Provider Zell Invasioun a mëndlech Wonn vun Trypanosoma cruzi analyséieren vun genetesch Gruppen TcI an TcIV aus chagasic patients

Provider Zell Invasioun a mëndlech Wonn vun Trypanosoma cruzi VerfÜgung analyséieren vun genetesch Gruppen TcI an TcIV aus chagasic Patienten VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background
Outbreaks vun Fouss Chagas Krankheet déi mëndlech Wonn gewiescht mat héichen Heefegkeet am Norde Südamerika dacks iwwer de leschten zéng Joer an Untersuchungshaft, wou Trypanosoma cruzi VerfÜgung antike TcI predominates, responsabel fir déi grouss Ursaach vun Aspekt Mënsch Krankheet Wiesen, an e klenge Prozentsaz ass wéi TcIV identifizéiert. Mechanisme vun mëndlech Wonn an Provider-Zell Invasioun duerch dës Parasiten sinn ganz wéineg verstan. Fir datt Fro Adress, analyséiert mir T. cruzi VerfÜgung aus chagasic Patienten an Venezuela, Guatemala a Brasilien isoléiert analyséieren. VerfÜgung Method VerfÜgung Trypanosoma cruzi VerfÜgung metacyclic trypomastigotes sech mëndlech inoculated an Mais. D'Maus Mo. véier Deeg gesammelt drop, souwéi de Mo an d'Häerz gesammelt 30 Deeg Post-Krankheet huet fir histological Analyse Filteren. Assays Luucht Wanderung duerch d'gastric mucus futti rescht waren Leeschtung vun der Parasiten Zielen datt gastric mucin-Beschichtete transwell Filter- traversed. Fir Zell Invasioun assays, sech mat metacyclic Formen incubated Mënsch epithelial Hela Zellen an d'Zuel vun Message Parasiten war gezielt. VerfÜgung Resultater VerfÜgung All TcI an TcIV T. cruzi VerfÜgung analyséieren kaum duerch d'mëndlech Wee infective goufen. Parasiten waren entweder undetectable oder sech am klenge Zuelen an der Maus Mo. véier Deeg Post mëndlech Administratioun fonnt. Replicating Parasiten waren am Mo. an /oder am Häerz 30 Deeg Post-Wonn fonnt. Als Verglach zu TcI antike, war d'Migratioun Kapazitéit vun TcIV der gastric mucin-Beschichtete filter Parasiten duerch méi héich, mä méi niddreg wéi déi vun TcVI metacyclic Formen Schatzkummer dass virdrun duerch d'mëndlech Wee héich infective gewise gin. Ausdrock vun pepsin-resistent gp90, d'Uewerfläch Protein datt Zell Invasioun downregulates, war héich an TcI wéi zu TcIV Parasiten an, d'Invasioun Kapazitéit vun TcIV metacyclic Formen iwwergaangen, war méi héich. Gp90 Molekülle spontan Verëffentlechung vun TcI metacyclic Formen inhibited d'Luucht Element an Provider Zellen. TcI Parasiten niddereg intracellular Gedächtnis Taux Schatzkummer. Konklusiounen
Eis Conclusiounen weg datt d'aarmséileg Kapazitéit vun TcI antike, an zu enger klenger Ofschloss vun TcIV Parasiten, gastric epithelium der mëndlech Wonn vu Mais an hypothetesch vläicht mat der inefficiency verbonne ginn vun metacyclic Formen, besonnesch vun TcI Parasiten, duerch d'gastric mucus futti ze opgeholl, Zil- epithelial Zellen ze violéieren a intracellularly ze behaapten. VerfÜgung Schlësselwieder VerfÜgung Trypanosoma cruzi VerfÜgung TcI an TcIV lineages metacyclic trypomastigotes Oral Wonn Host Zell Invasioun Background VerfÜgung d'Resultat vun Wonn vun Trypanosoma cruzi VerfÜgung, variéieren d'Primë vun Chagas Krankheet, kann daitlech: 20-30% vun chronically Krankheet Patienten entwéckelen schwéieren myocarditis, hire Restaurant vun der digestive TRACT (megaesophagus an /oder megacolon) geschéien manner oft, wobäi d'Majoritéit fir d'Liewen asymptomatic bleift. D'genetesch Hannergrond an der immunological Status vum Provider souwéi d'heterogeneity vun der Luucht Populatioun kann zu dësem Diversitéit [1] an eventuell de Wee vun Krankheet an der ustiechend Portioun bäidroen. Laut der Nomenclature intraspecific vun 2009 gegrënnt, T. cruzi VerfÜgung analyséieren an sechs diskret ennerluecht Unitéiten séiert ginn (DTUs), TcI-TcVI [2]. An Länner Norden vu Südamerika an an der Amazon Regioun, wou megaesophagus an megacolon sinn rare a chagasic cardiomyopathy ass Ongewinntes, ass TcI der predominant Agent vum Chagas Krankheet, am Géigesaz zu TcII, déi aus meescht Patienten an brasilianesche Mëtt Osten Regioun isoléiert gouf wou T. cruzi VerfÜgung Wonn ass normalerweis mat MEGA syndromes verbonne [1, 3]. TcI gouf als de grousse Ursaach vun Aspekt Mënsch Krankheet am Norde Südamerika, baséiert op genotyping fir labber-Skala Resolutioun vun der geographescher Verdeelung dodrun, e grousse Rot vun polymorphic microsatellite lues benotzt [4]. An de leschte Joren, hu outbreaks vun Fouss Chagas Krankhéeten mëndlech Wonn gouf am Venezuela matgedeelt [5, 6], Kolumbien [7, 8] an am brasilianesche Amazon [9, 10], wou TcI verwandelt ass an engem klenge Prozentsaz ass identifizéiert als TcIV. VerfÜgung Metacyclic trypomastigotes sinn an der uewen ausgefouert Fäll vu mëndlech T. cruzi VerfÜgung Wonn agebonne. Baséiert op der Präsenz vun amastigote Näschter bannent Rubriken vun gastric mucosa, mee keng Beweiser fir T. cruzi VerfÜgung Invasioun am oropharynx oder esophagus vun Déieren mëndlech mat Insekt-ofgeleet metacyclic Formen erausgefuerdert, war d'Invasioun vun gastric mucosal epithelium ugeholl ze ginn eng eenzegaarteg Portal vun Element fir systemesch T. cruzi VerfÜgung Wonn [11]. Experimenter mat TcII an TcVI analyséieren aus chagasic Patienten hunn bekannt ginn dass de metacyclic Etapp-spezifesch Uewerfläch Molekülle gp82 an gp90, deen den Promoteur Akt an inhibitor vun Zil- Zell Invasioun, bzw. [12, 13], dréien Biergleit am Elysée Wonn Leeschtung [14, 15]. Gp82, déi gastric mucin Photo'en selektiv zu [16] ass tëscht genetesch Duden T. cruzi VerfÜgung lineages héich conserved [17] an ass bis unzereegen resistent géint déi um dono pH pepsin hierkommen gp90 isoforms mat Ënnerscheed waat fir peptic unzereegen ausdrécke kann zu verschiddene analyséieren sou datt héich oder niddreg infectivity vun der mëndlech Wee ass mat dem Ausdrock vun pepsin-Rief oder pepsin-resistent gp90 isoform [14, 15] assoziéiert. Ob esou eng Diversitéit vun gp90 Ausdrock a mëndlech infectivity ass och fonnt an TcI an TcIV DTUs bleift propagéieren gin. Et gëtt keng Informatiounen iwwert experimentell mëndlech Wonn vun deene Parasiten, kuckt d'sinn Donnéeën ze Mais heijen mat Blutt trypomastigotes oder metacyclic Forme vun der intraperitoneal Wee [18] dat ass eng onnatiirlech Modus vun Wonn. Hei analyséiert mir metacyclic trypomastigotes vun TcI an TcIV aus chagasic Patienten zu verschiddene geographeschen Regiounen isoléiert analyséieren, wéi d'gp82 an gp90 Ausdrock Gréiss, d'Fähegkeet duerch gastric mucin futti ze opgeholl an gastric mucosal epithelium op mëndlech Administratioun an Mais ze violéieren. Fir d'Mechanisme vun Luucht Invasioun klären, kënschtlech VerfÜgung Zell Invasioun assays gesuergt huet, Mënsch epithelial Zellen benotzt. Als Uewerfläch spontan aus Otemschwieregkeeten Kultur-ofgeleet trypomastigotes datts antigens [19] eng Roll am T. cruzi VerfÜgung Wonn ze spillen gemellt goufen [20], iwwerpréift mir ob Uewerfläch Molekülle vun metacyclic Formen lassgelooss huet an Provider Zell Invasioun beaflosst.
Method VerfÜgung Parasiten an Provider Zell Invasioun assay VerfÜgung Trypanosoma cruzi VerfÜgung analyséieren aus Trypanosomatid Kultur Collection (tcc), Departement vun Parasitology, Universidade de São Paulo, sech duerch Dr. Marta MG Audit gëtt Teixeira. Tcc:: 28 (Amazon, Brasil), tcc: 515 (Venezuela), tcc: 588 (Guatemala), tcc: 1522 (Sternad, Brasil), tcc: 1434 (Amapá, Brasil Si goufen aus chagasic Patienten zu verschiddene geographeschen Regiounen isoléiert ). Analyséieren 28, 515, 588 an 1522 waren TcI an Deformatioun 1434, vom eng eenzel vun der mëndlech Wee Krankheet, war TcIV. Als Kontroll, CL Deformatioun (TcVI) war an e puer Experimenter benotzt. Parasiten sech cyclically zu Mais haten an zu Liewer infusion tryptose mëttelfristeg. Ze stimuléieren, dat, goufen Parasiten fir ee Passage zu TC100 (Vitrocell, Brasilien) oder Grace d'mëttel- (Invitrogen) an metacyclic Formen huet déi Trip duerch DEAE-cellulose Kolonn sidd ugebaut, wéi beschriwwen [21]. Hela Zellen, d'Mënscherechter carcinoma-ofgeleet epithelial Zellen, sech op 37 ° C an Dulbecco d'Minimum Néideg mëttlerer (DMEM), mat 10% An et Kallef serum (FCS), streptomycin (100 μg /ml) an penicillin (100 U nà ugebaut /ml) an engem humidified 5% CO 2 Atmosphär. Zell Invasioun assays sech als soss detailléiert opgeféiert [22], vun sidd metacyclic trypomastigotes op all gutt vun 24-gutt Placke Morden 13-mm Duerchmiesser ronnt coverslips mat 1,4 × 10 5 Hela Zellen Beschichtete wouvun, entweder an DMEM mat 10 % FCS (D10) oder vun PBS ++ (PBS wouvun pro Liter: 140 mg CaCl 2, 400 mg KCl, 100 mg MgCl 2.6H 2O, 100 mg MgSO 4.7H 2O, 350 mg NaHCO 3). No 1 h incubation mat Parasiten, goufen d'zweete coverslips zu Bouin Léisung fix, mat Giemsa Kierchefënster, an Rei léif an acetone, engem graded Serie vun acetone: xylol (9: 1, 7: 3, 3: 7) an xylol. D'Zuel vun intracellular Parasiten war am Ganzen 250 Zellen gezielt. VerfÜgung Oral Wonn VerfÜgung Five fir sechs Woch ale weiblech BALB /c Mais, flegelhaft an der Déier Gebei um Universidade Federal de São Paulo, gebraucht goufen. All Prozeduren an Experimenter conformed mat der Regelung vun der institutioneller ethneschen Komitee fir Déieren gemaach, an der Etude vun der Comité (Protokoll Nee 0234/12) abruecht huet. Mais sech mat T. cruzi Krankheet VerfÜgung metacyclic Forme vun der mëndlech Wee (5 × 10 7 Parasiten vun 0,1 ml PBS pro Déier), mat 1 ml Sprëtz mat gavage Effekt, datt an der Déier Mond gesaat gouf. Fir ze erkennen Parasiten vun der gastric mucosal epithelium, de Mo vun Mais mëndlech mat metacyclic Formen inoculated war 4 Deeg Post-Wonn gesammelt, mat 10% neutral formaldehyde fix fir 24 h. Der Veraarbechtung vun moderate eppes zu engem graded Serie vun Ethanol Léisung, déi xylene immersion duerno an parafin, Serien 5 μm Otemschwieregkeeten Rubriken huet Géigewier an Kierchefënster mat hematoxylin an eosin embedding. An anere Formatioun vun Experimenter, goufen metacyclic Formen mëndlech an Mais kritt (1 × 10 6 Parasiten vun 0,1 ml PBS pro Déier) an ab op den Dag 10 Post-inoculation, war parasitemia zweemol d'Woch iwwerwaacht duerch waat 5 μl Bluttprouwen an der Phase Géigesaz microscope vun de Schwäif, gesammelt. Um 30. Dag Post-Krankheet, de Mo, Häerz an Liewer ware fir histological Preparatiounen erfaasst a verschafft, wéi uewe beschriwwen. VerfÜgung Assay vun Luucht Wanderung duerch gastric mucin futti VerfÜgung Polycarbonate transwell Filter (3 μm Pore, 6,5 mm Duerchmiesser , ëmsou) sech mat 50 μl vun engem Virbereedung Beschichtete 10 mg /ml gastric mucin am Waasser mat. Metacyclic Formen, Sursis an 600 μl PBS, goufen zu der leschter vun 24-gutt Placke derbäi (1 × 10 7 Parasiten /gutt), de mucin-Beschichtete transwell Filter- sech Luucht-haltege Wells an 100 μl Faarwe op PBS sech zu de filter Chambre notéiert. No 30 min an /oder 1 h incubation bei 37 ° C, 10 μl Echantillon vun der filter Chambre fir Luucht Zielen gesammelt goufen. VerfÜgung cytometry Flow an indirekt immunofluorescence assays VerfÜgung Live metacyclic trypomastigotes (1 × 10 7 ) waren fir 1 h mat monoclonal antibody 3 F6 oder 1G7, bzw. metacyclic Etapp-spezifesch Uewerfläch ausernee op Äis incubated Protein gp82 oder gp90. Doropshin huet sech d'Parasiten fir 20 min mat 4% Para-formaldehyde fest. No Skeletten an PBS, goufen d'Parasiten bei Alexa Fluor 488-conjugated anti-IgG fir 1 h bei Raumtemperatur an der Zuel vun unisse Parasiten incubated war mat enger BD AccuriTM C6 Flow Cytometer geschat. Kontroll Parasiten sech just mat der Première antibody incubated. Ze visualiséieren lysosomes Hela Zell, coverslips mat Operstéiungszeen Zellen fir 1 h op 37 ° C an D10 oder vun PBS incubated waren ++, oder sech mat Parasiten an D10 fir 1 h incubated. No zéien mat 4% p-formaldehyde vun PBS fir 30 min, goufen d'Zellen mat 50 mm NH 4 cl vun PBS fir 30 min an gewäsch an PBS behandelt. D'Zellen sech dann fir 1 h bei Raumtemperatur mat anti-Mënsch LAMP2 Maus verdënntem incubated 1: 8 (v /v) an engem PBS Léisung mat 0,15% gelatin, 0,1% Natrium azide an 1% saponin (PGN-Saponin). No Skeletten an PBS, goufen d'coverslips incubated fir 1 h mat Alexa Fluor 568-conjugated anti-Maus IgG (Invitrogen), 1 verdënntem: 300 zu PGN-Saponin 500 wouvun Dummeldéng /ml phalloidin-FITC an 10 μg /m DAPI (4 ", 6'-1-diamino-2-phenylindole dihydrochloride), déi Mëtten an PBS a Kierzunge Opriichte vun coverslips zu verlängeren Gold (Invitrogen) gefollegt. Confocal Biller waren an enger Leica TCS SP8 Laser-Scannen microscope (Leica, Däitschland) mat enger Ueleg immersion Plan-Apochromat 63X Zil (z'identifizéieren Brennwäit 1,4) chrétienne. D'Serie vun Biller vun confocal Z-stacks kritt huet Filteren an analyséiert benotzt Leica Las AF (Leica, 2012, Däitschland) an Imaris (Bitplane) Software. VerfÜgung Virbereedunge Luucht bedingt mëttelfristeg VerfÜgung Metacyclic Formen (10 8) waren fir 1 h an 100 μl komplett D10 mëttelfristeg, Nährwert-entzu PBS ++ oder PBS bei 37 ° C incubated. No centrifugation, war d'PELLET discarded an der supernatant (bedingt mëttelfristeg) war gesammelt. 100 an D10 oder PBS ++ an iwwerlaascht fir Western blot 10 μl war VerfÜgung Production an Offäll vun recombinant gp82 FAQ VerfÜgung D'recombinant FAQ wouvun d': fir Asaz zu Zell Invasioun assays der bedingt mëttelfristeg 1 verdënntem war. voll-Längt T. cruzi VerfÜgung gp82 Haaptrei (GenBank TM auszeféieren, Bäitrëtt Zuel L14824) am Rumm mat gluthatione S-transferase (GST), war zu Kolibakterie VerfÜgung DH5-α a sidd produzéiert wéi detailléiert soss [23]. VerfÜgung statistique Analyse VerfÜgung D't VerfÜgung Test d'Student, als ëmgesat am GraphPad Software (Version 6.01), beschäftegt war. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Oral Wonn vun Mais mat T. cruzi VerfÜgung metacyclic Formen VerfÜgung d'Kapazitéit vun TcI Parasiten Mais vun der mëndlech Wee ze globalen war an engem Set vu Experimenter iwwerpréift. Véierzeg Mais goufen an 8 Gruppe vu fënnef Déieren getrennt. An eng Formatioun vun Experimenter, fir bei der Invasioun vun gastric epithelium vun metacyclic trypomastigotes Check, ware 4 Gruppe benotzt an all Grupp vu fënnef Mais scho verschidde Luucht Deformatioun (5 × 10 7 Parasiten pro Déier). Véier Deeg nom mëndlech Administratioun, d'Mo vun Mais war fir histological Preparatiounen erfaasst a verschafft. Eng héich Zuel vun Parasiten an dësem Fall benotzt gouf, well an de leschte Studie mat TcI Deformatioun G, aus der Wëllschwäin Transmissioun Zyklus, hu mir déi och mat engem héije inoculum ganz wéineg amastigote Näschter, déi replicating amastigotes zu intracellulary sëlwecht fonnt, waren Magnéitfeld um 4 Dag Post mëndlech Wonn. Trotz der grousser inoculum hätt, mir amastigote Näschter vun microscopic Analyse vun histological Rubriken vun de Mo. (Table 1) net erkennen. Aner Formatioun vun Experimenter war standing ze bestëmmen, ob keng Differenz an Otemschwieregkeeten tropism tëscht T. cruzi VerfÜgung analyséieren do war. Fir dat Zil, huet de Rescht 4 Gruppe benotzt an all Grupp vu fënnef Mais enger anerer Luucht Deformatioun dobäi (1 × 10 6 Parasiten pro Déier) an de Laf vun Wonn war fir 30 Deeg duerno. Start op den Dag 10, goufen d'parasitemia Niveauen zweemol d'Woch iwwerwaacht, an um Dag 30 de Mo, Häerz an Liewer ware fir histological Analyse gesammelt. An dësem Fall war d'inoculum kleng well mir opgebauten datt, no e puer Ronnen vun Zell Invasioun an intracellular Gedächtnis, amastigote Näschter festgestallt ginn hätt. Parasitemia war undetectable uechter d'Period vun der Observatioun awer Wonn war an all Gruppen vun erkennen amastigote Näschter an de Mo an /oder am Häerz vu Mais (Table 1), mee net an der Liewer confirméiert. Vun Note war, datt déi Efforten am Mo vun Mais mat Deformatioun 1522 Krankheet, déi aus enger chronescher chagasic Patient ofgeleet mat Enn-Etapp doséiert [24], Parasiten vun der Häerz fonnt huet awer net zu de Mo. logéiert de Géigendeel zu Lombardia applizéiert 28 (Table 1). Amastigote Näschter sech dobäi op héich Zuelen am Mo vun e puer mat Deformatioun Krankheet Mais 28 oder 588 (Table 1), viraussiichtlech vu multiple Ronne vun Invasioun an intracellular Gedächtnis an der gastric epithelium doraus. D'Tatsaach, datt Parasiten waren an der Maus Mo op 4 Dag no mëndlech Verwaltung net fonnt, mee nëmmen op enger spéider Zäit Punkt, der intracellular Gedächtnis Monaco, proposéiert entweder eng effikass Migratioun vun metacyclic Formen duerch d'mucus futti, effikass Invasioun vun Zil- epithelial Zellen an /oder intracellular Luucht méi. Nieft TcI analyséieren, iwwerpréift mir ee TcIV Klischee, 1434, aus enger mëndlech Krankheet Patient ofgeleet. Amastigote Näschter, am klenge Zuelen, goufen an 3 Mais um 4. Dag Post-Wonn am histological Rubriken vun de Mo. fonnt, mä Parasiten sech net an de Mo oder am Häerz 30 Deeg no der Wonn (Table 1) fonnt. Parasitemia war negativ uechter Laf vum 30. Dag Wonn. Positiv hemoculture bestätegt Wonn vun all analyséieren. Histological Preparatiounen sech och fir d'Presenz vun demagogesch Prozesser iwwerpréift. Onofhängeg vun der Luucht Klischee, goufen demagogesch Foci knapps Magnéitfeld an de Mo. um Dag 4 oder 30 Post-Krankheet oder am Häerz um Dag 30.Table 1 Oral Wonn vun Mais mat metacyclic Formen vun T. cruzi VerfÜgung strainsa
T. cruzi VerfÜgung Deformatioun VerfÜgung (Urspronk)
Mouse
Amastigote Näschter (Zuel vun Otemschwieregkeeten Rubriken)
Mo. (Day 4) VerfÜgung
Mo. (Day 30)
Heart (Day 30)
28 VerfÜgung (Brasilien Amazon) VerfÜgung 1 VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 2 VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 60 (20) VerfÜgung 0 (21) VerfÜgung 3 VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 285 (20) VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 4 VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 11 (18) VerfÜgung 0 (23) VerfÜgung 5 zur VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung NDb VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 515 VerfÜgung (Venezuela) VerfÜgung 1 VerfÜgung 0 (21) VerfÜgung 0 (24) VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 2 VerfÜgung 0 (19) VerfÜgung 0 (13) VerfÜgung 0 (25) VerfÜgung 3 VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 0 (21) VerfÜgung 0 (23) VerfÜgung 4 VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 45 (11) VerfÜgung 0 (21) VerfÜgung 5 zur VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 5 (21) VerfÜgung 0 (24) VerfÜgung 588 VerfÜgung (Guatemala)
1 VerfÜgung 0 (09) VerfÜgung 31 (19) VerfÜgung 10 (21) VerfÜgung 2 VerfÜgung 0 (12) VerfÜgung 17 (18) VerfÜgung 0 (20)
3 VerfÜgung 0 (09) VerfÜgung 6 (20) VerfÜgung 3 (15) VerfÜgung 4 VerfÜgung 0 (12) VerfÜgung 87 (19) VerfÜgung 0 (19)
5 zur VerfÜgung 0 (16) VerfÜgung 990 (20) VerfÜgung 0 (16) VerfÜgung 1522 VerfÜgung (Brasilien Nordostpassage) VerfÜgung 1 VerfÜgung 0 (16) VerfÜgung 0 (17) VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 2 VerfÜgung 0 (19) VerfÜgung 0 (15) VerfÜgung 4 (20) VerfÜgung 3 VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 0 (17) VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 4 VerfÜgung 0 (21) VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 6 (20) VerfÜgung 5 zur VerfÜgung 0 (21) VerfÜgung 0 (16) VerfÜgung 4 (18) VerfÜgung 1434 VerfÜgung (Brasilien Amazon) VerfÜgung 1 VerfÜgung 5 (40) VerfÜgung 0 (18) VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 2 VerfÜgung 3 (40) VerfÜgung 0 (24) VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 3 VerfÜgung 0 (36) VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 4 VerfÜgung 0 (35) VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 0 (21) VerfÜgung 5 zur VerfÜgung 5 (40) VerfÜgung 0 (20) VerfÜgung 0 (21) VerfÜgung aMetacyclic Formen vun der uginn Luucht analyséieren goufen telefonesch an Mais entscheet. An een Experiment, scho Mais 5 × 107 Parasiten a 4 Deeg méi spéit war de Mo fir histological Preparatiounen gesammelt. An anere Experimenter, scho Mais 1 × 106 Parasiten a 30 Deeg méi spéit, huet de Mo an d'Häerz fir histological Preparatiounen gesammelt VerfÜgung b ND VerfÜgung Migratioun vun T. cruzi VerfÜgung metacyclic Formen duerch d'net alles VerfÜgung gastric mucin futti VerfÜgung an assay d'Luucht br duerch d'mucus Layer am Mo. rescht war mat transwell Filter- bedeckt mat gastric mucin gesuergt, deen den haapt macromolecular Komponent vun der mucus ass. Virdrun Etuden hu gewisen, datt TcVI metacyclic Formen, wéi effizient gastric epithelium violéieren wann mëndlech an Mais verwalt, déi gastric mucin-Beschichtete transwell filter als effektiv wéi den eidelen filter traverse an dëser Propriétéit ass mat dem Ausdrock vun pepsin-resistent g82 Protein verbonne dat selektiv Photo'en ze gastric mucin [16, 25]. Gastric mucin-Beschichtete transwell Filter- waren op der Spëtzt vum Wells metacyclic Formen si gesat. No 30 a 60 min incubation bei 37 ° C, gouf d'Zuel vun Parasiten, datt den ieweschte Chambre erreecht gezielt. TcI Parasiten reduzéiert Muecht ugewisen duerch d'gastric mucin futti ze opgeholl, als Verglach zu Deformatioun CL (TcVI) datt den Kontroll zerwéiert (Figebam. 1a) confirméiert, datt gastric mucin als eng Barrière fir Migratioun protokolléiert. Metacyclic Formen vun TcIV Deformatioun 1434 traversed der gastric mucin-Beschichtete Filter méi efficace wéi TcI Parasiten, mä nach um ënneschten Taux wéi CL Deformatioun (Figebam. 1a). Mir iwwerpréift den Ausdrock vun gp82 a seng Resistenz zu pepsin zu TcI an TcIV analyséieren. Metacyclic Formen huet fir 1 h mat 2 mg /ml pepsin zu citrate Léisung um pH 3,5, eng Konditioun behandelt dat extensiv deforméiert BSA (Figebam. 1b), an der Nodeems soluble dovu ware vun Western blot, zesumme mat onbehandelt Parasiten analyséiert, monoclonal benotzt antibody (MAB-) 3 F6 zu gp82 française. Ier Reaktioun mat MAB- 3 F6, gläichberechtegt Luede vun der Luucht Echantillon war iwwerpréifen Ponceau-S staining (Zousätzleche Fichier 1: Dorënner S1A). Ausdrock vun gp82, déi no pepsin Behandlung intakt agekacht war, war ähnlech zu all analyséieren, anscheinend op e bësse méi héich Niveauen an Deformatioun 1434 wéi am TcI analyséieren (Figebam. 1b). Wéi dat kéint der méi héich Migratioun Kapazitéit vun Deformatioun 1434 erklären, am Verglach mir de gp82 Ausdrock vun dëser Klischee ze dass vun CL Klischee dass d'gastric mucin-Beschichtete filter effizient traversed (Figebam. 1a). Gp82 Ausdrock war ähnlecher an 1434 an CL analyséieren (Zousätzleche Fichier 1: Dorënner S1B ieweschte Rot). D'Präsenz vun gp82 Molekülle op der Luucht Uewerfläch war vun Flux cytometry Analyse (Figebam. 1c) confirméiert. Fir weider ënnersicht, ob Klischee 1434 ausgedréckt héich gp82 Niveau wéi TcI analyséieren, war de westlechen blot Analyse widderholl vun Deformatioun 515 als Vertrieder vun TcI antike benotzt. MT Echantillon vun den zwou analyséieren, an de selwechten Dag virbereet an zu der selwechter SDS-PAGE gelies electrophoresed, zougedréckt ähnleche Profil (Zousätzleche Fichier 1: Dorënner S1C). Vun all dësen Daten an zousätzlech FACs Analyse vun den zwee analyséieren, méi héich gp82 Niveauen am Deformatioun weist 1434 (Zousätzleche Fichier 1: Dorënner S1D), ass et net méiglech, datt d'famill Effizienz vun Deformatioun 1434 metacyclic Formen ze schléissen duerch d'gastric zu wanderen mucin futti ass bis den Ënnerscheed Ausdrock vun gp82 duerch. Als T. cruzi VerfÜgung spontan ass bekannt fir Uewerfläch Molekülle release [19, 20, 26], Luucht-datts Molekülle och responsabel fir d'observéiert Effekter ginn hätt. Mir kontrolléieren, ob gp82 an mëttelgrouss während 1 h incubation vun PBS, Zoustand vun gastric mucin Migratioun assay benotzt datts war. Western blot Analyse vun der supernatant der Luucht Entféierung, kritt wéi an der Methode Rubrik beschriwwen, Teamchef analyséieren 515 an 1434 datts bedeitend Montanten vun gp82, am Géigesaz zu CL Klischee datt gp82 bei knapps Magnéitfeld Niveauen Verëffentlechung hierkommen gp90 bei héijen Niveauen datts war déi Efforten 515 a bei ganz nidderegen Niveau vun analyséieren 1434 an CL (Figebam. 1d). Wann d'Molekülle differentially vun analyséieren 515 Hit, 1434 an CL eigentlech mat der Luucht Wanderung duerch d'gastric mucin Mantel Amëschung, dat géif d'héich an niddreg efficiencies vun analyséieren CL erklären an 515, respektiv, wéi och d'Zuelen ëmmer duerch Deformatioun Schatzkummer 1434 (Figebam. 1a). An Experimenter den Afloss vun der Verëffentlechung gp90 op Deformatioun 515 Migratioun ze beweisen, andeems gastric mucin-Beschichtete transwell Filter op der Spëtzt vum Wells wouvun metacyclic Formen eleng, oder gemëscht mat anti-gp90 MAB- 5E7 gesuergt huet, datt net mat stinn liewen Parasiten oder gemëscht heescht unerkennen MAB- 2C2 fir T. cruzi VerfÜgung amastigote Protein ausernee [27]. No 30 a 60 min incubation Echantillon vun den filter Chamber sech fir Luucht Zielen geholl. Parasiten gemëscht mat anti-gp90 MAB- 5E7, awer net déi mat stinn MAB- gemëscht 2C2, traversed der gastric mucin Pelz um héijer Zuel wéi Kontroll Parasiten (Figebam. 1e), datt gp90 mat Luucht Wanderung duerch onbekannte Mechanismus interferes datts beweist dass Debate net obligatoresch, gëtt dat zu gastric mucin gp90 kruet net [28]. Amëschung vun gp82, déi net bewisen gin hätt, well anti-gp82 MAB- 3 F6 Photo'en Parasiten ze liewen, wier ze verstoen, well et ze gastric mucin Photo'en. Mir iwwerpréift och ob gp90 an gp82 waren an neutral an dono pH differentially lassgelooss. Bedingt mëttelfristeg aus metacyclic Formen vun Deformatioun 515 incubated vun PBS kritt, pH 7,2, oder am citrate Prellbock, pH 3,5, war vun Western blot analyséiert. Release vun gp82 war ähnlech souwuel pH hierkommen gp90 Environnement niddreg war um dono pH (Zousätzleche Fichier 1: Dorënner S1B ënneschten Rot). Figebam. 1 Migratioun vun gp82-ausdrécken T. cruzi VerfÜgung metacyclic Formen duerch d'gastric mucin futti. engem Transwell Filtere mat gastric mucin bedeckt waren op Wells wouvun der uginn Luucht analyséieren gesat. Echantillon waren aus dem filter Chamber um 30 min an 60 min fir Luucht Zielen gesammelt. Wäerter sinn d'Moyenen ± Fils vun dräi onofhängeg Experimenter. Als Verglach zu CL Klischee, eng bedeitend manner Migratioun vun TcI analyséieren (** P VerfÜgung &Si besteet; 0.0005) an TcIV Deformatioun 1434 (* P VerfÜgung &Si besteet; 0.005) war um 60 min observéiert. b Metacyclic Formen, onbehandelt (-) oder behandelt (+) mat 2 mg /ml pepsin, um pH 3,5, waren déi vun Westeuropa blot analyséiert benotzt MAB- 3 F6 zu gp82 française. Als Kontroll vun pepsin Aktivitéit, BSA Kierchefënster vun Coomassie blo ass gewisen. c Live Parasiten sech fir 1 h op Äis incubated, an éier oder an der Präsenz vun MAB- 3 F6. No zéien, goufen d'Parasiten bei Alexa Fluor 488-conjugated anti-IgG an der Zuel vun unisse Parasiten ugeholl gouf incubated. d Parasiten sech fir 1 h an PBS incubated. No centrifugation Parasiten ze läschen, war d'bedingt PBS vun Western blotting benotzt MAB- 3 F6 an MAB- 5E7 analyséiert, bzw. gp82 an gp90 française. E Transwell Filtere mat gastric mucin bedeckt waren op Wells Faarwe mat metacyclic Formen vun Deformatioun 515 eleng, oder an der Präsenz vun der anti-gp90 MAB- 5E7 datt net liewen Parasiten oder stinn MAB- 2C2 heescht unerkennen. No 30 a 60 min incubation Echantillon vun den filter Chamber sech fir Luucht Zielen geholl. Wäerter sinn d'Moyenen ± Variant vun Retard VerfÜgung Host Zell Invasioun vum T. cruzi VerfÜgung metacyclic Formen VerfÜgung Kapazitéit vun metacyclic Formen reduzéiert an gastric epithelium op mëndlech Administratioun an Mais hypothetesch huet mat Ausdrock vun pepsin-resistent gp90 verbonne ginn bei héijen Niveauen, a deemolegt Weltbild mat aarmséileg infectivity Richtung cultured Mënsch epithelial Zellen [14, 15]. Mir iwwerpréift d'Fähegkeet vun TcI an TcIV metacyclic Formen Provider Zellen ze trieden. Parasiten sech mat Hela Zellen fir 1 h zu voll Nährwert DMEM an der Zuel vun intracellular Parasiten incubated war gezielt. Low Invasioun Muecht war eng gemeinsam Fonktioun vun all analyséieren, TcIV Deformatioun 1434 Deformatioun suer- méi performant wéi TcI analyséieren (Figebam. 2a). Western blot Analyse, monoclonal antibody zu gp90 ausernee benotzt, Teamchef all Parasiten pepsin-resistent gp90 (Figebam. 2b) ausgedréckt. D'Präsenz vun gp90 op Luucht Uewerfläch vun Flux cytometry Analyse an analyséieren 515 an 1434. An widderholl assays mat verschiddene Luucht Echantillon gepréift huet, gp90 war bei vill méi nidderegen Niveaue vun Deformatioun 1434 (.: Dorënner S1E Lalumi 2C, Zousätzleche Fichier 1) fonnt. Mir erwaarden eng héich Zell Invasioun Kapazitéit vun Deformatioun 1434 well d'observéiert Profil vun gp90 fir datt vun metacyclic Formen CL Deformatioun ähnlech ass (Zousätzleche Fichier 1: Dorënner S1B ieweschte Rot), déi net unerkannt sinn Anti-gp90 monoclonal antibodies (mAbs), gp90 Wiesen vum Western blot an Nodeems Extrait Magnéitfeld. Figebam. 2 Host Zell Invasioun vun gp90-ausdrécken T. cruzi VerfÜgung metacyclic Formen. engem Hela Zellen sech fir 1 h mat der uginn Luucht analyséieren an all Nährwert DMEM incubated. No zéien an Giemsa staining, war d'Zuel vun intracellular Parasiten am Ganzen 250 Zellen gezielt. Wäerter sinn d'Moyenen ± Fils vu véier onofhängegen assays am zweete gesuergt. Als Verglach zu CL Klischee, eng bedeitend manner Invasioun vun analyséieren 28, 588 an 1522 (*** P VerfÜgung &Si besteet; 0.0005), Deformatioun 515 (** P VerfÜgung &Si besteet; 0.001) an Deformatioun 1434 (* P
&Si besteet; 0.005) war vun Student t VerfÜgung Test fonnt. b Metacyclic Formen, onbehandelt (-) mat anti-gp90 MAB- 1G7 oder behandelt (+) mat 2 mg /ml pepsin, um pH 3,5, waren déi vun Westeuropa blot analyséiert. Als Kontroll vun pepsin Aktivitéit, BSA Kierchefënster vun Coomassie blo ass gewisen. c Live Parasiten sech fir 1 h op Äis incubated, an éier oder an der Präsenz vun MAB- 1G7. No zéien, goufen d'Parasiten bei Alexa Fluor 488-conjugated anti-IgG an der Zuel vun unisse Parasiten incubated gouf ugeholl VerfÜgung Effekt vun Uewerfläch Molekülle vum T. cruzi VerfÜgung metacyclic Formen zu Gaascht Zell Invasioun Verëffentlechung VerfÜgung Mir sech ob gp82 an gp90 sech an der Zell Invasioun assay während 1 h incubation zu komplett D10, dh, déi ënnert der Konditioun an mëttelgrouss datts. Western blot Analyse vun der bedingt mëttelfristeg, virbereet wéi an der Methode Rubrik beschriwwen, Teamchef gp90 um héchsten Niveau vun Deformatioun 515 an um ënneschten Niveau vun Deformatioun CL datts war hierkommen gp82 release vun analyséieren 515 an 1434 war haut eenzegaarteg visualized mä war knapps Magnéitfeld an CL Deformatioun supernatant (Figebam. 3A). Next, getest mir d'Méiglechkeet, datt d'invasiv Kapazitéit vun metacyclic Formen vun gp90 Hit an der mëttel- beaflosst war. CL Deformatioun metacyclic Formen huet fir 1 h mat Hela Zellen zu D10 mëttelfristeg eleng oder zu D10 plus 1% vun bedingt mëttel- vun 515 Deformatioun incubated, preincubated oder net mat anti-gp90 MAB- 1G7 oder mat stinn MAB- 2C2. CL Deformatioun gouf wéinst senger Zell héich Invasioun Muecht an opgepasst Reaktioun mat MAB- 1G7 benotzt. Als zu Lalumi gewisen. 3B, bedingt mëttelfristeg bedeitend reduzéiert Luucht Invasioun, seng inhibitory Aktivitéit war meeschtens déi anti-gp90 MAB- 1G7 neutraliséiert awer net vun stinn MAB- 2C2. Wahrscheinlech, dréit de gp82 präsent an bedingt mëttelfristeg och un der observéiert inhibitory Effekt, mee dat war schwéier ze beweisen, well anti-gp82 MAB- datt net liewen Parasiten heescht unerkennen net disponibel ass. An Hela zu D10 incubated Zellen fir 30 min mat metacyclic Formen vun Deformatioun 515 oder 1434, war et e puer vun lysosomes geréckelt (Figebam. 3C) déi aus dÉxistenz gp82 bis mëttelfristeg Verëffentlechung Resultat kann. D'recombinant gp82 FAQ gouf dës Lysosmen zu induce zu der Zell Peripherie Effekt [29], an event datt zu exocytosis lackelen an dréit fir parasitophorous vacuole Opstellung fir T. cruzi néideg VerfÜgung Invasioun [30-32]. Figebam. 3 Effekt vun gp90 vum T. cruzi VerfÜgung metacyclic Formen zu Gaascht Zell Invasioun lassgelooss. Figebam. Als zu Lalumi gewisen. Figebam. All Auteuren liesen an guttgeheescht d'final Versioun vun der mëttelalterlech Handschrëft. VerfÜgung

• Konsequent iwwerschaffen an meta-Analyse vun laparoscopic an oppen gastrectomy fir fortgeschratt gastric cancer
• Serum CD26 Niveauen an Patienten mat gastric Kriibs: e Roman Potential diagnostic Bewaacher