Host sejtek invázióját és szóbeli fertőzés Trypanosoma cruzi törzsek genetikai csoportok TCI és TcIV származó chagasic beteg

Host sejtek invázióját és szóbeli fertőzés Trypanosoma cruzi katalógusa törzsek genetikai csoportok TCI és TcIV származó chagasic betegek katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa halmozottan jelentkező akut Chagas betegség orális fertőzés gyakran jelentették az elmúlt tíz évben , és nagyobb gyakorisággal északi Dél-Amerikában, ahol Trypanosoma cruzi katalógusa lineage TCI túlsúlyban, aki felelős a fő oka a feltámadó emberi betegségek, valamint egy kis százalékát azonosították TcIV. Mechanizmusok orális fertőzés és a gazda-sejtek invázióját ezen paraziták által nehezen érthető. Ennek megoldására a kérdésre, elemeztük T. cruzi katalógusa izolált törzsek chagasic betegek Venezuela, Guatemala és Brazília. Katalógusa módszerek katalógusa Trypanosoma cruzi katalógusa metacyclic trypomastigotes orálisan oltottunk be egereknek. Az egér gyomor összegyűjtött négy nappal később, valamint a gyomor és a szív összegyűjtött 30 nappal a fertőzés után, feldolgoztuk a szövettani elemzéshez. Esszék, hogy utánozzák a parazita migráció át a gyomor-nyálkahártya rétegben végeztük számolva a paraziták áthaladni gyomor mucin bevont Transwell szűrőket. A sejtek invázióját vizsgálatokhoz humán epiteliális HeLa sejteket inkubáltunk metacyclic formák száma és az internalizált paraziták megszámláljuk.
Eredmények
Összes TCI és TcIV T. cruzi
törzseket rosszul infektív orális úton. Parazitákat vagy kimutathatatlan vagy mutattunk kis számban az egér gyomor négy nappal a szájon át. Replikálása paraziták találtak a gyomorban és /vagy a szív 30 nappal a fertőzés után. Mint képest TCI Lineage, a migrációs kapacitása TcIV paraziták a gyomor mucin bevont szűrő magasabb volt, de alacsonyabb, mint a kiállított TcVI metacyclic formák korábban kimutatták, hogy rendkívül fertőző orálisan. Expression of pepszin-rezisztens GP90, a felület molekula, amely gátló módon szabályozza sejtek invázióját, magasabb volt a TCI mint TcIV paraziták, és ennek megfelelően az invázió kapacitása TcIV metacyclic formák nagyobb volt. GP90 molekulák spontán felszabaduló TCI metacyclic formák gátolta a parazita lépését gazdasejtekbe. TCI paraziták mutatott alacsony intracelluláris replikációs ráta.
Következtetések katalógusa Eredményeink azt mutatják, hogy a szegény kapacitása TCI törzse, és kisebb mértékben a TcIV élősködők, betörő gyomornyálkahártya szájon át fertőzött egereken társulhat az eredménytelenség a metacyclic formák, különösen a TCI paraziták vándorolnak át a gyomor-nyálkahártya-réteg, hogy támadják cél hámsejtek és megismételni a sejten belül. katalógusa Kulcsszavak katalógusa Trypanosoma cruzi katalógusa TCI és TcIV vonalak metacyclic trypomastigotes Orális fertőzés Host sejt invázió Háttér katalógusa eredményét fertőzés Trypanosoma cruzi katalógusa, az ügynök a Chagas betegség, nagymértékben változhat: 20-30% -a krónikusan fertőzött betegek súlyos, szívizomgyulladás, átalakítás az emésztőrendszer (megaesophagus és /vagy megakolon) ritkábban fordulnak elő, míg a többség továbbra is tünetmentes élet. A genetikai háttér és az immunológiai állapotát, a fogadó, valamint a heterogenitás a parazita populáció hozzájárulhat ez a sokszínűség [1], és esetleg az útvonal a fertőzés és a fertőző dózis. Szerint a fajon belüli nómenklatúra 2009-ben létrehozott, T. cruzi katalógusa törzsek sorolják hat különálló gépelési egység (DTUs) TCI-TcVI [2]. Azokban az országokban, Észak-Dél-Amerika és az Amazonas vidékén, ahol megaesophagus és megakolon ritkák és chagasic kardiomiopátia közhely, TCI az uralkodó ügynöke Chagas betegség, ellentétben TCII, amelyet izoláltak legtöbb beteg brazil központi keleti régió ahol T. cruzi katalógusa fertőzés általában kapcsolódó mega szindrómák [1, 3]. TCI már rámutatott arra, mint a fő oka a feltámadó emberi betegség Dél-Amerika északi, genotipizáló finom léptékű felbontása földrajzi eloszlás, egy nagy panel polimorf mikroszatellit markerek [4]. Az elmúlt években, kitörése akut Chagas betegségek orális fertőzés számoltak venezuelai [5, 6], Kolumbia [7, 8] és a brazil Amazonas [9, 10], ahol TCI elterjedt és egy kis százalékát már azonosított TcIV.
Metacyclic trypomastigotes k érintettek a fenti említett esetekben az orális T. cruzi
fertőzés. Jelenléte alapján a amastigote fészkek belül szakaszain gyomornyálkahártya, de nincs bizonyíték arra, T. cruzi
invázió belül oropharynx vagy a nyelőcső állatok orálisan fertőzzük rovar-eredetű metacyclic formák, az invázió gyomornyálkahártya hám javasolták, hogy különleges fertőzési kapu szisztémás T. cruzi katalógusa fertőzés [11]. Kísérletek TCII és TcVI törzsek chagasic betegek feltárták, hogy a metacyclic szakasz-specifikus felszíni molekulák gp82 és GP90, ami jár, mint promoter és inhibitora célsejt invázió, illetve a [12, 13], döntő fontosságú szerepet játszanak az orális fertőzés [14, 15]. Gp82, amely szelektíven kötődik a gyomor mucin [16] erősen konzerválódott között genetikailag eltérő T. cruzi
sejtvonalak [17], és rezisztens emésztés pepszinnel savas pH, míg a GP90 izoformák differenciális érzékenység peptikus emésztés fejezhető a különböző törzsek úgy, hogy magas vagy alacsony fertőzőképesség orális úton jár a kifejezés a pepszin-fogékony vagy pepszinnel rezisztens GP90 izoform [14, 15]. Hogy egy ilyen sokszínűség GP90 kifejezés és szóbeli fertőzőképesség is megtalálható TCI és TcIV DTUs kell még vizsgálni. Nincs információ a kísérletes orális fertőzés által ezen paraziták, a rendelkezésre álló adatok a kezelt egerek vérében trypomastigotes vagy metacyclic formák által intraperitoneálisan [18], amely egy természetellenes módja a fertőzés. Itt elemeztük metacyclic trypomastigotes TCI és TcIV izolált törzsek chagasic betegek különböző földrajzi régiókban, ami a gp82 és GP90 kifejezés, a képesség, hogy vándorolnak át a gyomor mucin réteg és, hogy megszállják a gyomor nyálkahártya hám orális beadást követően egerekbe. Annak tisztázása a mechanizmusok parazita invázió, in vitro
sejtek invázióját vizsgálatokat végeztünk, humán epiteliális sejtek. Mivel felszíni antigének spontán leválnak szövettenyészet-eredetű trypomastigotes [19] leírták, hogy szerepet játszik a T. cruzi katalógusa fertőzés [20], megvizsgáltuk felszíni molekulák által kiadott metacyclic formák és befolyásolja gazdasejt invázió.
módszerek katalógusa élősködők és a gazdasejt inváziós vizsgálati katalógusa Trypanosoma cruzi katalógusa törzsek Trypanosomatid Culture Collection (TCC), Department Parazitológiai, Universidade de São Paulo, arra szívességéből Dr. Marta MG Teixeira. Ezeket izolálták chagasic betegek a különböző földrajzi régiókban: TCC: 28 (Amazon, Brasil), TCC: 515 (Venezuela), TCC: 588 (Guatemala), TCC: 1522 (Paraíba, Brazília), TCC: 1434 (Amapá, Brasil ). Törzsek 28, 515, 588 és 1522 volt, TCI és a törzs 1434, izolált egyedi fertőzött orális úton, volt TcIV. Kontrollként CL törzs (TcVI) használtunk több kísérletben. Paraziták tartottuk ciklikusan egerekben, és máj infúzió triptóz közegben. Ösztönzése differenciálódás, paraziták növesztettünk egy áthaladás TC100 (Vitrocell, Brazília) vagy Grace tápközeg (Invitrogen) és metacyclic formák tisztítjuk áthaladás DEAE-cellulóz oszlopra leírtak [21]. HeLa-sejtek, a humán karcinóma eredetű epiteliális sejtek, növesztettük 37 ° C-Dulbecco-féle Minimum Essential Medium (DMEM), amelyet 10% magzati borjúszérummal (FCS), sztreptomicint (100 ng /ml) és penicillin (100 U /ml) egy nedvesített, 5% CO 2 atmoszférában. Sejtinvázióra vizsgálatokat végeztünk részletezett máshol [22], beoltva tisztított metacyclic trypomastigotes rá minden egyes lyukába 24-lyukú lemezeken, amelyek 13 mm-es átmérőjű kerek üveg fedőlemezeket bevonva 1,4 × 10 5 HeLa sejtek, vagy DMEM-ben, 10 % FCS (D10), vagy PBS ++ (PBS tartalmú literenként 140 mg kalcium-klorid 2, 400 mg kálium-klorid, 100 mg magnézium-klorid 2.6H 2 O, 100 mg magnézium 4.7H 2 O, 350 mg nátrium-hidrogén 3). 1 óra elteltével inkubálás paraziták, az ismétlődő fedőlemezeket fixáltuk Bouin oldatban, megfestettük Giemsa, és egymás után dehidratált acetonban, egy fokozatos sorozat aceton: xilol (9: 1, 7: 3, 3: 7) és xilol. A több intracelluláris paraziták megszámoltuk, összesen 250 sejt.
Orális fertőzés katalógusa Öt-hat hetes nőstény BALB /c egerek tenyésztik az állat létesítmény Universidade Federal de São Paulo, használták. Eljárások és kísérletek megfelelt a szabályozás az intézményi etikai bizottság az állatkísérletek, és a vizsgálatot a Bizottság által elfogadott (jegyzőkönyv 0234/12). Az egereket fertőztünk T. cruzi
metacyclic formák orális úton (5 × 10 7 paraziták 0,1 ml PBS-ben per állat), 1 ml fecskendő gyomorszondán át a tűt helyezünk az állat szájába. Kimutatására a paraziták a gyomor nyálkahártya epitélium, a gyomor inokulált egerek orálisan metacyclic formák összegyűjtjük 4 nappal a fertőzés után, fix 10% -os semleges formaldehid 24 órán át. A feldolgozás után fokozatos kiszáradás egy fokozatos sorozatában etanolos oldatot, majd a xilol merítés és beágyazás parafin, soros 5 um szöveti metszeteket, és megfestettük hematoxilinnal és eozinnal. Egy másik kísérletsorozatban, metacyclic formákat kaptak orálisan egerekbe (1 × 10 6 paraziták 0,1 ml PBS-ben per állat) és a kiindulási a 10. napon beoltás, parazitémia követtük hetente kétszer megvizsgálva 5 ul vérmintát gyűjtött a farok, a fáziskontraszt mikroszkóp. A 30. napon a fertőzés után, a gyomor, a szív és a máj gyűjtöttük és feldolgoztuk szövettani készítmények, a fent leírtak szerint.
Assay parazita migráció révén gyomor mucin réteg
Polikarbonát Transwell szűrők (3 um pórusokat, 6,5 mm átmérőjű , Costar) vonunk be 50 ul készítmény, amely 10 mg /ml-es gyomor mucin a vízben. Metacyclic formák, szuszpendáljuk 600 ul PBS-ben, adtunk hozzá, hogy az alján 24 lyukú lemezeken (1 × 10 7 paraziták /lyuk), a mucin bevont Transwell szűrőket helyeztük parazita-tartalmú kutak és 100 ul PBS-t adunk a szűrő kamrába. 30 perc eltelte után és /vagy 1 órás inkubálás 37 ° C hőmérsékleten, 10 ul mintát gyűjtöttünk a szűrő kamrát parazita számlálás.
Áramlási citometriával és indirekt immunfluoreszcens assay
Élő metacyclic trypomastigotes (1 × 10 7 ) inkubáltuk jégen 1 órán monoklonális antitesttel 3 F6 vagy 1G7, irányított rendre metacyclic szakasz-specifikus felületi molekula gp82 vagy GP90. Ezután a paraziták fixáltuk 4% para-formaldehid 20 percig. Miután a mosófolyadékokat PBS-ben, a paraziták inkubáltuk Alexa Fluor 488 konjugált anti-IgG 1 órán át szobahőmérsékleten, és a számát fluoreszcens paraziták becsültük BD AccuriTM C6 Áramlási citométer. Ellenőrző paraziták inkubáltuk a szekunder antitesttel csak. Hogy láthatóvá HeLa sejt lizoszómákat, fedőlemezeket a tapadó sejteket inkubáltuk 1 órán át 37 ° C-D10 vagy PBS-ben ++, vagy inkubáltuk paraziták D10 1 órán át. A fixálás után 4% -os p-formaldehid PBS-ben, 30 percig, a sejteket 50 mM NH 4Cl PBS-ben, 30 percig, és PBS-ben mostuk. A sejteket ezután 1 órán át inkubáltuk szobahőmérsékleten egér anti-humán Lamp2 hígított 1: 8 (v /v) tartalmazó PBS oldatban, amely 0,15% zselatin, 0,1% nátrium-azidot és 1% szaponin (PGN-szaponint). Mosások után PBS-ben, a fedőlemezeket 1 órán át inkubáltuk Alexa Fluor 568 konjugált anti-egér IgG-t (Invitrogen), 1: 300 PGN-szaponin, amely 500 ng /ml falloidin-FITC és 10 ng /m DAPI-t (4 ', 6'-1-diamino-2-fenil-dihidroklorid), majd mostuk PBS és utólagos felszerelése fedőlemezeket a ProLong Gold (Invitrogen). Konfokális kép megszerzett Leica TCS SP8 lézer pásztázó mikroszkóp (Leica, Germany) segítségével immerziós Plan-Apochromat SZABÁLYOZHATÓ 63X objektív (numerikus apertúra 1,4). A képsorozat nyert konfokális z-stack feldolgozása és elemzése a Leica LAS AF (Leica, 2012, Németország) és Imaris (Bitplane) szoftver. Katalógusa készítése parazita kondicionált közeg katalógusa Metacyclic formák (10 8) inkubáltunk 37 ° C-on 1 órán 100 ul komplett D10 közepes, tápanyag-megfosztott PBS ++ vagy PBS-ben. Centrifugálás után az üledéket eldobtuk, és a felülúszót (kondicionált tápközeget) összegyűjtjük. Alkalmazás sejtek invázióját vizsgálatokban a kondicionált tápközeget 1: 100 hígításban a D10 vagy PBS ++ és Western blot 10 ul volt töltve.
Előállítása és tisztítása A rekombináns gp82 fehérje katalógusa A rekombináns fehérjét tartalmazó teljes hosszúságú T. cruzi
gp82 szekvencia (GenBank TM adatbázis, hozzáférési szám L14824) keretben glutation-S-transzferáz (GST), t az E. coliban előállított
DH5-α és tisztítottuk részletes máshol. [23] katalógusa Statisztikai analízis katalógusa A Student-féle t katalógusa vizsgálat, mint végrehajtani GraphPad szoftver (Version 6.01) alkalmaztunk. katalógusa Eredmények katalógusa Orális fertőzés egerek T. cruzi
metacyclic formák
az a képesség, TCI paraziták megfertőzni egerek orális úton vizsgáltuk egy sor kísérletet. Negyven egereket elkülönítve 8 csoportban öt állat. Az egyik kísérletsorozatban célzó ellenőrzése az invázió a gyomornyálkahártya által metacyclic trypomastigotes, 4 csoport alkalmaztunk, és minden egyes csoport öt egerek egy másik parazita törzs (5 × 10 7 paraziták per állat). Négy nappal az orális beadás után, a gyomor egerek összegyűjtjük és feldolgozott szövettani készítmények. A magas paraziták számát használtuk ebben az esetben, mivel a korábbi vizsgálatokban TCI törzs G, a vad átviteli ciklus, mi volt találtuk, hogy még a magas inokulum nagyon kevés amastigote fészkek, amelyek megfelelnek intracellulary replikálódó amastigotes voltak kimutatható 4 nap utáni orális fertőzés. Annak ellenére, hogy a nagy oltóanyag nem tudtunk kimutatni amastigote fészkeket mikroszkópos elemzése szövettani metszetekben a gyomorban (1. táblázat). Egy másik kísérletsorozatban végeztük annak meghatározására, hogy van-e különbség a szöveti tropizmus között T. cruzi
törzsek. Ebből a célból, a fennmaradó 4 csoport alkalmaztunk, és minden egyes csoport öt egerek egy másik parazita törzs (1 × 10 6 paraziták per állat), és a fertőzés lefolyását követtük 30 napig. Kezdve a 10. napon, a parazitémia szinteket követjük kétszer egy héten, és a 30. napon a gyomor, a szív és a máj gyűjtöttünk a szövettani elemzéshez. Ebben az esetben az inokulum kisebb volt, mert indokolt, hogy miután több fordulóban a sejtek invázióját és a sejten belüli replikáció, amastigote fészkek lenne kimutatható. Parazitémia nem volt kimutatható az egész megfigyelési időszak, de fertőzést összes csoportban kimutatásával amastigote fészkek a gyomorban és /vagy a szívében egerek (1. táblázat), de nem a májban. Figyelemre az volt, hogy a gyomorban fertőzött egerek törzs 1522, amely származó krónikus chagasic beteg végstádiumú szívelégtelenségben [24], paraziták találtak a szív, de nem a gyomorban, míg a szemközti alkalmazott fertőzés törzs 28 (1. táblázat). Amastigote fészkek voltak jelen nagy számban a gyomorban néhány fertőzött egerek törzs 28, illetve 588 (1. táblázat), feltehetően eredő többfordulós invázió és intracelluláris replikációja a gyomornyálkahártya. Az a tény, hogy a paraziták nem voltak kimutathatók az egér gyomor 4 nap orális adagolás után, de csak egy későbbi időpontban, amikor az intracelluláris replikációs ciklus javasolt vagy nem hatékony migrációját metacyclic űrlapok nyálkarétegben, hatékony invázió cél hámsejtek és /vagy intracelluláris parazita szaporodását. Amellett, hogy a TCI törzsek, megvizsgáltuk egy TcIV törzs, 1434, származó egy orálisan fertőzött betegnek. Amastigote fészkek, kis számban, kimutatható volt a 3 egerek 4. napon a fertőzés után a szövettani metszeteken a gyomor, de a paraziták nem találtak a gyomorban, vagy a szív 30 nappal a fertőzés után (1. táblázat). Parazitémiát negatív volt az egész folyamán 30 nap fertőzés. Pozitív hemoculture megerősített fertőzés minden törzsétől. Hisztológiai készítményei is megvizsgáltak jelenlétére gyulladásos folyamatokat. Függetlenül attól, hogy a parazita törzs, gyulladásos gócokat alig mutatható ki a gyomor napon 4. vagy 30. fertőzés utáni vagy a szívben napon 30.Table 1 Orális fertőzés egerek metacyclic formái T. cruzi katalógusa strainsa
T. cruzi katalógusa törzs katalógusa (származás) Matton Mouse Matton Amastigote fészkeket (több szöveti metszetek) Matton Gyomor (4 nap) hotelben
Gyomor (30. nap) Matton Heart (30. nap) Matton 28 katalógusa (Brazília Amazonas) hotelben 1 katalógusa 0 (20) hotelben 0 (20)
0 (20) hotelben 2

• Szisztematikus áttekintés és meta-analízis a laparoszkópos és nyitott gastrectomián az előrehaladott gyomorrák cancer
• A szérum CD26 szint gyomorrákos betegeknél: a regény lehetséges diagnosztikai marker