Wirtszelle Invasion und orale Infektion durch Trypanosoma cruzi Stämme von genetischen Gruppen TCI und TcIV von chagasic patients

Wirtszellinvasion und orale Infektion durch Trypanosoma cruzi
Stämme von genetischen Gruppen TCI und TcIV von chagasic Patienten
Zusammenfassung
Hintergrund
Ausbrüche von akuten Chagas-Krankheit durch orale Infektion wurden mit einer höheren Inzidenz im nördlichen Südamerika häufig in den letzten zehn Jahren berichtet, wo Trypanosoma cruzi
Linie TCI vorherrscht, verantwortlich für die Hauptursache der wieder auflebenden Krankheit beim Menschen zu sein, und ein kleiner Anteil wird als TcIV identifiziert. Mechanismen der oralen Infektion und Wirt-Zellinvasion durch diese Parasiten sind schlecht verstanden. Um diese Frage zu klären, hat uns T. cruzi
chagasic Patienten in Venezuela, Guatemala und Brasilien isolierten Stämme.
Methoden
Trypanosoma cruzi
metazyklisch trypomastigotes wurden oral geimpft in Mäuse. Die Maus Magen 4 Tage später gesammelt sowie der Magen und Herz gesammelt 30 Tage nach der Infektion, wurden für die histologische Analyse weiterverarbeitet. Assays Parasiten Wanderung durch die Magenschleimschicht zu imitieren wurden durchgeführt, um die Parasiten zu zählen, die Magen-Mucin-beschichteten Transwell-Filter durchlaufen. Für Zellinvasion Assays wurden mit metazyklisch Formen inkubiert humanen epithelialen HeLa-Zellen und die Anzahl der internalisierten Parasiten wurde gezählt.
Ergebnisse
Alle TCI und TcIV T. cruzi
Stämme schlecht über den oralen Weg infektiös waren. Parasites waren entweder nicht nachweisbar oder wurden in kleinen Stückzahlen in der Maus Magen 4 Tage Post oralen Verabreichung nachgewiesen. Replizieren von Parasiten wurden im Magen und /oder im Herzen 30 Tage nach der Infektion gefunden. Im Vergleich zu den TCI-Linie, war die Migration Kapazität von TcIV der Magen-Mucin-beschichteten Filter Parasiten durch höhere, aber niedriger als von TcVI metazyklisch Formen ausgestellt, die zuvor durch den oralen Weg hoch infektiös erwiesen. Die Expression von Pepsin-resistente gp90, das Oberflächenmolekül, das die Zellinvasion downregulates, war höher bei TCI als in TcIV Parasiten und die Invasion Kapazität von TcIV metazyklisch Formen dementsprechend höher war. Gp90-Moleküle spontan frei von tci metazyklisch Formen hemmte die Parasiten den Eintritt in die Wirtszellen. TCI Parasiten niedrigen intrazellulären Replikationsrate aufwiesen. Schlussfolgerungen
Unsere Ergebnisse zeigen, dass die schlechte Leistung von TCI-Linie, und in einem geringeren Ausmaß von TcIV Parasiten, Magenepithels nach oraler Infektion von Mäusen in eindringenden kann mit der Ineffizienz in Verbindung gebracht werden von metazyklisch Formen, insbesondere von tci Parasiten, durch die Magenschleimschicht zu wandern, Ziel Epithelzellen einzudringen und intrazellulär zu replizieren.
Schlüsselwörter Trypanosoma cruzi
TCI und TcIV Abstammungslinien metazyklisch trypomastigotes Oral Infektion Wirtszelle Invasion Hintergrund
das Ergebnis einer Infektion durch Trypanosoma cruzi
, variieren das Mittel der Chagas-Krankheit, kann stark: 20-30% der chronisch infizierten Patienten entwickeln schwere Myokarditis, Veränderungen des Verdauungstrakts (Megaösophagus und /oder Megakolon) treten weniger häufig auf, während die Mehrheit für das Leben asymptomatisch bleibt. Der genetische Hintergrund und der immunologische Status des Hosts sowie die Heterogenität der Parasitenpopulation kann auf diese Vielfalt [1] und möglicherweise den Weg der Infektion und der infektiösen Dosis beitragen. Nach der Nomenklatur innerartliche im Jahr 2009 gegründet, T. cruzi
Stämme in sechs diskrete Typisierung Einheiten definiert sind (DTU), TCI-TcVI [2]. In Ländern, Norden Südamerikas und in der Amazonas-Region, wo Megaösophagus und Megakolon sind selten und chagasic Kardiomyopathie ist alltäglich, ist tci das vorherrschende Mittel der Chagas-Krankheit, im Gegensatz zu TCII, die von den meisten Patienten in der brasilianischen zentralen Ost-Region isoliert wurde wo T. cruzi
Infektion wird in der Regel mit mega Syndromen [1, 3]. TCI wurde als die Hauptursache der wieder auflebenden Krankheit beim Menschen im nördlichen Südamerika, bezogen auf die Genotypisierung für feinskaligen Auflösung der geographischen Verteilung wies darauf hin, eine große Gruppe von polymorphen Mikrosatelliten-Marker mit [4]. In den letzten Jahren haben Ausbrüche von akuten Chagas Erkrankungen durch orale Infektion wurde in Venezuela berichtet [5, 6], Kolumbien [7, 8] und im brasilianischen Amazonas [9, 10], wobei TCI weit verbreitet ist und ein kleiner Prozentsatz hat identifiziert als TcIV.
metazyklisch trypomastigotes sind in den oben genannten Fällen von oralen T. cruzi
Infektion in Verbindung gebracht. Basierend auf dem Vorhandensein von Amastigoten Nester in den Abschnitten der Magenschleimhaut, aber keine Beweise für T. cruzi
invasion innerhalb des Oropharynx oder der Speiseröhre von Tieren oral mit insekten abgeleitet metazyklisch Formen in Frage gestellt wurde die Invasion von Magenschleimhaut Epithel vorgeschlagen werden ein einzigartiges Eintrittspforte für die systemische T. cruzi
Infektion [11]. Experimente mit TCII und TcVI Stämmen aus chagasic Patienten haben gezeigt, dass die metazyklische stufenspezifische Oberflächenmoleküle gp82 und gp90, die als Promotor wirken, und Inhibitor der Zielzellinvasion bzw. [12, 13], die eine entscheidende Rolle bei der oralen Infektion spielen [14, 15]. Gp82, das gastrische Mucin bindet selektiv an [16] zwischen genetisch divergenten T. cruzi
Abstammungslinien hochkonservierten [17] und ist gegen Verdauung beständig von bei saurem pH Pepsin, während gp90-Isoformen mit differentiellen Empfindlichkeit gegenüber Pepsinverdauung ausgedrückt werden kann in verschiedenen Stämmen, so dass hohe oder niedrige Infektiosität durch die orale Route wird mit der Expression von Pepsin-empfindlichen oder Pepsin-resistente Isoform gp90 [14, 15] verbunden. Ob eine solche Vielfalt in gp90-Expression und oral Infektiosität wird auch gefunden in tci und TcIV DTUs noch untersucht werden. Es gibt keine Informationen über experimentelle orale Infektion durch diese Parasiten, beziehen sich die verfügbaren Daten an Mäuse injiziert mit Blut trypomastigotes oder metazyklisch Formen durch die intraperitoneale Route [18] Das ist eine unnatürliche Art der Infektion. Hier haben wir analysiert metazyklisch trypomastigotes von tci und TcIV von chagasic Patienten in verschiedenen geografischen Regionen isolierten Stämme, wie die gp82 und gp90 Ausdruck in Bezug auf die Fähigkeit, durch Magen-Mucin Schicht wandern und Magenschleimhaut Epithel bei oraler Verabreichung an Mäuse einzudringen. Um die Mechanismen der Parasiteninvasion klären, in vitro
Zellinvasion Tests durchgeführt wurden, humanen epithelialen Zellen. Als Oberfläche spontan aus Gewebekultur stamm trypomastigotes Schuppen Antigene [19] eine Rolle bei T. cruzi
Infektion zu spielen gemeldet wurden [20], untersuchten wir, ob Oberflächenmoleküle von metazyklisch Formen freigesetzt wurden und Wirtszelle Invasion beeinflusst.
Methoden
Parasites und Wirtszelle Invasion Assay
Trypanosoma cruzi
Stämme von Trypanosomatida Culture Collection (TCC), Institut für Parasitologie, Universidade de São Paulo, wurden von Dr. Marta MG freundlich zur Verfügung gestellt Teixeira. TCC: 28 (Amazon, Brasilien), TCC: 515 (Venezuela), TCC: 588 (Guatemala), TCC: 1522 (Paraíba, Brasilien), TCC: 1434 (Amapá, Brasilien Sie wurden von chagasic Patienten in verschiedenen geographischen Regionen isoliert ). Stämme 28, 515, 588 und 1522 waren TCi und Stamm 1434, isoliert aus einem Individuum über den oralen Weg infiziert war TcIV. Als Kontrolle CL-Stamm (TcVI) wurde in mehreren Experimenten verwendet. Parasites wurden zyklisch in Mäusen erhalten und in der Leber Infusion Tryptose Medium. Differenzierung zu stimulieren, wurden Parasiten für einen Durchgang in TC100 (VITROCELL, Brasilien) oder Grace-Medium (Invitrogen) und metazyklisch Formen wurden durch Passage durch DEAE-Cellulose-Säule gereinigt gezüchtet, wie beschrieben [21]. HeLa-Zellen, die menschlichen Karzinoms abgeleiteten Epithelzellen, wurden bei 37 ° C in Dulbecco Minimum Essential Medium (DMEM), das mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), Streptomycin (100 ug /ml) und Penicillin (100 U ergänzt war /ml) in einem befeuchteten 5% CO 2 -Atmosphäre. Zellinvasion Assays wurden wie anderswo detailliert ausgeführt [22], durch gereinigtes metazyklisch trypomastigotes auf jede Vertiefung von Platten mit 24 Vertiefungen Animpfen 13 mm Durchmesser Runddeckgläser mit 1,4 × 10 5 HeLa-Zellen beschichtet, die entweder in DMEM mit 10 % FCS (D10) oder in PBS ++ (PBS, enthaltend pro Liter: 140 mg CaCl 2, 400 mg KCl, 100 mg MgCl 2.6h 2 O, 100 mg MgSO 4.7H 2 O, 350 mg NaHCO 3). Nach 1 h Inkubation mit Parasiten wurden die doppelte Deckgläser in Bouin-Lösung fixiert, mit Giemsa gefärbt, und sequentiell dehydriert in Aceton, eine abgestufte Reihe von Aceton: Xylol (9: 1, 7: 3, 3: 7) und xylol. Die Zahl der intrazelluläre Parasiten wurde in insgesamt 250 Zellen gezählt.
Oral Infektion
Fünf bis sechs Wochen alte weibliche Balb /c-Mäuse, gezüchtet in der Tierhaltung an der Universidade Federal de São Paulo, verwendet wurden. Alle Verfahren und Experimente entsprach mit der Regulierung des institutionellen Ethikkommission für Tierversuche und die Studie des Ausschusses (Protokoll Nr 0234/12) genehmigt wurde. Mäuse wurden mit T. cruzi infizierten
metazyklisch Formen auf oralem Weg (5 × 10 7 Parasiten in 0,1 ml PBS pro Tier), unter Verwendung von 1 ml-Spritze mit Nadel, die eine Sonde in das Maul eingeführt wurde. Zum Nachweis von Parasiten in der Magenschleimhaut Epithel, den Magen von Mäusen, die oral mit metazyklisch Formen inokuliert wurden 4 Tage nach der Infektion gesammelt, mit 10% neutralem Formaldehyd fixiert, für 24 h. Nach der Verarbeitung durch allmähliche Dehydratisierung in einer abgestuften Reihe von Ethanol-Lösung durch Eintauchen, gefolgt Xylol und in Parafin, Serien 5 um Gewebeschnitte wurden geschnitten und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin einzubetten. In einer anderen Reihe von Experimenten wurden metazyklisch Formen oral an Mäuse gegeben (1 × 10 6 Parasiten in 0,1 ml PBS pro Tier) und beginnend am Tag 10 nach der Inokulation wurde Parasitämie zweimal wöchentlich überwacht durch Untersuchen 5 &mgr; l Blutproben an der Phasenkontrastmikroskop aus dem Schwanz, gesammelt. Am 30. Tag nach der Infektion, der Magen, Herz und Leber wurden für histologische Präparate gesammelt und verarbeitet werden, wie oben beschrieben.
Assay von Parasiten Migration durch Magen Muzinschicht
Polycarbonat Transwell-Filtern (3 &mgr; m Poren, 6,5 mm Durchmesser , Costar) wurden mit 50 ul einer Zubereitung beschichtet 10 mg /ml Magen Mucin in Wasser enthält. Metazyklisch Formen, suspendiert in 600 ul PBS, wurden auf den Boden von 24-Well-Platten gegeben (1 × 10 7 Parasiten /well), die Mucin beschichtete Transwell-Filter wurden Parasiten enthaltenden Vertiefungen und 100 &mgr; l plaziert auf PBS wurden zu der Filterkammer hinzugefügt. Nach 30 min und /oder 1 h Inkubation bei 37 ° C, 10 ul-Proben aus der Filterkammer für Parasiten Zählen wurden gesammelt.
Durchflußzytometrie und indirekter Immunfluoreszenz-Assays
Live metazyklisch trypomastigotes (1 × 10 7 ) wurden für 1 h mit dem monoklonalen Antikörper 1G7 oder 3 F6, jeweils metazyklisch Stufe spezifischen Oberfläche gerichtet auf Eis inkubiert Molekül gp82 oder gp90. Danach wurden die Parasiten für 20 min mit 4% para-Formaldehyd fixiert. Folgende Waschungen in PBS wurden die Parasiten mit Alexa Fluor 488-konjugiertes anti-IgG für 1 h bei Raumtemperatur und die Anzahl der fluoreszierenden Parasiten inkubiert wurde mit einem BD AccuriTM C6 Durchflusszytometer geschätzt. Steuer Parasiten wurden nur mit dem sekundären Antikörper inkubiert. Zur Visualisierung Lysosomen HeLa Zelle, Deckgläser mit adhärenten Zellen für 1 h bei 37 ° C in D10 oder in PBS inkubiert wurden ++ oder wurden mit Parasiten in D10 für 1 h inkubiert. Nach der Fixierung mit 4% p-Formaldehyd in PBS für 30 min wurden die Zellen mit 50 mM NH 4Cl in PBS für 30 min gewaschen und in PBS behandelt. Die Zellen wurden dann für 1 h bei Raumtemperatur mit anti-human LAMP2 Maus verdünnt inkubiert 1: 8 (v /v) in einer PBS-Lösung, enthaltend 0,15% Gelatine, 0,1% Natriumazid und 1% Saponin (PGN-Saponin). Nach dem Waschen in PBS wurden die Deckgläser inkubiert für 1 h mit Alexa Fluor 568-konjugiertem anti-Maus-IgG (Invitrogen), 1: 300 verdünnt in PGN-Saponin 500 enthält ng /ml Phalloidin-FITC und 10 &mgr; g /m DAPI (4 ', 6'-1-diamino-2-Phenylindol-dihydrochlorid), durch Waschen in PBS und anschließende Montage der Deckgläser in ProLong Gold (Invitrogen) gefolgt. Die konfokale Bilder wurden in einem Leica TCS SP8 Laser-Scanning-Mikroskop (Leica, Deutschland) mit einem Ölkapselung Plan-Apochromat 63X Objektiv (numerische Apertur 1,4) erworben. Die Serie von Bildern aus konfokalen z-Stacks erhalten wurden verarbeitet und analysiert unter Verwendung von Leica LAS AF (Leica, 2012, Deutschland) und Imaris (Bitplane) Software.
Herstellung von Parasiten konditionierte Medium
metazyklisch Formen (10 8) wurden für 1 h in 100 &mgr; l vollständiges Medium D10, nährstoff entzogen PBS ++ oder PBS bei 37 ° C inkubiert. Nach der Zentrifugation wurde das Pellet verworfen und der Überstand (konditioniertes Medium) wurde gesammelt. 100 in D10 oder PBS ++ und geladen für Western-Blot-10 &mgr; l
Produktion und Aufreinigung von rekombinanten gp82-Protein
das rekombinante Protein enthält, das: Für den Einsatz in der Zellinvasionsassays das konditionierte Medium 1 verdünnt wurde. in voller Länge T. cruzi
gp82-Sequenz (GenBank TM Datenbank, Zugangsnummer L14824) im Rahmen mit Gluthation-S-Transferase (GST), wurde in E. coli
DH5-α und gereinigt erzeugt als detaillierte anderswo [23].
Statistische Analyse
Die t
Tests von Student, wie implementiert in GraphPad-Software (Version 6.01) verwendet wurde.
Ergebnisse | Oral-Infektion von Mäusen mit T. cruzi
metazyklisch Formen
die Fähigkeit von tci Parasiten Mäuse auf oralem Weg zu infizieren wurde in einer Reihe von Experimenten untersucht. Vierzig Mäuse wurden in 8 Gruppen von fünf Tieren getrennt. In einer Reihe von Experimenten, mit denen die Invasion des Magen-Epithel von metazyklisch trypomastigotes Überprüfung wurden 4 Gruppen verwendet und jede Gruppe von fünf Mäuse erhielten eine andere Parasitenstamm (5 x 10 7 Parasiten pro Tier). Vier Tage nach der oralen Verabreichung der Magen der Mäuse wurde für die histologische Präparationen erhoben und verarbeitet. Eine hohe Anzahl von Parasiten in diesem Fall verwendet wurde, weil in früheren Studien mit TCI-Stamm G, von der Wildübertragungszyklus, hatten wir, dass auch bei einem hohen Inokulum sehr wenige amastigote Nester, die Replikation von Amastigoten zu intrazellulär entsprechen gefunden hatten, konnten bei 4 Tag nach der oralen Infektion. Trotz der großen Inokulum konnten wir amastigote Nester durch mikroskopische Analyse von histologischen Schnitten des Magens (Tabelle 1) nicht erkennen. Eine weitere Reihe von Experimenten wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob ein Unterschied in Gewebstropismus zwischen T. cruzi
Stämme dort war. Zu diesem Zweck wurden die restlichen vier Gruppen verwendet wird und jede Gruppe von fünf Mäusen eine andere Parasitenstamm erhalten (1 × 10 6 Parasiten pro Tier) und der Verlauf der Infektion wurde 30 Tage verfolgt. Beginnend am Tag 10 wurden die Parasitämie Ebenen zweimal wöchentlich überwacht und am Tag 30 der Magen, Herz und Leber wurden für histologische Analysen gesammelt. In diesem Fall war das Inokulum kleiner, weil wir begründet, dass nach mehreren Runden der Zellinvasion und die intrazelluläre Replikation amastigote Nester nachweisbar wäre. Parasitämie nicht nachweisbar war während des gesamten Beobachtungszeitraum, aber Infektion wurde in allen Gruppen durch Nachweis von Amastigoten Nester in den Magen und /oder im Herz von Mäusen (Tabelle 1), nicht aber in der Leber bestätigt. Bemerkenswert war, dass durch den Stamm in den Magen von Mäusen mit Stamm 1522 infiziert, die an einer chronischen chagasic Patienten stammt im Endstadium Herzinsuffizienz [24], Parasiten im Herzen gefunden wurden, aber nicht im Magen, während die gegenüber Infektion angewendet 28 (Tabelle 1). Amastigoten Nester waren bei hohen Stückzahlen im Magen von einigen mit dem Stamm infizierten Mäusen 28 oder 588 (Tabelle 1), vermutlich aus mehreren Runden der Invasion und intrazelluläre Replikation im Magenepithel führt. Die Tatsache, dass Parasiten wurden in der Maus Magen bei 4 Tage nach der oralen Verabreichung nicht nachgewiesen, sondern erst zu einem späteren Zeitpunkt, nach intrazellulärer Replikationszyklen, vorgeschlagen entweder eine ineffiziente Migration von metazyklisch Formen durch die Schleimschicht, ineffizienten Invasion von Ziel Epithelzellen und /oder intrazelluläre Parasiten Multiplikation. Neben TCI-Stämmen untersuchten wir eine TcIV Stamm, 1434, von einem oral infizierten Patienten abgeleitet. Amastigoten Nester, in kleinen Stückzahlen wurden in 3 Mäusen am 4. Tag nach der Infektion in den histologischen Schnitten des Magens erkannt, aber Parasiten wurden nicht im Magen oder im Herzen 30 Tage nach der Infektion (Tabelle 1). Parasitämie war negativ im Verlauf der 30 Tage-Infektion. Positive hemoculture bestätigte Infektion durch alle Stämme. Histologische Präparationen wurden auch auf die Anwesenheit von Entzündungsprozessen untersucht. Unabhängig von der Parasitenstamm waren Entzündungsherde kaum nachweisbar in den Magen am Tag 4 oder 30 nach Infektion oder im Herzen am Tag 30.Table 1 Orale Infektion von Mäusen mit metazyklisch Formen von T. cruzi
strainsa
T. cruzi
Stamm
(Ursprung)
Maus
amastigote Nester (Anzahl der Gewebeschnitte)
Magen (Tag 4)

Magen (Tag 30)
Herz (Tag 30)
28
(Brasilien Amazon)
1 0 (20)
0 (20)
0 (20)
2 0 (20)
60 (20)
0 (21)
3
0 (20)
285 (20)
0 (20)
4 0 (20)
11 (18)
0 (23)
5
0 (20)
NDb
0 (20)
515
(Venezuela)
1 0 (21)
0 (24)
0 (20)
2 0 (19)
0 (13)
0 (25)
3
0 (20)
0 (21)
0 (23)
4 0 (20)
45 (11)
0 (21)
5
0 (20)
5 (21)
0 (24)
588
(Guatemala)
1 | 0 (09)
31 (19)
10 (21)
2 0 (12)
17 (18)
0 (20)
3
0 (09)
6 (20)
3 (15)
4 0 (12)
87 (19)
0 (19)
5
0 (16)
990 (20)
0 (16)
1522
(Brasilien Nordosten)
1 0 (16)
0 (17)
0 (20)
2 0 (19)
0 (15)
4 (20)
3
0 (20)
0 (17)
0 (20)
4 0 (21)
0 (20)
6 (20)
5
0 (21)
0 (16)
4 (18)
1434
(Brasilien Amazon) seite 1 von 5 (40)
0 (18)
0 (20)
2
3 (40)
0 (24)
0 (20)
3
0 (36)
0 (20)
0 (20)
4
0 (35)
0 (20)
0 (21)
5
5 (40)
0 (20)
0 (21)
aMetacyclic Formen der angegebenen Parasitenstämme wurden oral an Mäuse gegeben. In einem Experiment erhielten die Mäuse 5 x 107 Parasiten und 4 Tage später wurde der Magen für histologische Präparate gesammelt. In einem anderen Experiment erhielten die Mäuse 1 x 106 Parasiten und 30 Tage später wurden der Magen und das Herz für histologische Präparate gesammelt
b ND | Migration von T. cruzi
metazyklisch Formen durch die nicht bestimmt
Magen Muzinschicht
Ein Test der Parasit Translokation durch die Schleimschicht im Magen zu imitieren wurde mit Transwell-Filter beschichtet mit Magen-Mucin durchgeführt, die die Hauptkomponente des hochmolekularen Schleim ist. Frühere Studien hatten gezeigt, dass TcVI metazyklisch Formen, die effizient Magenepithels eindringen, wenn sie oral an Mäuse verabreicht, die Magen-Mucin-beschichteten Transwell-Filter so effektiv wie das leere Filter durchlaufen und diese Eigenschaft wird mit dem Ausdruck von Pepsin-resistenten G82-Molekül verbunden, die selektiv bindet an Magen-Mucin [16, 25]. Gastric Mucin-beschichteten Transwell-Filter wurden auf der Oberseite Brunnen metazyklisch Formen, die platziert. Nach 30 und 60 min Inkubation bei 37 ° C wurde die Anzahl der Parasiten, die die obere Kammer erreicht gezählt. TCI Parasiten reduzierte Kapazität angezeigt durch die Magen-Mucin Schicht wandern, im Vergleich zu Stamm CL (TcVI), die als Kontrolle diente (Abb. 1a), was bestätigt, dass Magen-Mucin als Barriere für die Migration handelte. Metazyklisch Formen der TcIV Stamm 1434 durchlaufen die Magen-Mucin-beschichteten Filter effizienter als TCI Parasiten, aber immer noch zu niedrigeren Preisen als CL-Stamm (Abb. 1a). Wir untersuchten die Expression von gp82 und seine Beständigkeit gegen Pepsin in tci und TcIV Stämmen. Metazyklisch Formen wurden für 1 h mit 2 mg /ml Pepsin in Citrat-Lösung bei pH 3,5, eine Bedingung behandelt, die extensiv abgebaut BSA (Fig. 1b) und die Reinigungsmittel lösliche Extrakte wurden durch Western-Blot, zusammen mit unbehandelten Parasiten analysiert, monoklonalen Verwendung Antikörper (mAb) 3 F6 zu gp82 gerichtet. Vor der Reaktion mit mAb 3 F6, die gleichmäßige Beladung der Parasit Proben wurde geprüft von Ponceau-S-Färbung (Weitere Datei 1: Abbildung S1A). Expression von gp82, die nach der Pepsinbehandlung intakt erhalten wurde, war in allen Stämmen, anscheinend bei etwas höheren Ebenen in Stamm 1434 als in TCI-Stämmen (Fig. 1b). Da dies könnte die höhere Migrationskapazität von Stamm 1434 erklären, verglichen wir die gp82 Expression dieses Stammes, die der CL-Stamm, der die Magen-Mucin-beschichteten Filter effizient durchlaufen (Abb. 1a). Gp82 Ausdruck vergleichbar war im Jahre 1434 und CL-Stämme (Weitere Datei 1: Abbildung S1B oberes Feld). Die Anwesenheit von gp82-Molekülen auf der Parasitenoberfläche wurde durch Durchflusszytometrie-Analyse (Fig. 1c) bestätigt. Um zu prüfen, ob Stamm 1434 ausgedrückt höher gp82 Niveau als TCI-Stämme wurde die Western-Blot-Analyse wiederholt durch den Stamm 515 als Vertreter der TCI-Linie verwendet wird. MT Proben der beiden Stämme, am gleichen Tag hergestellt und in der gleichen SDS-PAGE-Gel elektrophoresiert, zeigten ähnliche Profil (Zusatzdatei 1: Figure S1C). Aus all diesen Daten und zusätzliche FACS-Analyse der beiden Stämme, etwas höher gp82 Spiegel im Stamm zeigen 1434 (zusätzliche Datei 1: Abbildung S1D), ist es nicht möglich, dass die relative Effizienz der Stamm 1434 metazyklisch Formen zu schließen, durch den Magen bei der Migration Mucin Schicht auf die differentielle Expression von gp82 zurückzuführen. Als T. cruzi
spontan ist bekannt, dass Oberflächenmoleküle freizusetzen [19, 20, 26], Parasiten-Schuppen-Moleküle auch verantwortlich für die beobachteten Effekte sein könnte. Wir überprüft, ob gp82 in Medium während 1 h Inkubation in PBS, Zustand im Magen-Mucin Migration Assay verwendet vergossen wurde. Western-Blot-Analyse des Überstandes nach Parasitenentfernung, erhalten, wie in dem Abschnitt Verfahren beschrieben, ergab, dass die Stämme 515 und 1434 vergießen erhebliche Mengen an gp82, im Gegensatz zu den CL-Stamm, der gp82 bei kaum nachweisbare Mengen freigesetzt, während gp90 auf einem hohen Niveau vergossen wurde durch den Stamm 515 und in sehr geringen Mengen durch die Stämme 1434 und CL (Fig. 1d). Wenn die Moleküle differentiell durch Stämme 515 freigegeben, 1434 und CL in der Tat mit dem Parasiten Wanderung durch die Magen-Muzin Mantel stören, das würde die hohen und niedrigen Wirkungsgrade von Stämmen CL erklären und 515 jeweils sowie die Zwischen Fähigkeit durch den Stamm ausgestellt 1434 (Fig. 1a). Ein Experiment, um den Einfluss des frei gp90 auf Stamm 515 Migration zu demonstrieren, indem Magen-Mucin-beschichteten Transwell-Filter auf der Vertiefungen, die metazyklisch Formen allein oder gemischt mit Anti-gp90-mAb 5E7 wurde durchgeführt, die nicht mit nicht verwandten lebenden Parasiten oder gemischt erkennt mAb 2C2 an T. cruzi
amastigote Molekül gerichtet [27]. Nach 30 und 60 min Inkubation wurden Proben aus der Filterkammer wurden Parasiten Zählen entnommen. Parasites gemischt mit anti-gp90-mAb 5E7, aber nicht diejenigen, mit nicht verwandten mAb gemischt 2C2, durchquert die Magen-Mucin Mantel bei höheren Zahlen als Steuer Parasiten (Abb. 1e), dass gp90 mit Parasiten Migration durch unbekannten Mechanismus stört Schuppen angibt, ist nicht mit Bindung, sofern magen Mucin gp90 bindet nicht [28]. Störungen durch gp82, die nicht nachgewiesen werden konnte, weil anti-gp82-mAb 3 F6 bindet Parasiten zu leben, wäre verständlich, weil es zu Magen-Mucin bindet. Wir untersuchten auch, ob gp90 und gp82 wurden in neutralem und saurem pH-Wert unterschiedlich gelöst. Konditioniertes Medium aus metazyklisch Formen der Stamm 515 in PBS inkubiert erhalten, pH 7,2, oder in Citratpuffer, pH 3,5, wurde durch Western-Blot analysiert. Veröffentlichung gp82 war ähnlich bei beiden pH-Wert, während gp90 Abwurf niedriger war bei saurem pH-Wert (Weitere Datei 1: Abbildung S1B unteres Bild). Feige. 1 Migration von gp82-exprimierenden T. cruzi
metazyklisch Formen durch die Magen Muzinschicht. ein Transwell-Filter mit Magen-Mucin beschichtet wurden auf Vertiefungen, die die angegebenen Parasitenstämme gelegt. Proben wurden aus der Filterkammer bei 30 min und 60 min für Parasiten Zählung gesammelt. Werte sind die Mittelwerte ± SD von drei unabhängigen Experimenten. Im Vergleich zu den CL-Stamm, eine signifikant geringere Migration von TCI-Stämme (** P
< 0,0005) und TcIV Stamm 1434 (* P
< 0,005) wurde bei 60 min beobachtet. b metazyklisch Formen, unbehandelt (-) oder behandelt (+) mit 2 mg /ml Pepsin bei pH 3,5, wurden durch Western Blot analysiert unter Verwendung von mAb F6 3 bis gp82 gerichtet sind. Als Kontrolle von Pepsin Aktivität, BSA gefärbt durch Coomassie blau dargestellt. c lebenden Parasiten wurden für 1 h auf Eis inkubiert, in Abwesenheit oder in Gegenwart von mAb 3 F6. Nach der Fixierung wurden die Parasiten mit Alexa Fluor 488-konjugiertes anti-IgG und die Anzahl der fluoreszierenden Parasiten geschätzt wurde, inkubiert. d Parasiten wurden für 1 h in PBS inkubiert. Nach Zentrifugation Parasiten zu entfernen, wurde das konditionierte PBS durch Western-Blotting unter Verwendung von mAb F6 3 und mAb 5E7 analysiert, die jeweils mit gp82 und gp90 gerichtet sind. e Transwell-Filter mit Magen Mucin beschichtet wurden auf Vertiefungen gegeben, die metazyklische Formen der Stamm 515 allein oder in Gegenwart von anti-gp90 mAb 5E7, der nicht lebenden Parasiten oder nicht verwandten mAb 2C2 nicht erkennt. Nach 30 und 60 min Inkubation wurden Proben aus der Filterkammer wurden Parasiten Zählen entnommen. Werte sind das Mittel ± Variation von Duplikaten
Wirtszellinvasion von T. cruzi
metazyklisch Formen
Kapazität von metazyklisch Formen Reduziertes in Magenepithel bei oraler Verabreichung in Mäuse eindringenden wurde mit der Expression von Pepsin beständigen gp90 assoziiert auf einem hohen Niveau, und korreliert mit einer schlechten Infektiosität gegenüber kultivierten humanen Epithelzellen [14, 15]. Wir untersuchten die Fähigkeit von tci und TcIV metazyklisch Formen Wirtszellen ein. Parasiten wurden mit HeLa-Zellen für 1 h in voller Nährstoff DMEM und die Anzahl der intrazellulären Parasiten inkubiert wurde gezählt. Niedrige Invasion Kapazität war ein gemeinsames Merkmal aller Stämme, TcIV Stamm 1434 Stamm aufweisen, eine höhere Effizienz als TCI-Stämme (Abb. 2a). Western-Blot-Analyse, monoklonaler Antikörper gegen gp90 gerichtet verwenden, ergab, dass alle Parasiten Pepsin beständige gp90 (Fig. 2b) ausgedrückt. Die Anwesenheit von gp90 auf Parasiten Oberfläche mittels Durchflusszytometrie-Analyse in den Stämmen 515 und 1434. In wiederholten Tests unter Verwendung von verschiedenen Parasitenproben geprüft wurde, gp90 wurde bei wesentlich geringeren Mengen in Stamm 1434 (.: Abbildung S1E 2c, zusätzliche Datei 1). Wir erwarten eine höhere Zellinvasionskapazität von Stamm 1434, weil das beobachtete Profil gp90 zu der metazyklisch Formen CL Stamm ähnlich ist (zusätzliche Datei 1: Abbildung S1B oberes Feld), das durch nicht erkannt werden anti-gp90 monoklonale Antikörper (mAbs), gp90 wird durch Western-Blot in Detergenzextrakt nachweisbar. Feige. 2 Wirtszelle Invasion von gp90-exprimierenden T. cruzi
metazyklisch Formen. ein HeLa-Zellen wurden für 1 h mit den angegebenen Parasitenstämme in voller Nährstoff DMEM inkubiert. Nach der Fixierung und Giemsa-Färbung wurde die Anzahl der intrazellulären Parasiten in insgesamt 250 Zellen gezählt. Werte sind die Mittelwerte ± SD von vier unabhängigen Assays in Doppelbestimmung durchgeführt. Im Vergleich zu den CL-Stamm, eine signifikant niedrigere Invasion der Stämme 28, 588 und 1522 (*** P
< 0,0005), Stamm 515 (** P
< 0,001) und Stamm 1434 (* P
< 0,005) wurde von Student t
Test nachgewiesen. b metazyklisch Formen, unbehandelt (-) unter Verwendung von anti-gp90 mAb 1G7 oder behandelt (+) mit 2 mg /ml Pepsin bei pH 3,5, wurden durch Western-Blot analysiert. Als Kontrolle von Pepsin Aktivität, BSA gefärbt durch Coomassie blau dargestellt. c lebenden Parasiten wurden für 1 h auf Eis inkubiert, in Abwesenheit oder in Gegenwart von mAb 1G7. Nach der Fixierung wurden die Parasiten mit Alexa Fluor 488-konjugiertes anti-IgG und die Anzahl der fluoreszierenden Parasiten inkubiert wurde geschätzt
Wirkung der Oberflächenmoleküle durch T. cruzi
metazyklisch Formen in Wirtszellinvasion freigegeben
Wir bestimmten ob gp82 und gp90 wurden in der Zellinvasion Test während 1 h Inkubation bei völliger D10, das heißt, verwendet unter der Bedingung in das Medium zu vergießen. Western-Blot-Analyse des konditionierten Mediums, wie in dem Abschnitt Verfahren beschrieben, ergab, dass gp90 auf den höchsten Ebenen durch den Stamm 515 und auf der niedrigsten Ebene durch den Stamm CL vergossen wurde, während gp82 Freisetzung durch Stämme 515 und 1434 wurde deutlich sichtbar, aber war kaum nachweisbar in CL-Stamm Überstand (Abb. 3a). Als nächstes testeten wir die Möglichkeit, dass die invasive Kapazität metazyklisch Formen von gp90 freigesetzt in das Medium beeinflusst. CL-Stamm metazyklisch Formen wurden für 1 h mit HeLa-Zellen in D10-Medium allein oder in D10 plus 1% konditioniertes Medium von 515-Stamm inkubiert, vorinkubiert oder nicht mit anti-gp90 mAb 1G7 oder mit nicht verwandten mAb 2C2. CL-Stamm wurde wegen seiner höheren Zellinvasionskapazität und fehlende Reaktion mit mAb 1G7 verwendete. Wie in gezeigt. 3b, konditionierte Medium deutlich reduziert Parasit Invasion, seine hemmende Aktivität wurde vor allem durch anti-gp90-mAb 1G7 neutralisiert, aber nicht von den unabhängigen mAb 2C2. Vermutlich trug das gp82 vorhanden in konditioniertem Medium auch für die beobachtete inhibitorische Wirkung, aber dies war schwierig zu demonstrieren, da anti-gp82-mAb, der nicht lebenden Parasiten erkennt nicht verfügbar ist. In HeLa D10 in inkubierten Zellen für 30 min mit metazyklisch Formen Stamm 515 oder 1434, gab es einige Lysosomen Spreiz (Fig. 3c), die von der Interaktion mit gp82 an Medium abgegeben führen kann. Das rekombinante gp82-Protein hat sich gezeigt, Lysosom zu induzieren, um die Zellperipherie Streuung [29], und Ereignis, das in Exozytose gipfelt und trägt zur parasitophoren Vakuolenbildung für T. cruzi erforderlich
Invasion [30-32]. Feige. 3 Wirkung von gp90 von T. cruzi
metazyklisch Formen in Wirtszelle Invasion freigegeben. Feige. Wie in gezeigt. Feige.

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