Domaćin invazije stanica i oralnu infekciju po trypanosoma cruzi sojeva genetske skupine TCI i TcIV iz chagasic patients

Host invazije stanice i oralne infekcije trypanosoma cruzi pregled sojeva genetske skupine TCI i TcIV iz chagasic pacijenata
apstraktne pregled pozadine
Epidemije akutne Chagas bolesti oralnim infekcije su najčešće prijavljena u proteklih deset godina, s većom učestalošću u sjevernoj Južnoj Americi, gdje trypanosoma cruzi pregled loza TCI prevladava, koji je odgovoran za najveći uzrok oporavlja ljudske bolesti, te mali postotak je identificiran kao TcIV. Mehanizmi oralne infekcije i invazije domaćin stanica po tih parazita, nedovoljno su poznati. Da bi se riješila to pitanje, analizirali smo T. cruzi
sojeva izoliranih iz chagasic pacijenata u Venezueli, Gvatemali i Brazilu. Pregled Metode pregled trypanosoma cruzi pregled metacyclic trypomastigotes oralno, nasadi se u miševa. Miša želuca prikupi četiri dana kasnije, i u želucu i srce sakupljena 30 dana poslije infekcije, su obrađene za histološku analizu. Testovi da oponaša parazit migracija preko želučane sluznice sloj se obavljaju u brojanju parazita koji prijeđeni želučanoj sluzi obložena transjažičnih filtere. Za staničnu invaziju analize, ljudske epitelne HeLa stanice su inkubirane s metacyclic oblicima i izbrojen je broj internaliziranih parazita. Pregled Rezultati
Sve TCI i TcIV T. cruzi pregled sojeva slabo infektivne oralnim putem. Paraziti su bili ili nemjerljiva ili otkrivene su u manjem broju u miša želucu četiri dana nakon oralne primjene. Replicirajući paraziti pronađeni su u želucu i /ili u srcu 30 dana nakon infekcije. U odnosu na TCI lozi, migracije kapacitet TcIV parazita kroz želučanu mucin obloženih filter bio je veći, ali niže od one koju prikazuje TcVI metacyclic oblike prethodno pokazao visoko infektivan oralnim putem. Izražavanje pepsinskom otporan gp90, molekule površina koja downregulates staničnu invaziju, bila je veća u TCI nego u TcIV parazita i, sukladno tome, invazija kapacitet TcIV metacyclic oblika bila je veća. Gp90 molekule spontano objavio TCI metacyclic oblicima inhibira ulazak parazita u stanice domaćina. TCI paraziti izložena niskim unutarstanični brzinu replikacije.
Zaključci pregled Naši rezultati pokazuju da je loša kapacitet TCI loze, te u manjoj mjeri od TcIV parazita, u invaziju želučani epitel nakon oralne infekcije miševa mogu biti povezane s neučinkovitošću od metacyclic oblika, a naročito od TCI parazita, migrirati kroz želučanu sluzi sloj, da napadnu ciljne stanice epitela i replicirati unutar stanice. pregled Ključne riječi
trypanosoma cruzi pregled TCI i TcIV loze Metacyclic trypomastigotes Oralna infekcija stanice domaćina invazija Pozadina pregled ishod infekcije Trypanosoma cruzi Netlogu, zastupnik Chagas bolest, mogu znatno varirati: 20-30% kronično zaraženih bolesnika razviju ozbiljne miokarditis, promjene u probavnom traktu (megaesophagus i /ili megacolon) javljaju rjeđe, dok je većina ostaje asimptomatska za život. Genetska pozadina i imunološki status domaćina, kao i heterogenost parazita populacije mogu doprinijeti raznolikosti [1], a možda i načinu infekcije i zarazne doze. Prema intraspecijes nomenklaturi osnovan u 2009, T. cruzi pregled sojeva su svrstane u šest odvojenih tipkanja jedinica (DTUs), TCI-TcVI [2]. U zemljama sjeverno od Južne Amerike, te u Amazon regiji, gdje megaesophagus i megacolon su rijetke i chagasic kardiomiopatija je uobičajena pojava, TCI je glavni uzročnik Chagas bolesti, za razliku od TCII, koji je izoliran od većine pacijenata u brazilskim središnjoj istočnoj regiji gdje T. cruzi infekcije pregled je obično povezan s mega sindroma [1, 3]. TCI je istaknuo kao glavni uzrok oporavlja ljudskih bolesti na sjeveru Južne Amerike, na temelju genotipa za rješavanje fino razmjera geografske distribucije, pomoću velikog zaslona mikrosatelitne markera polimorfnih [4]. U posljednjih nekoliko godina, epidemije akutnih Chagas bolesti oralnim zaraze zabilježeni su u Venezueli [5, 6], Colombia [7, 8] i brazilske Amazone [9, 10], gdje TCI je rasprostranjen i mali postotak je bio identificirani kao TcIV.
Metacyclic trypomastigotes su uključeni u gore navedeno slučajeva oralnog T. cruzi
infekcije. Temelju prisutnosti amastigote gnijezda u dijelovima sluznice želuca, ali nije bilo dokaza za T. cruzi
invazija u dušnik i jednjaku životinja koje su pobuđene oralno insekta-deriviranih metacyclic oblika, invazija želučane sluznice epitela sugerira da su jedinstveni portal za ulazak sustavne T. cruzi
infekcije [11]. Eksperimenti s TCII i TcVI sojeva iz chagasic pacijenata su pokazali da su metacyclic stage-specifične površinske molekule gp82 i gp90, koji djeluju kao promotor i inhibitor stanične invazije ciljne, odnosno [12, 13], imaju ključne uloge u usnoj infekcije [14, 15]. Gp82, što selektivno veže na želučanoj sluzi [16] je visoko zadržan među genetski divergentne T. cruzi pregled loza [17] i otporan je na probavu pepsinskom u kiselom pH, a gp90 izoformi s diferencijalnim podložnost peptičkog digestije može se izraziti u različitim sojevima da visokim ili niskim infekcija oralnim putem povezana s ekspresijom pepsinskom osjetljiv ili pepsinom otporna na gp90 izoforma [14, 15]. Bilo je takva raznolikost u gp90 izražavanja i usmenog infektivnost također se nalazi u TCI i TcIV DTUs ostaje da se istražiti. Nema podataka o eksperimentalnoj oralne infekcije tih parazita, dostupni podaci odnose se na miševima kojima je ubrizgan u krvi trypomastigotes ili metacyclic oblika intraperitonealno [18], što je neprirodno način infekcije. Ovdje smo analizirali metacyclic trypomastigotes od TCI i TcIV sojeva izoliranih iz chagasic pacijenata u različitim zemljopisnim područjima, što se tiče gp82 i gp90 izraza, sposobnost migrirati kroz želučanoj sluzi sloj i da napadnu želučane sluznice epitel nakon oralne primjene u miševa. Da pojasnimo mehanizme parazita invazije, in vitro pregled staničnu invaziju analize su izvršene pomoću ljudske epitelne stanice. Kao površinski antigeni spontano prolivena od trypomastigotes tkiva kulture izveden iz [19] su izvijestili da igraju ulogu u T. cruzi pregled infekcije [20], ispitali smo je li površinski molekula je objavio metacyclic oblicima i pod utjecajem invazije stanica domaćina.
metode
Paraziti i invaziju stanica domaćina test pregled trypanosoma cruzi
sojevi iz Trypanosomatid Culture Collection (TCC), Zavod za parazitologiju, sveučilišta u de Sao Paulo, je ljubazno od Dr. Marta MG Teixeira. Oni su izolirani iz chagasic pacijenata u različitim zemljopisnim područjima: TCC: 28 (Amazon, Brazil), TCC: 515 (Venezuela), TCC: 588 (Gvatemala), TCC: 1522 (Paraíba, Brazil), TCC: 1434 (Amapá, Brazil ). Sojevi 28, 515, 588 i 1522 bili TCI i soj 1434 izoliran od pojedinca inficiranih oralnim putem, bilo TcIV. Kao kontrola, CL soj (TcVI) se upotrebljava u nekoliko eksperimenata. Paraziti su održavani ciklički kod miševa i jetre infuzije triptozne medija. Stimulirati diferencijaciju, Paraziti su uzgajane u jednom prolazu TC100 (Vitrocell, Brazil) ili Grace medij (Invitrogen) i metacyclic oblici su pročišćeni propuštanjem kroz koloni DEAE-celuloze, kao što je opisano [21]. HeLa stanice, ljudske epitelne stanice karcinoma-deriviranih, su uzgojene na 37 ° C u Dulbeccovom Minimum Essential Medium (DMEM), uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FCS), streptomicinom (100 ug /ml) i penicilinom (100 U /ml) u vlažnoj atmosferi 5% CO 2 atmosfere. Invazije stanica Ispitivanja su provedena kao što je opisano na drugom mjestu, [22], cijepljenjem pročišćene metacyclic trypomastigotes na svaku jažicu 24-jažične ploče koje sadrže 13 mm promjera okrugla pokrovna stakalca prevučena s 1,4 × 10 5 HeLa stanice, ili u DMEM s 10 % FCS (D10) ili u PBS ++ (PBS koji sadrži po litri: 140 mg CaClz 2, 400 mg KCl, 100 mg MgCl 2.6H 2O, 100 mg MgSO 4.7H 2O, 350 mg NaHCO 3). Nakon 1 h inkubacije s parazitima, duple stakalca su fiksirani u Bouin otopini bojene sa Giemsa bojom i sekvencijalno dehidrirana u acetonu, ocjenjuju niz aceton: Ksilol (9: 1, 7: 3, 3: 7) i Ksilol. Broj intracelularni paraziti se broje u ukupno 250 stanica.
Usmeni infekcije pregled Pet do šest tjedana stare ženke BALB /c miševa, uzgojenih u životinjskom objekta na sveučilišta u Federal de Sao Paulo, koristi se. Svi postupci i eksperimenti suobličeni s regulacijom institucionalnog Etičkog komiteta za pokuse na životinjama, a studija je odobren od strane odbora (Protokol br 0234/12). Miševi su inficirani sa T. cruzi
metacyclic oblika peroralnim putem (5 × 10 7 parazita u 0,1 ml PBS-a, po životinji), 1 mL štrcaljke sa sonde koja je umetnuta u životinja usta. Za detekciju parazita u želučanom epitel sluznice, trbuh miševa oralno metacyclic oblicima se prikupi 4 dana nakon infekcije, fiksirane s 10% -tnim neutralnim formaldehida za 24 h. Nakon obrade postepenim dehidratacijom u gradiranog nizu otopinom etanola, nakon čega slijedi ksilen uranjanja i ugrađivanjem u parafin, serijski 5 um Rezovi tkiva su izrezani i obojeni s hematoksilinom i eozinom. U drugom skupu eksperimenata metacyclic oblici su dati oralno u miševa (1 × 10 6 parazita u 0,1 ml PBS-a, po životinji) i počinje na dan 10 nakon inokulacije, parazitemije praćen dvaput tjedno ispitivanjem 5 uzoraka lI krvi prikupljeni od repa, na fazni kontrast mikroskopom. U 30 dana nakon infekcije, želuca, srca i jetre su sakupljene i obrađene za histoloških preparata, kao što je gore opisano. Pregled Ispitivanje parazit migracija kroz želučanoj sluzi sloj pregled polikarbonat transjažična filtra (3 um pore, 6.5 mm promjera , Costar) obložene su s 50 ul preparata koji sadrži 10 mg /ml želučanoj sluzi u vodi. Metacyclic oblika, suspendiran je u 600 ul PBS-a, dodano je na dnu 24 jamica (1 × 10 7 parazita /jažici), mucin obložene Transwell filtera smještena jažice parazita koje sadrže na i 100 ul PBS-a doda filtera komoru. Nakon 30 min i /ili 1 h inkubacije pri 37 ° C, 10 ul uzorka se prikupe iz filter komore za parazita brojačem.
Protočnom citometrijom i indirektne imunofluorescencije testovi
uživo metacyclic trypomastigotes (1 × 10 7 ) su inkubirani na ledu tijekom 1 sata uz monoklonsko protutijelo 3 F6 i 1G7, usmjereni, odnosno na metacyclic stadij specifične površinske molekule gp82 i gp90. Nakon toga, paraziti su fiksirane s 4% para-formaldehida 20 min. Nakon ispiranja u PBS-u, paraziti su inkubirani s Alexa Fluor 488-konjugiranim anti-IgG 1 h na sobnoj temperaturi, a broj fluorescentnih parazita procijenjena s BD AccuriTM C6 protočnom citometru. Kontrola Paraziti su inkubirani sa samo sekundarnim antitijelom. Vizualizirati HeLa stanica lizosome pokrovnim s adherentne stanice su inkubirane tijekom 1 sata na 37 ° C u D10 ili PBS ++ ili su inkubirani s parazitima u D10 za 1 h. Nakon fiksiranja s 4% p-formaldehidom u PBS tijekom 30 min, stanice su tretirane s 50 mM NH 4Cl u PBS kroz 30 minuta i ispere u PBS. Stanice su zatim inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi s mišjim anti-ljudskim LAMP2 razrijedi 1: 8 (v /v) u PBS otopine koja sadrži 0,15% želatina, 0.1% natrijevog azida i 1% saponina (PGN-saponin). Nakon ispiranja u PBS-om, stakalca su inkubirana 1 h s Alexa Fluor 568-konjugirani anti-mišji IgG (Invitrogen), razrijeđen u omjeru 1: 300 u PGN-saponina sadrži 500 ng /ml phalloidin-FITC i 10 ug /m DAPI (4 ', 6'-1-diamino-2-fenilindol dihidroklorid), nakon čega slijedi ispiranja u PBS-u i zatim pričvršćenje pokrovnim u produžiti zlata (Invitrogen). Konfokalnom slike su stečene u Leica TCS SP8 laser-scanning mikroskopu (Leica, Njemačka) koristeći Plan-Apochromat 63X cilj uroniti u ulje (numerička apertura 1.4). Serija slika dobivena iz Osnove optike z-dimnjaka su obrađeni i analizirani pomoću Leica LAS AF (Leica, 2012, Njemačka) i Imaris (Bitplane) softver. Pregled Priprema parazit uvjetovanog medija
Metacyclic oblika (10 8) su inkubirane na 37 ° C tijekom 1 sata u 100 ul potpuna D10 medij ishranu lišen PBS ++ ili PBS. Nakon centrifugiranja se talog odbaci, a supernatant (kondicionirani medij) je sakupljen. Za upotrebu u invaziji Testovi stanične kondicionirani medij se razrijedi 1: 100 u PBS D10 ili ++ i za Western blot 10 ul napunjen je pregled proizvodnju i pročišćavanje rekombinantnog proteina gp82 pregled rekombinantnog proteina koji sadrži. T. cruzi pune duljine pregled gp82 sekvenci (GenBank baze TM podataka, pristupni broj L14824) u okvir s gluthatione s-transferaze (GST), proizveden je u E. coli DH5a
-a i pročišćen kako Detaljni drugdje [23]. pregled, Statistička analiza pregled, Student-ov t
testu, kako je implementirano u GraphPad software (verzija 6.01), bio je zaposlen. | Rezultati
Oralna infekcija miševa s T. cruzi pregled metacyclic oblici
sposobnost TCI parazita da inficiraju miševa oralnim putem je ispitana u nizu eksperimenata. Četrdeset miševi su razdvojeni u 8 grupe od po pet životinja. U jednoj grupi pokusa, s ciljem provjere invaziju želučanog epitela koje metacyclic trypomastigotes, korišteni su 4 grupe, a svaka grupa od pet miševa dobila drugu parazita naprezanje (5 × 10 7 parazita po životinji). Četiri dana nakon oralne primjene, želudac miševa je sakupljen i procesirani su za histološke pripravke. Veliki broj parazita je korišten u ovom slučaju, jer je u prethodnim studijama s TCI soja G, od divljeg ciklusa prijenosa, imali smo otkrili da čak i uz visoke cjepivo vrlo malo amastigote gnijezda, koji odgovaraju unutar stanice repliciranja amastigotes, mogli utvrditi pri 4 dan nakon oralne infekcije. Unatoč velikom inokuluma, nismo mogli otkriti amastigote gnijezda mikroskopskom analizom histoloških sekcija želucu (Tablica 1). Drugi set eksperimenata provedena je kako bi se utvrdilo da li je bilo razlike u tropizma tkiva između T. cruzi
sojeva. U tu svrhu, ostale 4 skupine su se koristili i svaka skupina od pet miševa dobila drugu parazita soja (1 × 10 6 paraziti po životinji) i tijek infekcije je uslijedila za 30 dana. Počevši od dana 10, razine parazitemije praćene su dva puta tjedno, a na dan 30 želuca, srca i jetre je uzeta za histološku analizu. U tom slučaju, cjepivo je bio manji jer je smatrao da, nakon nekoliko rundi invazije stanice i unutarstanični replikacije, amastigote gnijezda bi se otkriti. Parazitemije bio undetectable tijekom perioda promatranja ali infekcija je potvrđeno u svim skupinama detekcijom amastigote gnijezda u želucu i /ili na središtu miševa (Tablica 1), ali ne i u jetri. Zapisano je da je u želucu miševa inficiranih sojem 1522, koje potječe od kronične chagasic pacijenta s neuspjehom end-stage srca [24], paraziti su pronađeni u srcu, ali ne u želucu, dok suprotno primjenjuje na infekciju soju 28 (Tablica 1). Amastigote gnijezda bili su prisutni na velikom broju u želucu nekih miševa inficiranih sojem 28 ili 588 (Tablica 1), vjerojatno je posljedica više rundi invazije i unutarstanični replikacije u želučanog epitela. Činjenica da paraziti nisu otkrivene su u mišjim želucu na 4 dana nakon oralne primjene, ali tek u kasnijoj vremenskoj točki, nakon unutarstaničnih replikacije ciklusa, predložio bilo neučinkovito migraciju metacyclic oblicima kroz sluz sloja, neučinkovitog invazije epitelnih stanica ciljnih i /ili unutarstanični parazit množenja. Osim sojeva TCI, ispitali smo jednu TcIV naprezanje, 1434, dobiven iz oralno zaražena pacijenta. Amastigote gnijezda, u malim količinama, otkrivena su u 3 miševa na 4. dan nakon infekcije u histološkim dijelovima trbuha, ali paraziti nisu pronađene u želucu ili u srcu 30 dana nakon infekcije (Tablica 1). Parazitemije bio negativan tijekom tečaja 30 dana infekcije. Pozitivna hemoculture potvrdio infekcije svih vrsta. Histološki pripravci su također ispitani na prisutnost upalnih procesa. Neovisno soja nametnika, upalnih žarišta su jedva prepoznatljivi u želucu na dan 4 ili 30 post-infekcija, ili u središtu na dan 30.Table 1 oralnu infekcije miševa metacyclic oblika T. cruzi pregled strainsa
T. cruzi pregled soj
(podrijetla)
miš
Amastigote gnijezda (broj tkivnim)
želuca (4. dan) pregled
želuca (Dan 30)
Heart (Dan 30)
28 pregled (Brazil Amazon) pregled, 1 pregled 0 (20) pregled, 0 (20) pregled 0 (20) pregled 2 pregled, 0 (20)
60 (20) pregled, 0 (21)
3
0 (20)
285 (20) pregled 0 (20) pregled, 4
0 (20)
11 (18) pregled, 0 (23)
5
0 (20) pregled, NDB Netlogu 0 (20) pregled, 515 pregled (Venezuela)
1 pregled 0 (21) pregled, 0 (24) pregled, 0 (20) pregled 2 pregled, 0 (19) pregled 0 (13) pregled, 0 (25)
3 pregled 0 (20) pregled, 0 (21)
0 (23)
4
0 (20) pregled, 45 (11) pregled, 0 (21)
5 pregled 0 (20) pregled, 5 (21)
0 (24)
588
(Gvatemala)
1 pregled 0 (09)
31 (19)
10 (21) pregled 2 pregled, 0 (12)
17 (18)
0 (20)
3. pregled 0 (09) pregled, 6 (20) pregled, 3 (15) pregled, 4
0 (12)
87 (19)
0 (19)
5 pregled 0 (16) pregled, 990 (20)
0 (16) pregled, 1522 Netlogu (Brazil sjeveroistoku) pregled, 1 pregled 0 (16) pregled 0 (17) pregled, 0 (20) pregled 2 pregled, 0 (19) pregled, 0 (15) pregled, 4 (20) pregled 3
0 (20)
0 (17) pregled, 0 (20) pregled, 4
0 (21) pregled, 0 (20) pregled, 6 (20) pregled 5 pregled 0 (21)
0 (16) pregled, 4 (18) pregled, 1434 Netlogu (Brazil Amazon) pregled, 1 pregled 5 (40) pregled, 0 (18) pregled, 0 (20) pregled 2 pregled, 3 (40) pregled, 0 (24) pregled, 0 (20) pregled 3
0 (36) pregled, 0 (20) pregled, 0 (20) pregled, 4 pregled 0 (35) pregled, 0 (20) pregled, 0 (21) pregled 5 pregled 5 (40) pregled, 0 (20) pregled, 0 (21) pregled aMetacyclic oblici naznačenim parazitskih sojeva daje oralno u miševe. U jednom eksperimentu, miševi su dobili 5 × 107 parazita i 4 dana kasnije želudac je prikupljan histoloških preparata. U drugom eksperimentu, miševi su primili 1 × 106 parazita i 30 dana kasnije, želudac i srce su prikupljeni za histoloških preparata pregled b ND ne
određuje pregled migracije T. cruzi pregled metacyclic oblicima kroz želučanoj sluzi sloj pregled test za oponašanje parazita translokacije kroz sluzi sloj u želucu je izvedena pomoću Transwell filtera obložene s želučanoj sluzi, koja je glavni makromolekulski komponenta sluzi. Prethodna istraživanja su pokazala da TcVI metacyclic oblici, koji učinkovito napadaju želučani epitel kada se daju oralno u miševa, koji prolaze želučanoj sluzi obložene prerastanja filter što učinkovitije prazan filter i to svojstvo povezano je s ekspresijom pepsinskom otpornog g82 molekule koje selektivno veže na želučanoj sluzi [16, 25]. Želučanoj sluzi obložene Transwell filtera smještena na vrh jažica metacyclic oblika. Nakon 30 do 60 minuta inkubacije pri 37 ° C, broj parazita koji postigne gornju komoru se broje. TCI paraziti prikazuje smanjenu sposobnost da migriraju kroz želučanoj sluzi sloj, što je u odnosu na soj CL (TcVI) koji je služio kao kontrola (Sl. 1a), što potvrđuje da želučanoj sluzi ponašala kao barijera za migracije. Metacyclic oblici TcIV sojem 1434 prešao u želučanoj sluzi obložene filtre učinkovitije od TCI parazita, ali i dalje po nižim cijenama nego CL naprezanja (sl. 1). Ispitali smo ekspresiju gp82 i njegovu otpornost na pepsin u TCI i TcIV sojeva. Metacyclic oblici su liječeni tijekom 1 sata sa 2 mg /ml pepsina u citratnom otopini pri pH 3,5, a pod uvjetom da opsežno razgrađuje BSA (Slika 1b)., I deterdženata topljivi ekstrakti su analizirani Western blot uz neobrađenim nametnika, pomoću monoklonskih antitijela (mAb) 3 F6 usmjeren na gp82. Prije reakcije s Mab 3 F6, jednako opterećenje uzoraka parazita je provjerena Bulka-S bojenjem (Dodatni file 1: Slika S1A). Izraz gp82 koja je očuvana nepromijenjena nakon pepsinskom liječenje, bio je sličan kod svih sojeva, očito kod nešto više kod soja 1434 nego u sojevima TCI (Sl. 1b). Kako se to moglo objasniti veću migraciju kapaciteta soj 1434, usporedili smo gp82 izraz ovog soja onom u CL vrste koje učinkovito prešao želučanoj sluzi obložene filtar (Sl. 1). Gp82 izraz bio usporediv 1434. i sojeva CL (dodatne datotečne 1: Slika S1B gornja ploča). Prisutnost gp82 molekula na površini parazita potvrđena protočnom citometrijom (sl. 1c). Kako bi se dodatno ispitati je li soj 1434 izrazio veće gp82 razinama od sojeva TCI je Western blot analiza se ponavlja pomoću soja 515 kao predstavnik TCI loze. MT uzorci dvaju sojeva, pripremljenih na isti dan i elektroforetski u istom SDS-PAGE gela, pokazalo je sličan profil (Dodatni datoteke 1: Slika S1C). Iz svih tih podataka i dodatnih FACS analizom dvaju sojeva, koji pokazuju nešto veće gp82 razina u soja 1434 (Dodatni file 1: Slika S1D), nije moguće zaključiti da relativnoj učinkovitosti soj 1434 metacyclic oblika migrirati kroz želučanu mucin sloj je zbog diferencijalne ekspresije gp82. Kao T. cruzi pregled Poznato je da se spontano oslobađanje površinske molekule [19, 20, 26], molekule parazit-proliti mogla bi biti odgovorna za opaženih učinaka. Provjerili smo da li gp82 je prolivena u medij za vrijeme inkubacije od 1 sat u PBS-u, stanje se koristi u želučanoj sluzi testa migracije. Western blot analiza supernatanta nakon uklanjanja parazita, dobiven kao što je opisano u dijelu metode, pokazala je da sojevi 515 i 1434 proliti znatne količine gp82, za razliku od CL soja, koje oslobađa gp82 na jedva mjerljive razine, a gp90 prolivena u visokim razinama soj 515 i na vrlo niskim razinama sojevima 1434 i CL (sl. 1d). Ako molekule različito objavio sojevima 515, 1434 i CL zapravo ometati nametnika migraciju kroz želučanu mucin kaput, da bi objasnilo visoke i niske učinkovitosti sojeva CL i 515, po istom redoslijedu, kao i intermedijarni mogućnost izložene soj 1434 (Sl. 1a). Eksperiment pokazati utjecaj pušten gp90 na soju 515 migracije je izveden stavljanjem želučanoj sluzi obložena transjažičnih filtre na vrhu bunara sadrže metacyclic oblike sami ili pomiješani s anti-gp90 mAb 5E7 koji ne prepoznaje živih parazita ili miješati s nepovezanim mAb 2C2 usmjerena na T. cruzi
amastigote molekuli [27]. Nakon 30 i 60 minuta inkubacije, uzorci filterskog komore su uzeti za brojanje parazita. Paraziti pomiješan s anti-gp90 mAb 5E7, ali ne i one miješaju s nepovezanim mAb 2C2, prešao želučanoj sluzi kaput na većem broju kontrolnih parazita (Sl. 1 e), što znači da prolio gp90 ometa parazit migraciju kroz nepoznati mehanizam koji ne uključuje vezanje, uz uvjet da se ne gp90 vežu na želučanoj sluzi [28]. Smetnje od gp82, koja se ne može prikazati zbog anti-gp82 mAb 3 F6 veže za život parazita, bilo bi razumljivo jer se veže na želučanoj sluzi. Također smo ispitali da li gp90 i gp82 različito su pušteni u neutralnom i kiselom pH. Kondicionirani medij dobiven iz metacyclic oblika soja 515 inkubiran u PBS, pH 7,2, ili u citratnom puferu, pH 3,5, je analiziran pomoću Western blot. Oslobađanje gp82 bila je slična u oba pH, dok gp90 prolijevanja bio niži u kiselom pH (dodatne datotečne 1: Slika S1B donji prikaz). Sl. 1 Migracija gp82-izražavanje T. cruzi
metacyclic oblicima kroz želučanoj sluzi sloj. a Transwell filteri obloženi s želučane sluzi bili postavljeni na jažice koje sadrže naznačene sojeva parazita. Uzorci su prikupljeni iz filterskog komore na 30 minuta i 60 minuta za parazita brojanja. Vrijednosti su srednje vrijednosti ± SD iz tri neovisna eksperimenta. U odnosu na CL soja znatno manji migracije sojeva TCI (** P izvoznici < 0,0005) i TcIV soj 1434 (* P izvoznici < 0,005) zabilježena je na 60 minuta. b Metacyclic oblike, neobrađeni (-) ili s (+) s 2 mg /ml pepsinom, pri pH 3,5, analizirani su pomoću Western blota koristeći mAb 3 F6 usmjeren gp82. Kao kontrole pepsinskom aktivnosti BSA obojeni Coomassie blue je prikazan. c kamere Paraziti su inkubirani na ledu tijekom 1 sata, u odsustvu ili u prisustvu mAb 3 F6. Nakon fiksiranja, paraziti su inkubirani s Alexa Fluor 488-konjugiranim anti-IgG i broj fluorescentnih parazita procijenjena. d Paraziti su inkubirani 1 sat u PBS. Nakon centrifugiranja ukloniti parazite kondicionirani PBS je analiziran pomoću Western blota koristeći mAb 3 F6 i mAb 5E7, usmjereno na gp82 i gp90 respektivno. e Transwell filteri obloženi želučanoj sluzi su smješteni na jažice koje sadrže metacyclic oblika soja 515, sam ili u prisutnosti anti-gp90 mAb 5E7 ne prepoznaje živih parazita ili nepovezane mAb 2C2. Nakon 30 i 60 minuta inkubacije, uzorci filterskog komore su uzeti za brojanje parazita. Vrijednosti su srednje vrijednosti ± varijacija ponovljenih
domaćina invazije stanice T. cruzi
metacyclic oblika
smanjeni kapacitet metacyclic oblika na invaziju u želucu epitel nakon oralne primjene u miševa je povezana s ekspresijom pepsinskom otpornog gp90 na visokim razinama, i korelira sa slabom infektivnost prema kulturi humanih epitelnih stanica [14, 15]. Ispitali smo sposobnost TCI i TcIV metacyclic oblika za ulazak u stanice domaćina. Paraziti su inkubirani HeLa stanicama tijekom 1 sata, u punom hranjivom DMEM i izbrojen je broj intracelularnih parazita. Niska invazija kapacitet je zajedničko obilježje svih sojeva, TcIV soj 1434 soj koji pokazuje veću učinkovitost od sojeva TCI (Sl. 2a). Western blot analiza, pomoću monoklonalnog antitijela usmjerena na gp90, pokazala je da su svi paraziti izraženi pepsina otporan gp90 (sl. 2b). Prisutnost gp90 na parazit površini provjerena je analizom protočnom citometrijom u sojeva 515 i 1434. U ponovljenim analizama korištenjem različitih uzoraka parazit, gp90 pronađen je na mnogo nižim razinama u soja 1434 (slika 2c, dodatne datotečne 1:. Slika S1E). Očekuje se viši invazije stanica sposobnosti soja 1434, jer opažen profil gp90 je slična onoj za CL soj metacyclic oblika (Dodatni file 1: Slika S1B gornji panel), što ne prepoznaje anti-gp90 monoklonskih protutijela (Mab), gp90 bude prepoznatljiv u ekstraktu deterdženta metodom Western blot. Sl. Invazija 2 stanice domaćina po gp90-izražavanje T. cruzi
metacyclic oblika. a HeLa stanice su inkubirane tijekom 1 sata sa naznačenim parazitskih sojeva u punom hranjivom DMEM. Nakon fiksiranja i Giemsa bojenje, broj intracelularnih parazita brojana je ukupno 250 stanica. Vrijednosti su sredstva ± SD četiri neovisna pokusa izvedenih u duplikatu. U odnosu na CL soja znatno manji invazije sojeva 28, 588 i 1522 (*** P izvoznici < 0.0005), procijediti 515 (** P izvoznici < 0,001) i naprezanje 1434 (* p
< 0,005) otkriven je Student t
test. b Metacyclic oblike, neobrađeni (-) ili s (+) s 2 mg /ml pepsinom, pri pH 3,5, analizirani su pomoću Western blota koristeći anti-gp90 mAb 1G7. Kao kontrole pepsinskom aktivnosti BSA obojeni Coomassie blue je prikazan. c kamere Paraziti su inkubirani na ledu tijekom 1 sata, u odsustvu ili u prisustvu mAb 1G7. Nakon fiksiranja, paraziti su inkubirani s Alexa Fluor 488-konjugiranim anti-IgG i broj fluorescentnih parazita procijenjena pregled učinak površinske molekule oslobađaju T. cruzi pregled metacyclic oblika u stanične invazije domaćina pregled Ustanovili smo bilo gp82 i gp90 se bacaju u medij za vrijeme inkubacije od 1 sat u potpunom D10, dakle pod uvjetima koji se koristi u analizi stanične invazije. Western blot analiza uvjetovanog medija, pripremljen kao što je opisano u poglavlju metode, otkrila je da gp90 je prolivena na najvišim razinama od soja 515, a na najnižim razinama od strane soja CL, dok gp82 izdanju sojevima 515 i 1434 je jasno vizualizirati, ali je jedva prepoznatljiv u CL soj supernatant (Sl. 3a). Dalje, mi smo testirali mogućnost da invazivni kapacitet metacyclic oblika je bio pod utjecajem gp90 pustili u mediju. CL deformacije metacyclic oblici su inkubirani 1 sat sa HeLa stanica u mediju D10 sami ili u D10 plus 1% od kondicioniranog medija soja 515, prethodno inkubirani ili bez anti-gp90 mAb 1G7 ili nepovezanih mAb 2C2. CL soja se koristi zbog svojih stanica veći kapacitet invazije i nedostatak reakcije s Mab 1G7. Kao što je prikazano na slici. 3b, kondicionirani medij značajno smanjen parazit invaziju, njegov inhibitorni aktivnost je uglavnom neutralizira anti-gp90 mAb 1G7, ali ne i nepovezanih mAb 2C2. Vjerojatno, gp82 prisutan u prilagođenog medija također su pridonijeli promatranom inhibitorni učinak, ali to je teško dokazati jer je anti-gp82 mAb koje ne prepoznaje živih parazita nije dostupan. U HeLa stanicama inkubiranim u D10 kroz 30 minuta uz metacyclic oblicima soja 515 ili 1434., bilo je širenje lizosome (Sl. 3c) koji mogu nastati iz interakcije s gp82 pušten na medij. Rekombinantna gp82 protein je pokazano da inducira lizosom rasipanja na periferiju stanice [29], te događaja koji kulminira u eksocitozu i doprinosi za parasitophorous tvorbu vakuole potrebnog za T. cruzi pregled invazije [30-32]. Sl. 3. Učinak gp90 objavio T. cruzi pregled metacyclic oblika u invaziju stanica domaćina. Sl. Sl.

• Sustavni pregled i meta-analiza laparoskopske i otvorene gastrektomije za napredno želuca cancer
• Serum CD26 razina u bolesnika s karcinomom želuca: roman potencijalni dijagnostički marker