origen humano, se hicieron crecer a 37 ° C en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM), suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS), estreptomicina (100 mg /ml) y penicilina (100 U /ml) en una atmósfera humidificada 5% de CO 2 atmósfera. ensayos de la invasión de células se realizaron como se detalla en otra parte [22], mediante la siembra de tripomastigotes metacíclicos purificados en cada pocillo de placas de 24 pocillos que contenían diámetro cubreobjetos de vidrio redondos de 13 mm revestida con 1,4 × 10 5 células HeLa, ya sea en DMEM con 10 % de FCS (D10) o en PBS ++ (PBS que contiene por litro: 140 mg de CaCl 2, 400 mg de KCl, 100 mg de MgCl 2,6H 2O, 100 mg de sulfato de magnesio 4.7H 2O, 350 mg de NaHCO 3). Después de 1 h de incubación con los parásitos, los cubreobjetos duplicadas se fijaron en solución de Bouin, se tiñeron con Giemsa, y secuencialmente se deshidrataron en acetona, una serie graduada de acetona: xilol (9: 1, 7: 3, 3: 7) y xilol. El número de parásitos intracelulares se contó en un total de 250 células.
La infección oral
De cinco a seis ratones Balb /c hembras semanas de edad, criados en las instalaciones de animales de la Universidad Federal de Sao Paulo, se utilizaron. Todos los procedimientos y los experimentos se ajustaban a la regulación del Comité de Ética institucional para la experimentación con animales, y el estudio fue aprobado por el Comité (Protocolo nº 0234/12). Los ratones fueron infectados con T. cruzi
formas metacíclicas por vía oral (5 × 10 7 parásitos en 0,1 ml de PBS por animal), utilizando 1 ml de la jeringa con aguja de sonda que se inserta en la boca de los animales. Para la detección de parásitos en el epitelio de la mucosa gástrica, el estómago de ratones inoculados por vía oral con formas metacíclicas se recogió 4 días después de la infección, se fijaron con 10% de formaldehído neutro para 24 h. Después del procesamiento por la deshidratación gradual en una serie graduada de solución de etanol, seguido de inmersión xileno y la incrustación en parafina, se cortaron en serie 5 micras secciones de tejido y se tiñeron con hematoxilina y eosina. En otra serie de experimentos, formas metacyclic se administra por vía oral en ratones (1 x 10 6 parásitos en 0,1 ml de PBS por animal) y comenzando el día 10 después de la inoculación, la parasitemia se monitorizó dos veces por semana mediante el examen de 5 muestras de sangre l recogida de la cola, en el microscopio de contraste de fase. En 30 días después de la infección, el estómago, el corazón y el hígado se recogieron y se procesaron para preparaciones histológicas, como se describe anteriormente.
Ensayo de migración parásito a través de la capa de mucina gástrica
filtros Transwell de policarbonato (3 micras poros, diámetro de 6,5 mm , Costar) se revistieron con 50 l de una preparación que contiene 10 mg /ml de mucina gástrica en agua. formas metacíclicas, en suspensión en 600 l de PBS, se añadieron a la parte inferior de las placas de 24 pocillos (1 x 10 7 parásitos /pocillo), los filtros transwell mucina recubiertos se colocaron en pocillos que contiene el parásito y 100 l de PBS eran añadido a la cámara de filtro. Después de 30 min y /o 1 h de incubación a 37 ° C, se recogieron 10 muestras mu l de la cámara de filtro para el recuento de parásitos.
Citometría de flujo y ensayos de inmunofluorescencia indirecta
tripomastigotes metacíclicos vivo (1 × 10 7 ) se incubaron en hielo durante 1 h con el anticuerpo monoclonal 3 F6 o 1G7, respectivamente dirigida a metacyclic molécula de la superficie etapa específica de gp82 o gp90. A partir de entonces, los parásitos fueron fijadas con 4% para-formaldehído durante 20 min. Después de lavados en PBS, los parásitos se incubaron con Alexa Fluor 488 conjugado anti-IgG de 1 h a temperatura ambiente y el número de parásitos fluorescentes se estimó con un BD AccuriTM C6 citómetro de flujo. parásitos control se incubaron sólo con el anticuerpo secundario. Para visualizar los lisosomas de células HeLa, cubreobjetos se incubaron con células adherentes durante 1 hora a 37 ° C en D10 o en PBS ++ o se incubaron con parásitos en D10 durante 1 h. Después de la fijación con 4% de p-formaldehído en PBS durante 30 min, las células se trataron con mM NH 50 4Cl en PBS durante 30 min y se lavaron en PBS. Las células se incubaron a continuación durante 1 h a temperatura ambiente con LAMP2 anti-humano de ratón diluidos 1: (v /v) en una solución de PBS que contenía 0,15% de gelatina, azida de sodio al 0,1% y 1% de saponina (PGN-saponina) 8. Después de los lavados en PBS, los cubreobjetos se incubaron durante 1 h con Alexa Fluor 568-conjugado anti-IgG de ratón (Invitrogen), se diluyó 1: 300 en PGN-saponina que contiene 500 ng /ml 10 mg /m DAPI faloidina-FITC y (4 ', 6'-dihidrocloruro de 1-diamino-2-fenilindol), seguido de lavados en PBS y posterior montaje de cubreobjetos en prolongar Gold (Invitrogen). Confocal imágenes fueron adquiridas en una Leica TCS SP8 de escaneo láser microscopio (Leica, Alemania), utilizando un objetivo de inmersión en aceite Plan-Apocromático 63X (apertura numérica 1.4). La serie de imágenes obtenidas a partir confocal z-pilas fueron procesados ​​y analizados utilizando Leica LAS AF (Leica, 2012, Alemania) y el software Imaris (Bitplane).
Preparación del parásito medio condicionado
formas metacíclicos (10 8) se incubaron a 37 ° C durante 1 h en 100 l medio completo D10, con falta de nutrientes PBS ++ o PBS. Después de la centrifugación, se desechó el sedimento y se recogió el sobrenadante (medio acondicionado). Para su uso en unos ensayos de la invasión de células del medio acondicionado se diluyó 1: 100 en PBS o D10 ++ y de transferencia de Western 10 l se cargó
Producción y purificación de la proteína gp82 recombinante
La proteína recombinante que contiene el. de longitud completa T. cruzi
secuencia de gp82 (GenBank base de datos TM, número de acceso L14824) en el marco con glutatión S-transferasa (GST), fue producido en E. coli DH5
-α y purificado como se resultados detallados.
en otra parte [23]. El análisis estadístico

t
la prueba del estudiante, tal como se aplica en el software GraphPad (versión 6.01), se empleó
la infección oral de ratones con T. cruzi
formas metacyclic
la capacidad de los parásitos TCI para infectar a los ratones por vía oral fue examinado en una serie de experimentos. Cuarenta ratones se separaron en 8 grupos de cinco animales. En un conjunto de experimentos, dirigidos a comprobar la invasión del epitelio gástrico por tripomastigotos, se utilizaron 4 grupos y cada grupo de cinco ratones recibieron una cepa del parásito diferente (5 × 10 7 parásitos por animal). Cuatro días después de la administración oral, se recogió el estómago de los ratones y se procesa para preparaciones histológicas. Se utilizó un gran número de parásitos en este caso, debido a que en estudios previos con la cepa TCI G, desde el ciclo de transmisión silvestre, habíamos encontrado que incluso con un alto inóculo muy pocos nidos de amastigotes, que corresponden a intracelularmente amastigotes replicantes, fueron detectables a las 4 días después de la infección oral. A pesar del gran inóculo, no hemos podido detectar nidos de amastigotes por análisis microscópico de secciones histológicas del estómago (Tabla 1). Se llevó a cabo otra serie de experimentos para determinar si había alguna diferencia en el tropismo tisular entre T. cruzi
cepas. Para ello, los 4 grupos restantes se usaron y cada grupo de cinco ratones recibieron una cepa del parásito diferente (1 × 10 6 parásitos por animal) y el curso de la infección se siguió durante 30 días. A partir del día 10, los niveles de parasitemia se controlaron dos veces a la semana, y en el día 30 el estómago, el corazón y el hígado se recogieron para el análisis histológico. En este caso, el inóculo fue menor porque razonó que, después de varias rondas de invasión celular y la replicación intracelular, nidos de amastigotes serían detectables. La parasitemia fue indetectable durante todo el período de observación pero la infección se confirmó en todos los grupos mediante la detección de los nidos de amastigotes en el estómago y /o en el corazón de los ratones (Tabla 1), pero no en el hígado. De la nota fue que en el estómago de ratones infectados con la cepa 1522, que deriva de un paciente chagásica crónica con insuficiencia cardíaca terminal [24], no se encontraron parásitos en el corazón, pero no en el estómago mientras que lo opuesto se aplica a la infección por la cepa 28 (Tabla 1). nidos amastigotes estuvieron presentes en gran número en el estómago de algunos ratones infectados con la cepa 28 o 588 (Tabla 1), presumiblemente como resultado de múltiples rondas de la invasión y la replicación intracelular en el epitelio gástrico. El hecho de que los parásitos no se detectaron en el estómago de ratón en 4 días después de la administración oral, pero sólo en un punto de tiempo más tarde, después de ciclos de replicación intracelulares, sugiere ya sea una migración ineficiente de formas metacíclicas a través de la capa de moco, invasión ineficiente de las células epiteliales diana y /o la multiplicación del parásito intracelular. Además de las cepas de TCI, se examinaron una cepa TCIV, 1434, derivado de un paciente infectado por vía oral. nidos amastigotes, en pequeñas cantidades, se detectaron en 3 ratones a cuarto día después de la infección en las secciones histológicas del estómago, pero los parásitos no se encontraron en el estómago o en el corazón 30 días después de la infección (Tabla 1). La parasitemia fue negativa durante todo el curso de la infección 30 días. hemocultivo positivo confirmó la infección por todas las cepas. También se examinaron las preparaciones histológicas para la presencia de procesos inflamatorios. Independientemente de la cepa del parásito, los focos inflamatorios eran apenas detectable en el estómago en el día 4 o 30 después de la infección, o en el corazón en el día 1 30.Table infección oral de ratones con formas metacíclicas de T. cruzi
strainsa
T. cruzi cepa
gratis (origen) guía empresas ratón
amastigotes nidos (número de secciones de tejido) guía empresas de estómago (día 4)

estómago (Día 30) guía empresas corazón (Día 30)
28 gratis (Brasil Amazonas)
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