Gastheer cel invasie en orale infectie met Trypanosoma cruzi stammen van genetische groepen TCI en TcIV van chagasic patiënten

Gastheer cel invasie en orale infectie met Trypanosoma cruzi
stammen van genetische groepen TCI en TcIV van chagasic patiënten
Abstracte achtergrond
Uitbraken van acute ziekte van Chagas door orale infectie zijn vaak gemeld in de afgelopen tien jaar , met een hogere incidentie in het noorden van Zuid-Amerika, waar Trypanosoma cruzi
lineage TCI overheerst, die verantwoordelijk is voor de belangrijkste oorzaak van de oplevende ziekte bij de mens, en een klein percentage wordt geïdentificeerd als TcIV. Mechanismen van orale infecties en gastheercel invasie van deze parasieten worden slecht begrepen. Om die vraag te beantwoorden, analyseerden we T. cruzi
stammen geïsoleerd uit chagasic patiënten in Venezuela, Guatemala en Brazilië.
Methods
Trypanosoma cruzi
metacyclische trypomastigoten werden oraal geënt in muizen. De maag muis vier dagen later verzameld en de maag en het opgevangen 30 dagen na de infectie hart werden verwerkt voor histologische analyse. Testen om bootsen parasiet migratie door de maag slijmlaag werden uitgevoerd door het tellen van de parasieten die de maag mucine beklede Transwell filters gepasseerd. Voor cel invasie assays werden humane epitheel HeLa-cellen geïncubeerd met metacyclische formulieren en het aantal geïnternaliseerde parasieten werd geteld.
Resultaten
Alle TCI en TcIV T. cruzi
stammen werden slecht besmettelijk via de orale route. Parasieten werden ofwel detecteerbaar of gedetecteerd in kleine aantallen in het maag muizen vier dagen na orale toediening. Replicerende parasieten werden gevonden in de maag en /of in het hart 30 dagen na de infectie. In vergelijking met TCI geslacht, de migratie aantal TcIV parasieten via de gastrische mucine beklede filter was hoger, maar lager dan die vertoond door TcVI metacyclische vormen eerder aangetoond zeer besmettelijke langs orale weg zijn. Expressie van pepsine-resistente gp90, de oppervlakte molecuul dat celinvasie downregulates, was hoger dan in TCI TcIV parasieten en derhalve de invasie aantal TcIV metacyclische vormen hoger. Gp90 moleculen spontaan vrijgegeven door TCI metacyclische vormen remde de parasiet binnenkomst in gastheercellen. TCI parasieten vertoonden lage intracellulaire replicatiesnelheid.
Conclusies Home Onze bevindingen wijzen erop dat de geringe capaciteit van TCI geslacht, en in mindere mate van TcIV parasieten, in binnenvallende gastrische epitheel na orale infectie van muizen kan worden geassocieerd met de inefficiëntie van metacyclische vormen, in het bijzonder van TCI parasieten, te migreren via de maag slijmlaag, tot doel epitheelcellen binnen te dringen en om intracellulair te repliceren.
Sleutelwoorden
Trypanosoma cruzi
TCI en TcIV geslachten metacyclische trypomastigoten Oral infectie Host cel invasie Achtergrond
het resultaat van infectie door Trypanosoma cruzi
, de agent van de ziekte van Chagas, kan sterk variëren: 20-30% van de chronisch geïnfecteerde patiënten ontwikkelen ernstige myocarditis, wijzigingen van het spijsverteringskanaal (megaesophagus en /of megacolon) komen minder vaak voor, terwijl het merendeel asymptomatisch voor het leven blijft. De genetische achtergrond en de immunologische toestand van de gastheer en de heterogeniteit van de parasietenpopulatie kan bijdragen diversiteit [1] en eventueel de besmettingsweg en de infectieuze dosis. Volgens de intraspecifieke nomenclatuur in 2009 opgericht, T. cruzi
stammen worden ingedeeld in zes discrete typen eenheden (DTUs), TCI-TcVI [2]. In de landen ten noorden van Zuid-Amerika en in het Amazonegebied, waar de megaesophagus en megacolon zijn zeldzaam en chagasic cardiomyopathie is gemeengoed, TCI is de belangrijkste agent van de ziekte van Chagas, in tegenstelling tot TCII, die bij de meeste patiënten is geïsoleerd in de Braziliaanse centrale oosten regio waarbij T. cruzi infectie
meestal geassocieerd met mega syndromen [1, 3]. TCI is aangewezen als de belangrijkste oorzaak van de wederopleving van ziekte bij de mens in het noorden van Zuid-Amerika, op basis van genotypering voor fijne schaal resolutie van de geografische spreiding, met behulp van een groot paneel van polymorfe microsatelliet markers [4]. De laatste jaren zijn uitbraken van acute Chagas ziekten door orale infecties gerapporteerd in Venezuela [5, 6], Colombia [7, 8] en in de Braziliaanse Amazone [9, 10], waarbij TCI heerst en een klein percentage is geïdentificeerd als TcIV.
metacyclische trypomastigoten zijn betrokken bij de bedoelde gevallen van orale T. cruzi
infectie. Gebaseerd op de aanwezigheid van amastigoot nesten binnen gedeelten van het maagslijmvlies, maar geen bewijs voor T. cruzi
invasie in de orofarynx en slokdarm dieren oraal met insecten-afgeleide metacyclische vormen, werd de invasie van gastrische mucosale epitheel voorgesteld worden een unieke toegangspoort voor systemische T. cruzi
infectie [11]. Experimenten met TCII en TcVI stammen uit chagasic patiënten hebben uitgewezen dat de metacyclische fase-specifieke moleculen van het oppervlak gp82 en gp90, die fungeren als promotor en remmer van de doelgroep cel invasie, respectievelijk [12, 13], spelen een centrale rol in de orale infectie [14, 15]. Gp82, dat selectief bindt aan gastrische mucine [16] is sterk geconserveerd tussen genetisch divergente T. cruzi
lineages [17] en is resistent tegen digestie door pepsine bij een zure pH, terwijl gp90 isovormen met differentiële gevoeligheid voor peptische digestie kan worden uitgedrukt in verschillende stammen zodat hoge of lage infectiviteit bij orale toediening is geassocieerd met de expressie van pepsine-gevoelige of pepsine-resistente gp90 isovorm [14, 15]. Of een dergelijke diversiteit in gp90 expressie en orale besmettelijkheid wordt ook gevonden in TCI en TcIV DTUs moet nog worden onderzocht. Er is geen informatie over experimentele orale infectie door deze parasieten, de beschikbare gegevens betrekking hebben op muizen geïnjecteerd met bloed of trypomastigoten metacyclische vormen via de intraperitoneale route [18] dat een onnatuurlijke wijze van infectie. Hier analyseerden we metacyclische trypomastigoten van TCI en TcIV stammen afkomstig chagasic patiënten in verschillende geografische regio's, wat de gp82 en gp90 expressie, het vermogen om migreren door gastrische mucinelaag en gastrische mucosale epithelium binnendringen bij orale toediening in muizen. De mechanismen van parasiet invasie verduidelijken, in vitro
invasie assays werden uitgevoerd met behulp van humane epitheelcellen. Zoals oppervlakteantigenen spontaan werpen van weefselkweek afgeleide trypomastigoten [19] zijn gerapporteerd die een rol spelen bij T. cruzi infectie
[20], onderzochten we of oppervlak moleculen werden vrijgegeven door metacyclische vormen en beïnvloed gastheercel invasie.
Methods
Parasieten en gastheercel invasie assay
Trypanosoma cruzi
stammen uit Trypanosomatid Culture Collection (TCC), Departement Parasitologie, Universidade de São Paulo, werden vriendelijk verschaft door Dr. Marta MG Teixeira. Ze werden geïsoleerd uit chagasic patiënten in verschillende geografische regio's: TCC: 28 (Amazon, Brasil), TCC: 515 (Venezuela), TCC: 588 (Guatemala), TCC: 1522 (Paraíba, Brazilië), TCC: 1434 (Amapá, Brazilië ). Stammen 28, 515, 588 en 1522 waren TCI en de stam 1434, geïsoleerd uit een individu geïnfecteerd door de orale route, was TcIV. Als controle CL-stam (TcVI) werd in verschillende experimenten. Parasieten werden cyclisch bij muizen en in de lever infuus tryptose medium gehandhaafd. Om differentiatie te stimuleren, werden parasieten gekweekt gedurende één passage in TC100 (Vitrocell, Brazilië) of Grace's medium (Invitrogen) en metacyclische vormen werden gezuiverd door passage door DEAE-cellulose-kolom, zoals is beschreven [21]. HeLa-cellen, menselijke carcinoom afgeleide epitheliale cellen werden gekweekt bij 37 ° C in Dulbecco's minimaal essentieel medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), streptomycine (100 ug /ml) en penicilline (100 U /ml) in een bevochtigde 5% CO 2 atmosfeer. Invasie werden uitgevoerd zoals elders beschreven [22] en zaaien gezuiverde metacyclische trypomastigoten op elke well van 24-well platen met 13-mm diameter ronde glazen dekglaasjes bekleed met 1,4 x 10 5 HeLa-cellen, hetzij in DMEM met 10 % FCS (D10) of in PBS ++ (PBS dat per liter: 140 mg CaCl 2, 400 mg KCl, 100 mg MgCl 2.6H 2O, 100 mg magnesiumsulfaat 4.7H 2O, 350 mg NaHCO 3). Na 1 uur incubatie met parasieten werden de duplicaat dekglaasjes gefixeerd in Bouin oplossing, gekleurd met Giemsa en achtereenvolgens gedehydrateerd in aceton, een gegradeerde reeks van aceton: xylol (9: 1, 7: 3, 3: 7) en xylol. Het aantal intracellulaire parasieten geteld in totaal 250 cellen.
Orale infectie
Vijf tot zes weken oude vrouwelijke BALB /c muizen, gefokt in de dieren faciliteit in Universidade Federal de Sao Paulo, gebruikt. Alle procedures en experimenten in overeenstemming met de regeling van de institutionele Ethische Commissie voor dierproeven, en de studie werd goedgekeurd door het Comité (Protocol nr 0234/12). Muizen werden geïnfecteerd met T. cruzi
metacyclische vormen langs orale weg (5 x 10 7 parasieten in 0,1 ml PBS per dier), middels 1 ml spuit met maagsonde naald die in de mond dier werd ingebracht. Voor detectie van parasieten in de gastrische mucosale epithelium, de maag muizen oraal geïnoculeerd met metacyclische vormen werd verzameld 4 dagen na infectie met 10% neutrale formaline gefixeerd gedurende 24 uur. Na verwerking door geleidelijke dehydratatie in een gegradeerde reeks van ethanol, gevolgd door xyleen onderdompeling en inbedding in paraffine werden seriële 5 pm coupes gesneden en gekleurd met hematoxyline en eosine. In een andere reeks experimenten werden metacyclische vormen oraal toegediend in muizen (1 x 10 6 parasieten in 0,1 ml PBS per dier) en op dag 10 na inoculatie, parasitemie werd tweemaal per week gecontroleerd door onderzoek van 5 pl bloedmonsters verzameld uit de staart op de fasecontrastmicroscoop. Op 30 dagen na infectie, maag, hart en lever werden verzameld en bewerkt voor histologische preparaten, zoals hierboven beschreven.
Assay parasiet migratie door gastrische mucinelaag
polycarbonaat transwell filters (3 urn poriën, 6,5 mm diameter , Costar) werden bekleed met 50 gl van een preparaat dat 10 mg /ml maag mucine in water. Metacyclische vormen, gesuspendeerd in 600 pi PBS, werden toegevoegd aan de bodem van 24 putjes (1 x 10 7 parasieten /putje) werden de mucine beklede transwell filters op parasieten bevattende putjes gebracht en 100 ul PBS waren toegevoegd aan de filter kamer. Na 30 minuten en /of 1 uur incubatie bij 37 ° C, werden 10 pl monsters van de filterkamer van parasieten tellen.
Flowcytometrie en indirecte immunofluorescentie assays
Live metacyclische trypomastigoten (1 x 10 7 ) werden geïncubeerd op ijs gedurende 1 uur met monoklonale antilichaam 1G7 of 3 F6 respectievelijk betrekking op metacyclische stadiumspecifieke oppervlaktemolecuul gp82 en gp90. Daarna werden de parasieten gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 20 min. Na wassingen in PBS werden de parasieten geïncubeerd met Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-IgG gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en het aantal fluorescerende parasieten werd geschat met een BD AccuriTM C6 flowcytometer. Controle parasieten werden geïncubeerd met alleen het secundaire antilichaam. Visualiseren HeLa cel lysosomen, dekglaasjes met hechtende cellen werden gedurende 1 uur bij 37 ° C in D10 of PBS ++, of geïncubeerd met parasieten in D10 gedurende 1 uur. Na fixatie met 4% p-formaldehyd in PBS gedurende 30 minuten werden de cellen behandeld met 50 mM NH 4cl in PBS gedurende 30 minuten en gewassen in PBS. De cellen werden vervolgens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met muizen anti-humaan LAMP2 verdund 1: 8 (v /v) in PBS bevattende 0,15% gelatine, 0,1% natriumazide en 1% saponine (PGN-Saponine). Na wassingen in PBS, werden de dekglaasjes geïncubeerd gedurende 1 uur met Alexa Fluor 568-geconjugeerd anti-muis IgG (Invitrogen), verdund 1: 300 in PGN-saponine bevattende 500 ng /ml falloïdine-FITC en 10 ug /m DAPI (4 ', 6'-1-diamino-2-fenylindool dihydrochloride), gevolgd door wassen in PBS en daaropvolgende montage van dekglaasjes in ProLong Gold (Invitrogen). Confocale beelden werden in een Leica TCS SP8-laser scanning microscoop (Leica, Duitsland) verkregen met behulp van een olie-immersie Plan-Apochromat 63X objectief (numerieke lensopening 1,4). De reeks van beelden verkregen uit confocale Z-stacks werden verwerkt en geanalyseerd met behulp van Leica LAS AF (Leica, 2012, Duitsland) en Imaris (Bitplane) software.
Voorbereiding van de parasiet geconditioneerd medium
metacyclische vormen (10 8) werden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 1 h in 100 ul compleet medium D10, nutriënt-beroofd PBS ++ of PBS. Na centrifugeren werd de pellet verwijderd en het supernatant (geconditioneerd medium) werd verzameld. Voor gebruik in assays invasie het geconditioneerde medium werd verdund 1: 100 in PBS of D10 ++ en Western blot 10 ui werd geladen
Productie en zuivering van recombinant gp82 eiwit
recombinant eiwit dat het. full-length T. cruzi
gp82 sequentie (GenBank TM database, toegangsnummer L14824) in frame met glutathion S-transferase (GST), geproduceerd in E. coli DH5-α
en gezuiverd zoals gedetailleerd.
Resultaten elders [23] Statistische analyse
De Student's t Electronics Test.
, zoals geïmplementeerd in GraphPad software (versie 6.01), werd gebruikt
Oral infectie van muizen met T. cruzi
metacyclische vormen
het vermogen van TCI parasieten aan muizen te infecteren door de orale route werd in een reeks van experimenten onderzocht. Veertig muizen werden verdeeld in 8 groepen van vijf dieren. In één reeks experimenten, gericht op het controleren van de invasie van gastrische epitheel door metacyclische trypomastigoten, werden 4 groepen gebruikt en elke groep van vijf muizen kregen een andere parasiet stam (5 x 10 7 parasieten per dier). Vier dagen na orale toediening, de maag van muizen werd verzameld en bewerkt voor histologische preparaten. Een groot aantal parasieten werd in dit geval omdat studies met TCI stam G, het wild transmissiecyclus, hadden we dat zelfs met een hoge inoculum weinig amastigoot nesten, die overeenkomen met repliceren amastigoten intracellulary waren detecteerbaar 4 dag na orale infectie. Ondanks de grote inoculum, konden we niet amastigoot nesten te detecteren door microscopische analyse van coupes van de maag (tabel 1). Een andere reeks experimenten werd uitgevoerd om te bepalen of er sprake was van een verschil in weefseltropisme tussen T. cruzi
stammen. Daartoe werd de overige 4 groepen gebruikt en elke groep van vijf muizen kregen een andere stam parasiet (1 x 10 6 parasieten per dier) en het verloop van de infectie werd gevolgd gedurende 30 dagen. Beginnend op dag 10 werden de parasitemie niveau tweemaal per week gecontroleerd en op dag 30 de maag, hart en lever werden verzameld voor histologische analyse. In dit geval, het inoculum was kleiner omdat we vonden dat, na verscheidene ronden van invasie en intracellulaire replicatie, zou amastigoot nesten aantoonbaar zijn. Parasitemie was ondetecteerbaar gedurende de observatieperiode maar infectie in alle groepen bevestigd door detectie van amastigoot nesten in de maag en /of in het hart van muizen (Tabel 1), maar niet in de lever. Opmerkelijk was dat in de maag van muizen geïnfecteerd met stam 1522, die afkomstig zijn van een chronische chagasic patiënten met eindstadium van hartfalen [24], parasieten werden gevonden in het hart, maar niet in de maag, terwijl het andere toegepast voor infectie door stam 28 (Tabel 1). Amastigoot nesten waren bij hoge aantallen in de maag van sommige muizen geïnfecteerd met stam 28 en 588 (Tabel 1), waarschijnlijk resulterend uit meerdere rondes van invasie en intracellulaire replicatie in de maag epitheel. Dat parasieten niet werden gedetecteerd in de maag van de muis 4 dagen na orale toediening, maar pas op een later tijdstip na intracellulaire replicatie cycli voorgesteld hetzij een inefficiënte migratie van metacyclische vormen door de slijmlaag, inefficiënte invasie van target epitheelcellen en /of intracellulaire parasiet vermenigvuldiging. Naast TCI stammen, onderzochten wij een TcIV stam 1434, afgeleid van een oraal geïnfecteerde patiënt. Amastigoot nesten, in kleine hoeveelheden aangetroffen in 3 muizen op dag 4 na infectie in histologische secties van de maag, maar parasieten werden niet gevonden in de maag of in het hart 30 dagen na infectie (tabel 1). Parasitemie was negatief in de loop van 30 dagen infectie. Positieve hemoculture bevestigde infectie door alle stammen. Weefselpreparaten werden eveneens onderzocht op de aanwezigheid van ontstekingsprocessen. Ongeacht de parasiet stam, ontsteking foci waren nauwelijks detecteerbaar in de maag op dag 4 en 30 na infectie of de hart op dag 1 30.Table Orale infectie van muizen met metacyclische vormen van T. cruzi
strainsa
T. cruzi
stam
(oorsprong)
Muis
amastigoot nesten (aantal weefselcoupes)
Maag (dag 4)

Maag (Dag 30)
Hart (Dag 30)
28
(Brazilië Amazon) 1
0 (20)
0 (20)
0 (20) 2
0 (20)
60 (20)
0 (21)
3
0 (20)
285 (20)
0 (20) verhuur 4
0 (20)
11 (18)
0 (23)
5
0 (20)
NDB
0 (20)
515
(Venezuela) 1
0 (21)
0 (24)
0 (20) 2
0 (19)
0 (13)
0 (25)
3
0 (20)
0 (21)
0 (23) verhuur 4
0 (20)
45 (11)
0 (21)
5
0 (20)
5 (21)
0 (24)
588
(Guatemala)
1
0 (09)
31 (19)
10 (21) 2
0 (12)
17 (18)
0 (20)
3
0 (09)
6 (20)
3 (15) verhuur 4
0 (12)
87 (19)
0 (19)
5
0 (16)
990 (20)
0 (16)
1522
(Brazilië Northeast) 1
0 (16)
0 (17)
0 (20) 2
0 (19)
0 (15) verhuur 4 (20)
3
0 (20)
0 (17)
0 (20) verhuur 4
0 (21)
0 (20)
6 (20)
5
0 (21)
0 (16) verhuur 4 (18)
1434
(Brazilië Amazon) 1
5 (40)
0 (18)
0 (20) Pagina 2
3 (40)
0 (24)
0 (20)
3
0 (36)
0 (20)
0 (20) verhuur 4
0 (35)
0 (20)
0 (21)
5
5 (40)
0 (20)
0 (21)
aMetacyclic vormen van de aangegeven parasietenstammen werden oraal toegediend in muizen. In één experiment kregen muizen 5 x 107 parasieten en 4 dagen later werd de maag verzameld voor histologische preparaten. In een ander experiment kregen de muizen 1 × 106 parasieten en 30 dagen later, de maag en het hart werden verzameld voor histologische voorbereidingen
b ND
niet bepaald
Migratie van T. cruzi
metacyclische vormen door middel van de maag mucinelaag
assay de parasiet translocatie bootsen door de slijmlaag in de maag werd uitgevoerd middels Transwell filters gecoat met gastrische mucine, die de belangrijkste macromoleculaire component van het slijm. Eerdere studies hebben aangetoond dat TcVI metacyclische vormen, die gastrische epitheel bij orale toediening in muizen efficiënt binnenvallen, doorkruisen de gastrische mucine bekleed transwell filter effectief de lege filter en deze eigenschap wordt geassocieerd met de expressie van pepsine-resistente G82 molecuul dat selectief bindt aan gastrische mucine [16, 25]. Gastrische mucine beklede Transwell filters werden bovenop putjes die metacyclische vormen. Na 30 en 60 minuten incubatie bij 37 ° C, werd het aantal parasieten dat de bovenkamer bereikt geteld. TCI parasieten weergegeven verminderd vermogen tot migreren door de gastrische mucine laag, vergeleken met stam CL (TcVI) dat diende als controle (fig. 1a), bevestigd dat gastrische mucine fungeerde als een barrière voor de migratie. Metacyclische vormen van TcIV stam 1434 doorkruist het maag-mucine gecoate filters efficiënter dan TCI parasieten, maar nog steeds op lagere tarieven dan de CL-stam (Fig. 1a). We hebben gekeken naar de expressie van gp82 en de weerstand tegen pepsine in TCI en TcIV stammen. Metacyclische vormen werden gedurende 1 uur met 2 mg /ml pepsine citraat oplossing bij pH 3,5, een aandoening die uitgebreid afgebroken BSA (fig. 1b), en het detergens oplosbare extracten werden geanalyseerd door Western blot, samen met onbehandelde parasieten gebruikmaking van monoklonale antilichaam (mAb) 3 F6 gericht gp82. Voordat reactie met mAb 3 F6, gelijke belading van de parasiet monsters werd gecontroleerd door Ponceau-S kleuring (Extra file 1: Figuur S1A). Expressie van gp82 die intact na behandeling met pepsine werd bewaard, was vergelijkbaar in alle stammen, blijkbaar op een enigszins hoger niveau dan in stam 1434 in TCI stammen (Fig. 1b). Aangezien dit hogere capaciteit migratie van stam 1434 kon verklaren, vergeleken we de gp82 expressie van deze stam met die van CL stam die de gastrische mucine-coating (fig. 1a) efficiënt doorlopen. Gp82 expressie was vergelijkbaar in 1434 en CL-stammen (Extra file 1: Figuur S1B bovenste paneel). De aanwezigheid van gp82 moleculen op het oppervlak parasiet werd bevestigd door flowcytometrie-analyse (fig. 1c). Om verder te onderzoeken of stam 1434 uitgedrukt hogere niveaus gp82 dan TCI-stammen, werd de Western Blot analyse herhaald door het gebruik van stam 515 als vertegenwoordiger van TCI afkomst. MT monsters van de twee stammen, bereid op dezelfde dag aan elektroforese op dezelfde SDS-PAGE gel, toonde vergelijkbare profiel (aanvullende bestandsinformatie 1: Figuur S1C). Uit deze gegevens en de FACS-analyse van de twee stammen, weergegeven iets hogere gp82 niveaus in stam 1434 (aanvullende bestandsinformatie 1: Figuur S1D), is het niet mogelijk om te concluderen dat de relatieve efficiëntie van stam 1434 metacyclische vormen migreren door de maag mucinelaag komt door de differentiële expressie van gp82. Zoals T. cruzi
is bekend oppervlak moleculen spontaan loslaat [19, 20, 26], parasiet loods moleculen zou ook verantwoordelijk zijn voor de waargenomen effecten ervan. We hebben gekeken of gp82 in medium vergoten werd gedurende 1 uur incubatie in PBS, conditie gebruikt in de maag mucine migratie test. Western blot analyse van het supernatans na parasiet verwijdering, verkregen zoals beschreven in de paragraaf werkwijzen gebleken dat stammen 515 en 1434 werpen aanzienlijke hoeveelheden gp82, in tegenstelling tot CL stam die gp82 in nauwelijks detecteerbare hoeveelheden vrijgegeven, terwijl gp90 vloeide bij hoge niveaus door stam 515 en tegen zeer lage niveaus van stammen 1434 en CL (fig. 1d). Indien de moleculen differentieel vrijgegeven door stammen 515, 1434 en CL in feite interfereren met de parasiet migratie door de gastrische mucine laag, zou de hoge en lage rendementen stammen CL en 515 respectievelijk, en het middenniveau vertoond door stam verklaren 1434 (fig. 1a). Een experiment om de invloed van vrijgekomen gp90 tonen op stam 515 migratie werd uitgevoerd door het plaatsen gastrische mucine bekleed transwell filters bovenop putjes die metacyclische vormen alleen of gemengd met anti-gp90 mAb 5E7 dat geen levende parasieten herkent of gemengd met ongerelateerde mAb 2C2 gericht op T. cruzi
amastigoot molecule [27]. Na 30 en 60 minuten incubatie werden monsters uit de filterkamer genomen parasiet tellen. Parasieten gemengd met anti-gp90 mAb 5E7, maar niet die vermengd met ongerelateerde mAb 2C2, doorkruist de gastrische mucine laag bij hogere aantallen dan controle parasieten (fig. 1e), wat aangeeft dat gp90 werpen verstoort parasiet migratie door onbekende mechanisme dat geen sprake bindende mits gp90 niet bindt aan gastrische mucine [28]. Inmenging van gp82, die niet konden worden aangetoond omdat anti-gp82 mAb 3 F6 bindt aan parasieten leven zou begrijpelijk omdat het bindt aan maag mucine. We onderzochten ook of gp90 en gp82 differentieel werden vrijgelaten in neutrale en zure pH. Geconditioneerd medium verkregen uit metacyclische vormen van stam 515 geïncubeerd in PBS, pH 7,2, of citraatbuffer, pH 3,5, werd geanalyseerd door Western blot. Vrijgave van gp82 was gelijk aan beide pH, terwijl gp90 vergieten lager bij zure pH (Extra file 1: Figuur S1B onderste paneel) was. Fig. 1 Migratie van-gp82 uitdrukken T. cruzi
metacyclische vormen door de maag mucine laag. een Transwell filters gecoat met gastrische mucine werden op de aangegeven putjes die parasietenstammen geplaatst. Werden verzameld uit de filterkamer 30 min en 60 min voor parasiet tellen. Waarden zijn gemiddelden ± SD van drie onafhankelijke experimenten. In vergelijking met CL-stam, een significant lagere migratie van TCI stammen (** P Restaurant < 0,0005) en TcIV stam 1434 (* P Restaurant < 0,005) werd waargenomen bij 60 min. b metacyclische vormen, onbehandeld (-) of behandeld (+) met 2 mg /ml pepsine bij pH 3,5, werden geanalyseerd door Western blot met behulp van mAb 3 F6 gericht gp82. Als controle pepsine activiteit, wordt BSA gekleurd met Coomassie blauw getoond. c Levende parasieten werden geïncubeerd op ijs gedurende 1 uur, in afwezigheid of in aanwezigheid van mAb 3 F6. Na fixatie werden de parasieten geïncubeerd met Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-IgG en het aantal fluorescerende parasieten geschat. d Parasieten werden gedurende 1 uur in PBS. Na het centrifugeren om parasieten te verwijderen, werd het geconditioneerde PBS geanalyseerd door Western blotting met behulp van mAb 3 F6 en mAb 5E7, gericht op respectievelijk gp82 en gp90. e Transwell filters gecoat met gastrische mucine geplaatst op putjes die metacyclische vormen van stam 515 alleen of in aanwezigheid van anti-gp90 mAb 5E7 die levende parasieten of verbonden mAb 2C2 niet herkent. Na 30 en 60 minuten incubatie werden monsters uit de filterkamer genomen parasiet tellen. Waarden zijn gemiddelden ± variatie duplicaten
Gastheercel invasie door T. cruzi
metacyclische vormen
Verminderde capaciteit van metacyclische vormen binnendringende gastrische epitheel bij orale toediening in muizen is geassocieerd met expressie van pepsine-resistente gp90 op een hoog niveau, en correleert met een slechte infectiviteit richting gekweekte humane epitheelcellen [14, 15]. We hebben gekeken naar het vermogen van TCI en TcIV metacyclische formulieren om gastheercellen te voeren. Parasieten werden geïncubeerd met HeLa cellen gedurende 1 uur in volledig DMEM voedingsstoffen en het aantal intracellulaire parasieten geteld. Invasie lage capaciteit is een gemeenschappelijk kenmerk van alle stammen TcIV stam 1434 stam vertoont hoger rendement dan TCI stammen (Fig. 2a). Western blot analyse, met gebruikmaking van monoklonaal antilichaam gericht tegen gp90, bleek dat alle parasieten expressie pepsine-resistente gp90 (fig. 2b). De aanwezigheid van gp90 op parasiet oppervlak werd gecontroleerd door flowcytometrieanalyse in stammen 515 en 1434. In herhaalde testen met behulp van verschillende parasiet monsters werd gp90 gevonden bij veel lagere niveaus in stam 1434 (figuur 2c, Extra file 1:. Figuur S1E). We verwachtten een hogere celinvasie capaciteit van stam 1434 omdat de waargenomen profiel van gp90 is vergelijkbaar met die van CL stam metacyclische vormen (aanvullende bestandsinformatie 1: Figuur S1B bovenste paneel), die niet door anti-gp90 monoklonale antilichamen (mAbs) zijn opgenomen, gp90 detecteerbaar in detergent extract door Western blot. Fig. 2 Host cel invasie door gp90 expressie T. cruzi
metacyclische vormen. HeLa cellen werden gedurende 1 uur met de aangegeven parasietenstammen volledig DMEM voedingsstoffen. Na fixatie en Giemsa kleuring, werd het aantal intracellulaire parasieten geteld in totaal 250 cellen. Waarden zijn gemiddelden ± SD van vier onafhankelijke tests uitgevoerd in tweevoud. In vergelijking met CL-stam, een significant lagere invasie van stammen 28, 588 en 1522 (*** P Restaurant < 0,0005), stam 515 (** P Restaurant < 0,001) en stam 1434 (* P
< 0,005) werd gedetecteerd door Student t Electronics Test. b metacyclische vormen, onbehandeld (-) of behandeld (+) met 2 mg /ml pepsine bij pH 3,5, werden geanalyseerd door Western blot met behulp van anti-gp90 mAb 1G7. Als controle pepsine activiteit, wordt BSA gekleurd met Coomassie blauw getoond. c Levende parasieten werden geïncubeerd op ijs gedurende 1 uur, in afwezigheid of in aanwezigheid van mAb 1G7. Na fixatie werden de parasieten geïncubeerd met Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-IgG en het aantal fluorescerende parasieten geschat
Effect van oppervlakte moleculen vrijgegeven door T. cruzi
metacyclische vormen gastheercel invasie
We bepaalden of gp82 en gp90 werden afgestoten in medium gedurende 1 uur incubatie in volledige D10, dat wil zeggen, onder voorwaarde gebruikt in de cel invasie assay. Western blot analyse van het geconditioneerde medium, bereid zoals beschreven in de paragraaf werkwijzen, bleek dat gp90 op het hoogste niveau werd vergoten stam 515 en de laagste niveaus van spanning CL, terwijl gp82 release van stammen 515 en 1434 werd duidelijk gevisualiseerd maar was nauwelijks detecteerbaar CL stam supernatant (fig. 3a). Vervolgens testten we de mogelijkheid dat de invasiecapaciteit van metacyclische vormen werd beïnvloed door gp90 in het medium afgegeven. CL stam metacyclische vormen werden gedurende 1 uur met HeLa-cellen in medium alleen D10 of D10 plus 1% geconditioneerd medium van 515-stam, voorgeïncubeerd indien met anti-gp90 mAb 1G7 of verbonden mAb 2C2. CL-stam werd gebruikt vanwege de hogere cel invasie capaciteit en gebrek aan reactie met mAb 1G7. Zoals getoond in Fig. 3b, geconditioneerd medium aanzienlijk verminderd parasiet invasie, de remmende activiteit was meestal geneutraliseerd door anti-gp90 mAb 1G7, maar niet door niet-verbonden mAb 2C2. Vermoedelijk het gp82 aanwezig in geconditioneerd medium ook bijgedragen aan de waargenomen remmende effect, maar dit was moeilijk aan te tonen omdat anti-gp82 mAb dat levende parasieten niet herkent niet beschikbaar. In HeLa-cellen geïncubeerd in D10 gedurende 30 min met metacyclische vormen van stam 515 of 1434, was er een verspreiding van lysosomen (fig. 3c) die kan voortkomen uit de interactie met gp82 vrijgegeven medium. De recombinante gp82-eiwit is aangetoond dat het lysosoom verstrooiing naar de cel periferie [29], en indien culmineert in exocytose en draagt ​​voor parasitophorous vacuoles vereist voor T. cruzi
invasie [30-32] induceren. Fig. 3 Effect van gp90 vrijgegeven door T. cruzi
metacyclische vormen in gastheercel invasie. Fig. Fig.

• Systematische review en meta-analyse van laparoscopische open gastrectomie voor geavanceerde maag cancer
• Serum CD26 niveaus bij patiënten met maagkanker: een nieuwe potentiële diagnostische marker