Hostiteľská bunka invázie a ústnej infekcii Trypanosoma cruzi kmeňov genetických skupín TCI a TcIV z chagasic patients

hostiteľskej bunke invázie a ústne infekcie Trypanosoma cruzi
kmeňov genetických skupín TCI a TcIV z chagasic pacientov
abstraktné
pozadia
ohniská akútne Chagas choroby orálny infekcie boli hlásené častejšie v priebehu posledných desiatich rokov, s vyšším výskytom v severnej časti Južnej Ameriky, kde Trypanosoma cruzi
línie TCI prevláda, je zodpovedný za hlavnú príčinu ožívající ľudských chorôb, a malé percento je identifikovaný ako TcIV. Mechanizmy orálny infekcie a hostiteľskej bunky invázie týchto parazitov sú zle pochopené. Na vyriešenie tejto otázky sme analyzovali T. cruzi
kmeňov izolovaných od pacientov chagasic vo Venezuele, Guatemale a Brazílii.
Metódy
Trypanosoma cruzi
metacyclic trypomastigotes sa orálne zaočkované do myší. Žalúdok myšou zhromaždené o štyri dni neskôr, rovnako ako žalúdok a srdce zhromaždené 30 dní po infekcii, boli spracované na histologické vyšetrenie. Testy pre napodobenie migrácie parazita žalúdočné vrstvy slizu bola vykonávaná počítaním parazitov, ktoré prejsť žalúdočného hlienu povlakom Transwell filtre. Pre invázie buniek testoch, ľudský epiteliálne Hela bunky boli inkubované s metacyclic foriem a bol počítaný počet internalizovaných parazitov.
Výsledky
Všetky TCI a TcIV T. cruzi
kmene boli zle infekčné orálnou cestou. Parazity boli buď nezistiteľné, alebo v malom množstve v žalúdku myší boli zistené štyri dni po perorálnom podaní. Replikujúce paraziti boli nájdené v žalúdku a /alebo v centre 30 dní po infekcii. V porovnaní s TCI línie, migrácia kapacita TcIV parazity cez žalúdočného hlienu potiahnutý filter bol vyšší, ale nižší ako prejavovaná TcVI metacyclic foriem skôr preukázané, že sú vysoko infekčné orálnou cestou. Expresia pepsínu odolné proti gp90, povrchové molekuly, ktorá downreguluje invázia buniek, bola vyššia v TCI ako v TcIV parazitov, a podľa toho, invázia kapacita TcIV metacyclic foriem bola vyššia. Gp90 molekuly spontánne uvoľnené TCI metacyclic formami inhibuje vstup parazita do hostiteľských buniek. TCI paraziti vykazujú relatívne nízku rýchlosť vnútrobunkové replikácie.
Závery
Naše výsledky ukazujú, že nízke schopnosti TCI línie, a v menšej miere TcIV parazitov, napádajúci žalúdočné epitel po perorálnej infekcii myší, môžu byť spojené s neúčinnosťou z metacyclic foriem, najmä TCI parazitov, migrujú do žalúdočnej sliznice vrstvy, na inváziu do cieľovej epiteliálne bunky a replikovať intracelulárne.
Kľúčové
Trypanosoma cruzi
TCI a TcIV línie Metacyclic trypomastigotes ústnej infekcie hostiteľskej bunky invázie pozadí
výsledok infekcie Trypanosoma cruzi
agent Chagas choroby, môžu značne líšiť: 20-30% chronicky infikovaných pacientov rozvinúť ťažká myokarditída, zmeny tráviaceho traktu (megaesophagus a /alebo megakólon) vyskytujú menej často, zatiaľ čo väčšina zostáva bez príznakov po celý život. Genetický základ a imunologický stav hostiteľa, ako aj rôznorodosť parazita populácie môže prispieť k tejto rozmanitosti [1] a možno aj spôsob infekcie a infekčné dávke. Podľa vnútrodruhovej nomenklatúry vytvorenej v roku 2009, T. cruzi
kmene sú rozdelené do šiestich samostatných písania jednotiek (DTUs), TCI-TcVI [2]. V krajinách, North Južnej Ameriky a v oblasti Amazónie, kde megaesophagus a megakolón sú zriedkavé a chagasic kardiomyopatie je samozrejmosťou, TCI je hlavným činiteľom Chagasova choroba, na rozdiel od TcII, ktorý bol izolovaný z väčšiny pacientov v brazílskom strednej východnej oblasti kde T. cruzi
infekcie je zvyčajne spojená s mega syndrómov [1, 3]. TCI už bolo uvedené ako hlavnú príčinu ožívající ľudskej choroby v severnej časti Južnej Ameriky, na základe genotypu pre rozlíšenie v poriadku meradle geografické rozloženie, použitie veľkého panela polymorfných mikrosatelitních markerov [4]. V posledných rokoch ohniska akútnych ochoreniach Chagas podľa orálny infekcie boli hlásené vo Venezuele [5, 6], Kolumbia [7, 8] a v brazílskej Amazónii [9, 10], kde za pomoci TCI prevládajúce a malé percento bolo identifikované ako TcIV.
Metacyclic trypomastigotes sa podieľajú na vyššie uvedené prípady ústneho T. cruzi
infekcie. na prítomnosti amastigote hniezd v úsekoch žalúdočnej sliznice, ale žiadny dôkaz pre T. cruzi
invázii v ústnej časti hltana a pažeráka zvierat napadnutých orálne metacyclic formy hmyzu odvodené, invázia do žalúdočnej sliznice epitelu bolo navrhnuté, aby sa jedinečný portál vstupu pre systémovú T. cruzi
infekcie [11]. Experimenty s TcII a TcVI kmeňov z chagasic pacientov ukázali, že metacyclic fáza špecifické povrchové molekuly gp82 a gp90, ktoré pôsobia ako promótor a inhibítor invázie buniek cieľového, respektíve [12, 13], zohráva kľúčovú úlohu v ústnej infekcie [14, 15]. Gp82, ktorá sa selektívne viaže na žalúdočnú mucín [16] je vysoko konzervovaný medzi geneticky divergentná T. cruzi
línií [17] a je odolná voči štiepenie pepsínom pri kyslom pH, zatiaľ čo gp90 izoformy s diferenciálnej náchylnosťou k peptickým štiepením možno vyjadriť v rôznych kmeňov, takže vysoká alebo nízka infekčnosť orálnou cestou je spojená s expresiou pepsínu-citlivé alebo pepsínom odolné proti gp90 izoformy [14, 15]. Či je taká rozmanitosť v gp90 prejavu a ústnej infekčnosti je tiež nájdený v TCI a TcIV DTUs zostáva vyšetriť. Neexistuje žiadne informácie o experimentálne perorálnej infekcie týmito parazitmi, dostupné údaje sa vzťahujú k myšiam injekčne s krvnými trypomastigotes alebo metacyclic formy intraperitoneálnou cestou [18], čo je neprirodzený spôsob infekcie. Tu sme analyzovali metacyclic trypomastigotes TCI a TcIV kmeňov izolovaných z chagasic pacientov v rôznych geografických oblastiach, pokiaľ ide o gp82 a gp90 expresie, schopnosť migrovať žalúdočného hlienu vrstvy a na inváziu do žalúdočnej sliznice epitelu po orálnom podaní myšiam. K objasneniu mechanizmov parazit invázie in vitro
invázie buniek testy boli vykonané za použitia ľudské epitelové bunky. Ako povrchové antigény spontánne prístrešok z tkanivových trypomastigotes kultúry odvodené od [19] boli hlásené, že hrajú úlohu v T. cruzi
infekcie [20], sme skúmali, či povrchové molekuly sa uvoľní metacyclic formy a ovplyvnil invázie buniek hostiteľa.
metódy
parazity a invázie buniek hostiteľ test
Trypanosoma cruzi
kmeňov z trypanozómy Culture Collection (TCC), Katedra parazitológia, Universidade de São Paulo, boli láskavo poskytol Dr. Marta MG Teixeira. Tie boli izolované z chagasic pacientov v rôznych zemepisných oblastiach: TCC: 28 (Amazon, Brazília), TCC: 515 (Venezuela), TCC: 588 (Guatemala), TCC: 1522 (Paraíba, Brazília), TCC: 1434 (Amapá, Brasil ). Kmene 28, 515, 588 a 1522 boli TCI a napätie 1434, izolované od jedinca infikovaného orálnou cestou, bol TcIV. Ako kontrola, CL kmeň (TcVI) bola použitá v niekoľkých pokusoch. Parazity boli udržiavané cyklicky u myší a u pečeňové infúzie Tryptóza médiá. K stimulácii diferenciácie, parazitov boli pestované na jednej pasáži v TC100 (Vitrocell, Brazília), alebo Grace médiu (Invitrogen) a metacyclic formy sa čistí priechodom cez kolónu DEAE-celulózy, ako je popísané [21]. Hela bunky, ľudské epitelové bunky karcinómu odvodených, boli pestované pri 37 ° C v Dulbeccova minimálnym esenciálnym médiu (DMEM), doplnenom 10% fetálnym teľacím sérom (FCS), streptomycínom (100 ug /ml) a penicilínom (100 U /ml) vo zvlhčenej 5% CO 2 atmosfére. Invázia buniek test bol vykonaný, ako je uvedené na inom mieste [22], že sa nasadí čistených metacyclic trypomastigotes do každej jamky 24-jamkových doštičiek obsahujúcich 13 mm, priemer kruhovej krycie sklíčka potiahnutá 1,4 x 10 5 Hela bunky, a to buď v DMEM s 10 % FCS (D10) alebo v PBS ++ (PBS obsahujúce na liter: 140 mg CaCl 2 400 mg KCI, 100 mg MgCl 2,6H 2O, 100 mg MgSO 4.7H 2O, 350 mg NaHCO 3). Po 1 h inkubácie s parazitmi, duplicitné krycie boli fixované v roztoku Bouin, zafarbené Giemsa a sekvenčne dehydrovaná v acetónu, je odstupňované radu acetón: xylolu (9: 1, 7: 3, 3: 7) a xylol. Počet intracelulárnych parazitov sa započítava do celkového počtu 250 buniek.
Ústne infekcie
Päť až šesť týždňov staré samice Balb /c myší, vyšľachtené v živočíšnej zariadení na Universidade Federal de São Paulo, boli použité. Všetky postupy a experimenty prispôsobený s reguláciou inštitucionálnej etickou komisiou pre pokusov na zvieratách a štúdia bola schválená výborom (Protokol č 0234/12). Myši boli infikované T. cruzi
metacyclic formy orálnou cestou (5 x 10 7 parazity 0,1 ml PBS na zviera), s použitím 1 ml striekačky s ihlou žalúdočnou sondou, ktorá bola vložená do úst zvierat. Pre detekciu parazitov v žalúdočnej sliznici epitel, žalúdok myší naočkovaných orálne metacyclic formy sa oddelia 4 dni po infekcii, fixované 10% neutrálnym formaldehydu po dobu 24 hodín. Po spracovaní postupným dehydratáciu v odstupňované rade roztoku etanolu, s následným ponorením xylén a vstavanie do parafín, sériové 5 um tkanivové rezy boli narezané a zafarbené hematoxylínom a eosínu. V ďalšej sade experimentov, metacyclic formy boli podávané perorálne myšiam (1 x 10 6 parazity 0,1 ml PBS na zviera) a začína 10. deň po inokulácii, parazitémií sa monitoruje dvakrát týždenne preverením 5 ul vzoriek krvi zhromaždené z chvosta, na fázovým kontrastom mikroskopu. Na 30 dní po infekcii, žalúdok, srdce a pečeň boli zhromaždené a spracované pre histologické prípravkov, ako je popísané vyššie.
Stanovenie migrácie parazitov prostredníctvom žalúdočného hlienu vrstvy
Polykarbonátové filtre Transwell (3 um pórov, priemer 6,5 mm , Costar) bola potiahnutá 50 ul prípravku s obsahom 10 mg /ml žalúdočnej mucín vo vode. Metacyclic formy, suspendované v 600 ul PBS bolo pridané do dolnej časti 24 jamkami (1 x 10 7 parazity /jamku), sa mucín potiahnuté Transwell filtre boli umiestnené do jamiek parazitmi obsahujúcej 100 ul PBS sa pridaný do filtračnej komory. Po 30 minútach a /alebo 1 h inkubácie pri 37 ° C, 10 vzoriek ul boli odobraté z filtračnej komory pre počítanie parazitov.
Prietokové cytometrie a nepriame imunofluorescenčné testy
živé metacyclic trypomastigotes (1 x 10 7 ) boli inkubované na ľade po dobu 1 hodiny s monoklonálnou protilátkou 1G7 alebo 3, F6, smerujúce v tomto poradí metacyclic stupeň špecifické povrchové molekuly gp82 a gp90. Potom, paraziti boli fixované 4% para-formaldehydu po dobu 20 min. Po premytí v PBS, paraziti boli inkubované s Alexa Fluór 488-konjugovanou anti-IgG po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti a počet fluorescenčných parazitov bola odhadnutá s BD AccuriTM C6 prietokovom cytometri. Kontrolný parazitov boli inkubované len so sekundárnou protilátkou. Pre vizualizáciu bunkovej lysosomes Hela, krycie sklíčka s boli adherentní bunky inkubované po dobu 1 hodiny pri teplote 37 ° C v D10, alebo v PBS ++, alebo boli inkubované s parazitmi v D10 po dobu 1 hodiny. Po fixácii sa 4% p-formaldehydu v PBS po dobu 30 minút boli bunky ošetrené 50 mM NH 4 cl v PBS po dobu 30 minút a premyté v PBS. Bunky potom boli inkubované po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti s myšou anti-ľudskej LAMP2 zriedeného 1: 8 (v /v) v roztoku PBS, ktorý obsahuje 0,15% želatíny, 0,1% azidu sodného a 1% saponín (PGN-saponín). Po premytí v PBS, sa krycie sklíčka boli inkubované po dobu 1 hodiny s Alexa Fluór 568-konjugovaný anti-myší IgG (Invitrogen), zriedený 1: 300 v PGN-Saponín, obsahujúci 500 ng /ml phalloidin-FITC a 10 ug /m DAPI (4 ', 6'-1-diamino-2-fenylindolu dihydrochlorid), nasleduje premytie v PBS a následnej montáži krycie sklíčko v predĺžiť Gold (Invitrogen). Konfokálna snímky boli nadobudnuté v Leica TCS SP8 laserového rastrovacieho mikroskopu (Leica, Nemecko) pomocou olej ponorné Plan-Apochromát 63x ciele (numerickou apertúrou 1,4). Série snímok získaná z konfokálna z-komíny boli spracované a analyzované pomocou Leica LAS AF (Leica, 2012, Nemecko) a softvéru Imaris (v bitovej rovine).
Príprava parazitov upraveného média
Metacyclic formy (10 8) boli inkubované pri teplote 37 ° C počas 1 hodiny v 100 ul kompletnú D10 médium, živiny-zbavený PBS ++ alebo PBS. Po odstredení sa usadenina sa odloží a supernatant (upravené médium) sa zhromaždia. Na použitie v testoch bunkovej invázie upravené médium sa zriedi v pomere 1: 100 v PBS alebo D10 ++ a pre Western blot 10 ul bol vložený
produkciu a purifikáciu rekombinantného proteínu gp82
rekombinantného proteínu obsahujúceho. plnej dĺžke T. cruzi
gp82 sekvencie (GenBank TM dátovej základne, prístupové číslo L14824) v ráme s gluthatione s-transferáza (GST), bol produkovaný v E. coli DH5a
-a a čistí sa ako je DETAILNÝ inde [23].
Štatistická analýza
t
skúške študenta, ako boli vykonané v GraphPad software (verzia 6.01), bol zamestnaný.
výsledky
Orálny infekcie myší T. cruzi
metacyclic formy
schopnosť TCI parazitov infikovať myši pri perorálnom podaní bola skúmaná v sade experimentov. Štyridsať myši boli rozdelené do 8 skupín po piatich zvieratách. V jednej sérii pokusov, ktorých cieľom je kontrola inváziu žalúdočného epitelu tým metacyclic trypomastigotes, boli použité 4 skupiny a každá skupina piatich myší dostávala iný parazit kmeň (5 x 10 7 paraziti na zviera). Štyri dni po orálnom podaní, žalúdok myší boli zhromaždené a spracované pre preparátov. Vysoký počet parazitov bol použitý v tomto prípade, pretože v predchádzajúcich štúdiách s TCI kmeň G, z divokého prenosového cyklu, sme zistili, že aj napriek vysokej očkovacie veľmi málo amastigote hniezda, ktoré zodpovedajú intracelulárne replikujúce amastigotes, boli zistiteľné pri 4 ° C deň po orálnej infekcie. Cez veľké inokula, mohli by sme nezistí amastigote hniezda mikroskopickou analýzou histologických sekcií žalúdka (Tabuľka 1). Ďalšie sada pokusov bola vykonaná na určenie, či tam bol nejaký rozdiel v tkanivovej tropizme medzi T. cruzi
kmeňov. Za týmto účelom boli použité zvyšné 4 skupiny a každá skupina piatich myší dostávala iný parazit kmeň (1 x 10 6 paraziti na jedno zviera) a priebeh infekcie bola sledovaná po dobu 30 dní. Začína v deň 10, úrovne parazitémií boli sledované dvakrát týždenne, a v deň 30, žalúdka, srdce a pečeň boli odobraté pre histologické analýze. V tomto prípade sa inokulum bol menší, pretože usúdil, že sa po niekoľkých kolách invázie buniek a intracelulárnu replikáciu, amastigote hniezda by bolo zistiteľné. Parazitémií vymizol po celú dobu pozorovania, ale infekcia bola potvrdená u všetkých skupín detekciou amastigote hniezd v žalúdku a /alebo v srdci myší (tabuľka 1), ale nie v pečeni. Poznámky bolo to, že v žalúdku myší infikovaných kmeňom 1522, ktorý odvodený z chronickej chagasic pacienta s terminálnym zlyhaním srdca [24], parazity boli nájdené v srdci, ale nie v žalúdku, zatiaľ čo naopak použitá k infekcii kmeňom 28 (tabuľka 1). Amastigote hniezd boli prítomné vo vysokých počtoch v žalúdku niektorých myší infikovaných kmeňom 28 alebo 588 (tabuľka 1), pravdepodobne v dôsledku niekoľkých kolách invázie a intracelulárnu replikáciu v žalúdočnej epitel. Skutočnosť, že parazity neboli detekované v myšiam žalúdku pri 4 dni po perorálnom podaní, ale iba v neskoršom časovom bode, po intracelulárnych cykly replikácie, navrhol buď neefektívne migráciu metacyclic foriem prostredníctvom vrstvy slizu, neefektívne invázia cieľových buniek epitelu a /alebo intracelulárnu parazit násobenie. Okrem kmeňov TCI, sme skúmali jeden kmeň TcIV, 1434, odvodený z perorálne infikovaných pacientovi. Amastigote hniezda, v malých množstvách, boli zistené u 3 myší na 4. deň po infekcii v histologických rezoch žalúdku, ale paraziti neboli nájdené v žalúdku, alebo v srdci 30 dní po infekcii (Tabuľka 1). Parazitémií bol negatívny priebehu 30 denného infekcie. Pozitívne hemoculture potvrdila infekciu všetkých kmeňov. Histologické preparáty boli tiež skúmané na prítomnosť zápalových procesov. Bez ohľadu na to kmeňa parazitov, zápalových ložísk boli ťažko zistiteľný v žalúdku v deň 4 alebo 30 po infekcii, alebo v srdci v deň 1 30.Table orálny infekcii myší s metacyclic formy T. cruzi
strainsa
T. cruzi
kmeň
(pôvod)
Mouse
Amastigote hniezda (počet tkanivových rezoch)
Žalúdok (Deň 4)

Žalúdok (Deň 30)
Heart (Deň 30)
28
(Brazília Amazonie)
1
0 (20)
0 (20) NETHRY.cz 0 (20)
2
0 (20)
60 (20)
0 (21) Sims 3 NETHRY.cz 0 (20)
285 (20) NETHRY.cz 0 (20)
4
0 (20)
11 (18)
0 (23)
5 NETHRY.cz 0 (20)
NDB
0 (20)
515
(Venezuela)
1
0 (21)
0 (24)
0 (20)
2
0 (19) NETHRY.cz 0 (13)
0 (25) Sims 3
0 (20)
0 (21) NETHRY.cz 0 (23)
4. NETHRY.cz 0 (20)
45 (11)
0 (21)
5
0 (20)
5 (21) NETHRY.cz 0 (24)
588
(Guatemala)
1
0 (09)
31 (19)
10 (21)
2
0 (12)
17 (18) NETHRY.cz 0 (20)
3
0 (09)
6 (20) Sims 3 (15)
4
0 (12)
87 (19) NETHRY.cz 0 (19)
5
0 (16)
990 (20) NETHRY.cz 0 (16)
1522
(Brazília severovýchod)
1
0 (16)
0 (17)
0 (20)
2
0 (19)
0 (15)
4 (20) Sims 3
0 (20) NETHRY.cz 0 (17)
0 (20)
4
0 (21)
0 (20)
6 (20)
5
0 (21) NETHRY.cz 0 (16)
4 (18)
1434
(Brazília Amazonie) foto 1
5 (40)
0 (18)
0 (20)
2 Sims 3 (40)
0 (24)
0 (20) Sims 3
0 (36)
0 (20)
0 (20)
4 NETHRY.cz 0 (35)
0 (20)
0 (21)
5
5 (40)
0 (20)
0 (21)
aMetacyclic formy z uvedených parazitov kmene boli podávané orálne myšiam. V jednom experimente, myši dostávali 5 x 107 parazitov a 4 dni neskôr sa žalúdok bolo pre preparátov. V ďalšom experimente, myši dostávali 1 x 106 parazitov a 30 dní neskôr, žalúdok a srdce boli zbierané pre preparátov
b ND nestanovené
migrácie T. cruzi
metacyclic formulárov pomocou žalúdočné mucín vrstva
test napodobňovať parazita translokáciu cez vrstvu hlienu v žalúdku bola vykonaná za použitia filtrov transwell potiahnutých žalúdočného hlienu, ktorý je hlavnou zložkou makromolekulárnej hlienu. Predchádzajúce štúdie ukázali, že TcVI metacyclic formy, ktoré účinne napadnúť žalúdočné epitel pri orálnom podaní myšiam, prechádzať žalúdočného hlienu potiahnutých transjamkových filter, rovnako účinne ako prázdne filter a táto vlastnosť je spojená s expresiou pepsínu odolné G82 molekula, ktorá selektívne viaže na žalúdočnú mucín [16, 25]. Žalúdočné mucín potiahnuté Transwell filtre boli umiestnené na hornej časti jamiek obsahujúcich metacyclic formy. Po 30 až 60 minútach inkubácie pri 37 ° C, bol počítaný počet parazitov, ktoré dosiahol hornej komory. TCI paraziti zobrazená zníženú schopnosť migrovať skrze žalúdočného hlienu vrstvy, v porovnaní s kmeňom CL (TcVI), ktorá slúžila ako kontrola (Obr. 1a), čo potvrdzuje, že žalúdočné mucín pôsobí ako bariéra pre migráciu. Metacyclic formy TcIV kmeňa 1434 prekročila žalúdočného hlienu potiahnuté filtre efektívnejšie ako TCI parazitmi, ale za nižšie sadzby, než CL kmeňa (obr. 1a). Skúmali sme expresiu gp82 a jeho odolnosť voči pepsínu v kmeňoch TCI a TcIV. Metacyclic formy boli liečení po dobu 1 hodiny s 2 mg /ml pepsínu v citrátovom roztoku pri pH 3,5, čo je podmienka, ktorá značne degradovala BSA (obr. 1b), a čistiace rozpustné extrakty boli analyzované pomocou Western blot, spolu s neliečenými parazitmi, s použitím monoklonálnych protilátka (mAb) 3 F6 zameraná na gp82. Pred reakciou s mAb 3 F6, rovné nakladanie vzoriek parazitov bola kontrolovaná Ponceau-S farbením (ďalší súbor 1: Obrázok S1A). Expresia gp82, ktorý bol zachovaný v nezmenenej podobe po liečbe s pepsínom, bol podobný vo všetkých kmeňoch, zrejme v trochu vyšších koncentráciách v kmeňa 1434, než u kmeňov TCI (obr. 1b). Pretože by to mohlo vysvetľovať vyššia migračnej kapacity kmeňa 1434, sme porovnávali expresiu gp82 tohto kmeňa k tomu CL napätie, ktoré účinne prekročil žalúdočného hlienu potiahnutý filter (obr. 1a). Gp82 výraz bol porovnateľný v roku 1434 a CL kmeňov (ďalší súbor 1: Obrázok S1B horný panel). Prítomnosť gp82 molekuly na parazita povrchu bola potvrdená analýzou prietokovou cytometriou (obr. 1c). Ďalej skúmať, či kmeň 1434 vyjadril vyššie úrovne ako gp82 kmeňov TCI, blot analýza Western bol opakovaný za použitia kmeňa 515 ako zástupca TCI línie. MT vzorky týchto dvoch kmeňov, pripravených v rovnaký deň a elektroforese na rovnakom géle SDS-PAGE ukázala, podobný profil (dodatočný súbor 1: Obrázok S1C). Zo všetkých týchto údajov a ďalšiu analýzu FACS z dvoch kmeňov, ktoré ukazujú mierne vyššia gp82 hladiny v kmeňa 1434 (Ďalší súbor 1: Obrázok S1D), nie je možné urobiť záver, že relatívna účinnosť kmeňa 1434 metacyclic foriem pri prechode cez žalúdočných mucín vrstva je vzhľadom k diferenciálnej expresie gp82. Ako T. cruzi
je známe, že spontánne uvoľňujú povrchových molekúl [19, 20, 26], molekuly parazit-prístrešok môže byť tiež zodpovedný za pozorované účinky. Overili sme, či gp82 bola preliata do média po dobu 1 h inkubácie v PBS, stave používané v žalúdočného hlienu migračného testu. Western blot analýza supernatantu po odstránení parazitov, získaný ako je popísané v časti Metódy, bolo zistené, že kmene 515 a 1434 prístrešok značné množstvo gp82, na rozdiel od CL napätia, ktoré uvoľní gp82 na sotva detekovateľné úrovni, vzhľadom k tomu, gp90 bola preliata na vysokej úrovni kmeňom 515 a na veľmi nízkej úrovni kmene 1434 a CL (obr. 1D). V prípade, že molekuly rozdielne uvoľnené kmene 515, 1434 a CL v skutočnosti v rozpore s migráciou parazita cez žalúdočného hlienu plášti, ktoré by vysvetľovalo vysoké a nízkej účinnosti kmeňov CL a 515, v danom poradí, rovnako ako medziprodukt schopnosť prejavované kmeňom 1434 (obr. 1a). Experiment, aby sa preukázala vplyv uvoľnené gp90 na kmeni 515 migrácie bola vykonaná umiestnením žalúdočného hlienu potiahnuté Transwell filtre v hornej časti jamiek obsahujúcich metacyclic formy samotnej, alebo v zmesi s anti-gp90 mAb 5E7, ktorý nerozpoznáva živé parazity, alebo v zmesi s nesúvisí mAb 2c2 Réžia T. cruzi
amastigote molekuly [27]. Po 30 a 60 minútach inkubácie, vzorky z filtračnej komory boli odobraté pre počítanie parazitov. Parazitov v zmesi s anti-gp90 mAb 5E7, nie však v zmesi s netradičnej mAb 2c2, prejsť žalúdočné mucín povlak na vyššie hodnoty, ako kontroly parazitov (Obr. 1e), čo naznačuje, že prístrešok gp90 sa stretáva s migráciou parazit cez neznámym mechanizmom, ktorý nezahŕňa väzby, za predpokladu, že gp90 sa neviaže na žalúdočného hlienu [28]. Zásah gp82, ktorá nemohla byť preukázaná, pretože anti-gp82 mAb 3 F6 sa viaže na živé parazity, bude pochopiteľné, pretože sa viaže na žalúdočnú mucín. Tiež sme skúmal, či gp90 a gp82 boli rozdielne prepustený v neutrálnom a kyslom pH. Kondicionované médium získané z metacyclic foriem kmeňa 515 inkubované v PBS, pH 7,2, alebo v citrátovom pufri, pH 3,5, bola analyzovaná pomocou Western Blot. Uvoľnenie gp82 bola podobná ako pri pH, zatiaľ čo gp90 ubúdanie bola nižšia v kyslom prostredí (ďalší súbor 1: Obrázok S1B spodný panel). Obr. 1 Migrácia gp82-exprimujúcich T. cruzi
metacyclic formy cez žalúdočného hlienu vrstvy. A Transwell Filtre potiahnuté žalúdočného hlienu boli umiestnené do jamiek obsahujúcich označeným kmene parazitov. Vzorky boli odobraté z filtračnej komory v priebehu 30 minút a 60 minút pre počítanie parazitov. Hodnoty sú priemer ± SD z troch nezávislých experimentov. V porovnaní s CL kmeňom, podstatne nižšia migrácia kmeňov TCI (** P Hotel < 0,0005) a TcIV kmeň 1434 (* P Hotel < 0,005) sa vyskytla u 60 min. b Metacyclic formy, neošetrené (-) alebo liečených (+) s 2 mg /ml pepsínu, pri pH 3,5, boli analyzované westernovým prenosom za použitia mAb 3 F6 smerujúce k gp82. Ako kontrola aktivitu pepsínu, je znázornený BSA zafarbený modrí Coomassie. c Živé parazitov boli inkubované na ľade po dobu 1 hodiny, v neprítomnosti alebo v prítomnosti mAb 3 F6. Po fixácii, paraziti boli inkubované s Alexa Fluór 488-konjugovanou anti-IgG a bol odhadovaný počet fluorescenčných parazitov. d Parazity boli inkubované po dobu 1 hodiny v PBS. Po odstredení na odstránenie parazitov, podmienené PBS bol analyzovaný westernovým prenosom za použitia mAb 3 F6 a mAb 5E7, smerujúce k gp82 a gp90, resp. e Transwell Filtre potiahnuté žalúdočného hlienu boli umiestnené do jamiek obsahujúcich metacyclic formy kmeňa 515 samostatne, alebo v prítomnosti anti-gp90 mAb 5E7, ktoré nerozpozná živé parazity alebo nepríbuzného mAb 2c2. Po 30 a 60 minútach inkubácie, vzorky z filtračnej komory boli odobraté pre počítanie parazitov. Hodnoty sú priemery ± variácie duplikátov
hostiteľa invázie buniek T. cruzi
metacyclic formy
zníženej schopnosti metacyclic foriem v napadajúce žalúdočnej epitel po orálnom podaní myšiam bolo spojené s expresiou pepsínu odolné proti gp90 na vysokej úrovni, a koreluje so zlou infekčnosti smerom kultivovaných ľudských epitelových buniek [14, 15]. Skúmali sme schopnosť TCI a TcIV metacyclic formulárov pre vstup do hostiteľskej bunky. Parazitov boli inkubované s HeLa bunkami po dobu 1 hodiny v plnom DMEM živín a bol počítaný počet vnútrobunkových parazitov. Nízka schopnosť invázia bola spoločným rysom všetkých kmeňov, TcIV kmeň 1434 kmeň vykazujúci vyššiu účinnosť ako kmene TCI (obr. 2a). Analýza Western blot, za použitia monoklonálnej protilátky namierené na gp90, odhalilo, že všetky parazity vyjadrený pepsín odolné proti gp90 (obr. 2b). Prítomnosť gp90 na povrchu parazita bola kontrolovaná pomocou prietokovej cytometrie u kmeňov 515 a 1434. V opakovaných testoch s použitím rôznych vzoriek parazitologické, gp90 bol nájdený pri oveľa nižších úrovniach kmeňa 1434 (obr 2c, ďalší súbor 1 :. Obrázok S1E). My sme očakávali vyššiu invázie buniek schopnosť kmeňa 1434, pretože pozorovaná profil gp90 je podobná ako u CL kmeňa metacyclic formy (Ďalší súbor 1: Obrázok S1B horný panel), ktoré nie sú rozpoznávané anti-gp90 monoklonálnych protilátok (mAb), gp90 je detekovateľný v detergente extrakte vo Western blot. Obr. 2 hostiteľská bunka invázia gp90 expresiou T. cruzi
metacyclic foriem. A Hela bunky boli inkubované po dobu 1 hodiny s uvedenými parazitov kmeňov v plnom DMEM živín. Po fixácii a farbení Giemsovým počet intracelulárnych parazitov bol počítaný v celkovo 250 buniek. Hodnoty sú priemer ± SD zo štyroch nezávislých testoch vykonaných v dvoch vyhotoveniach. V porovnaní s CL kmeňom, podstatne nižšia inváziu kmeňov 28, 588 a 1522 (*** P Hotel < 0,0005), kmeň 515 (** P Hotel <0,001) a kmeň 1434 (* P
< 0,005) bola zistená Študent t
testu. b Metacyclic formy, neošetrené (-) alebo liečených (+) s 2 mg /ml pepsínu, pri pH 3,5, boli analyzované pomocou Western Blot s použitím anti-gp90 mAb 1G7. Ako kontrola aktivitu pepsínu, je znázornený BSA zafarbený modrí Coomassie. c Živé parazitov boli inkubované na ľade po dobu 1 hodiny, v neprítomnosti alebo v prítomnosti mAb 1G7. Po fixácii, paraziti boli inkubované s Alexa Fluór 488-konjugovanou anti-IgG a počet fluorescenčných parazitov bola odhadnutá
Vplyv povrchových molekúl uvoľnených T. cruzi
metacyclic foriem v hostiteľskej bunky invázie
Zistili sme, či gp82 a gp90 bola uvoľnená do média v priebehu 1 h inkubácie v kompletnom D10, teda za podmienok použitých v teste bunkovej invázie. Western blot analýza kondicionovaného média, pripraveného ako je opísané v časti Metódy, bolo zistené, že gp90 bola preliata na najvyššej úrovni kmeňom 515 a na najnižšej úrovni od kmeňa CL, zatiaľ čo gp82 uvoľnenie kmene 515 a 1434 bol zreteľne vizualizovaný, ale bol ťažko zistiteľný v CL kmeň supernatantu (obr. 3a). Ďalej sme testovali možnosť, že invazívne kapacita metacyclic foriem bol ovplyvnený gp90 uvoľňovaných do karty. CL deformácia metacyclic formy boli inkubované po dobu 1 hodiny s HeLa bunkami v samotnej alebo v D10 plus 1% z upraveného média z 515 kmeňa D10 médiá, alebo nie vopred inkubovali s anti-gp90 mAb 1G7 alebo nepríbuznými mAb 2c2. kmeňa CL bol použitý z dôvodu jeho bunkovej invázii vyššou kapacitou a nedostatok reakcie s mAb 1G7. Ako je znázornené na Obr. 3b, upravené médium výrazne znižuje parazit invázie, jeho inhibičná aktivita bola väčšinou neutralizovaný anti-gp90 mAb 1G7, ale nie netradičnej mAb 2c2. Pravdepodobne sa gp82 prítomný v upravenom médiu tiež prispelo k pozorovaným inhibičným účinkom, ale toto bolo ťažké dokázať, pretože anti-gp82 mAb, ktoré nerozpozná živé parazity nie je k dispozícii. V HeLa bunkách inkubovaných v D10 po dobu 30 minút s metacyclic formami kmeňa 515 alebo 1434 došlo k určitému rozšíreniu lyzozómov (obr. 3c), ktoré môžu vzniknúť v dôsledku interakcie s gp82 uvoľneného do média. Rekombinantný proteín gp82 bolo preukázané, že indukuje lysosom rozptylu do periférie buniek [29], a udalosť, ktorá vrcholí v exocytózou a prispieva k parasitophorous tvorbu vakuol požadované pre T. cruzi
invázii [30-32]. Obr. 3 Vplyv gp90 vydané T. cruzi
metacyclic foriem v hostiteľskej bunky invázie. Obr. Ako je znázornené na Obr. Obr.

• Systematický prehľad a metaanalýza laparoskopickej a otvorenej gastrektómii pre pokročilú rakovinou žalúdka
• Sérum CD26 hladiny u pacientov s rakovinou žalúdka: nová potenciálna diagnostickým markerom