Host invasione delle cellule e l'infezione orale da Trypanosoma cruzi ceppi di gruppi genetici TCI e TcIV da Chagas invasione patients

cellula ospite e l'infezione orale da Trypanosoma cruzi
ceppi di gruppi genetici TCI e TcIV da pazienti Chagas
Abstract
sfondo
focolai della malattia di Chagas acuta da infezione orale sono stati riportati frequentemente negli ultimi dieci anni, con una maggiore incidenza nel nord del Sud America, dove Trypanosoma cruzi
lignaggio Tci predomina, essendo responsabile per la principale causa di malattie umane risorgente, e una piccola percentuale è identificato come TcIV. Meccanismi di infezione orale e l'invasione host-cellule di questi parassiti sono poco conosciuti. Per affrontare questa domanda, abbiamo analizzato T. cruzi
ceppi isolati da pazienti Chagas in Venezuela, Guatemala e Brasile.
Metodi
Trypanosoma cruzi
metacyclic tripomastigoti sono stati inoculati per via orale in topi. Lo stomaco del mouse raccolto quattro giorni dopo, così come lo stomaco e cuore raccolto 30 giorni dopo l'infezione, sono stati processati per l'analisi istologica. Saggi per imitare la migrazione dei parassiti attraverso lo strato di muco gastrico sono state effettuate contando i parassiti che attraversavano filtri transwell gastrici mucina rivestite. Per i saggi di invasione delle cellule, le cellule HeLa epiteliali umane sono state incubate con forme metacyclic e il numero di parassiti internalizzati è stato contato.
Risultati in tutte le nazioni TCI e TcIV T. cruzi
ceppi sono stati mal infettiva per via orale. I parassiti erano o non rilevabili o sono stati rilevati in piccole quantità nello stomaco del mouse quattro giorni dopo la somministrazione orale. parassiti replicatori stati trovati nello stomaco e /o nel cuore 30 giorni dopo l'infezione. Rispetto al Tci lineage, la capacità di migrazione di TcIV parassiti attraverso il filtro mucina gastrica rivestite era superiore ma inferiore a quella esibita dal TcVI forme metacyclic precedentemente dimostrato di essere altamente infettivo per via orale. Espressione dei GP90 pepsina resistente, la molecola di superficie che downregulates invasione delle cellule, era superiore in TCI rispetto parassiti TcIV e, di conseguenza, la capacità invasione forme metacyclic TcIV era superiore. molecole GP90 spontaneamente rilasciate da forme metacyclic TCI inibito l'ingresso del parassita nelle cellule ospiti. parassiti TCI esposte basso tasso di replicazione intracellulare.
Conclusioni
nostri risultati indicano che la scarsa capacità di Tci stirpe, e in misura minore di parassiti TcIV, a invadere dell'epitelio gastrico dopo l'infezione orale di topi può essere associato con l'inefficienza di forme metacyclic, in particolare di parassiti TCI, di migrare attraverso lo strato di muco gastrico, di invadere le cellule epiteliali bersaglio e di replicare intracellulare.
Parole
Trypanosoma cruzi
TCI e TcIV lignaggi tripomastigoti Metacyclic infezione orale cellula ospite invasione Sfondo
l'esito di infezione da Trypanosoma cruzi
, l'agente della malattia di Chagas, può variare molto: il 20-30% dei pazienti con infezione cronica sviluppano grave miocardite, alterazioni del tratto digestivo (megaesofago e /o megacolon) si verificano meno frequentemente, mentre la maggior parte rimane asintomatica per tutta la vita. Lo sfondo genetico e lo stato immunologico dell'host nonché l'eterogeneità della popolazione parassiti possono contribuire a questa diversità [1] e, eventualmente, le fonti di infezione e la dose infettiva. Secondo la nomenclatura intraspecifica istituito nel 2009, T. cruzi
ceppi sono classificati in sei unità di battitura discreti (DTU), TCI-TcVI [2]. Nei paesi del Nord del Sud America e nella regione amazzonica, dove megaesofago e megacolon sono rari e Chagas cardiomiopatia è un luogo comune, Tci è l'agente predominante della malattia di Chagas, in contrasto con TCII, che è stato isolato dalla maggior parte dei pazienti, nella regione centro-orientale del Brasile dove T. cruzi
infezione è di solito associata con mega sindromi [1, 3]. TCI è stato sottolineato come la principale causa di malattie umane risorgente nel nord del Sud America, sulla base di genotipizzazione per la risoluzione a scala fine della distribuzione geografica, con un grande pannello di marcatori microsatelliti polimorfici [4]. Negli ultimi anni, i focolai di malattie acute Chagas di infezione orale sono stati riportati in Venezuela [5, 6], Colombia [7, 8] e nell'Amazzonia brasiliana [9, 10], dove TCI è prevalente e una piccola percentuale è stata identificati come TcIV.
tripomastigoti Metacyclic sono implicati nei casi di orale T. cruzi
infezione sopra riferito. Sulla base della presenza di nidi amastigote all'interno delle sezioni di mucosa gastrica, ma nessuna evidenza di T. cruzi
invasione all'interno dell'orofaringe o esofago di animali per via orale a forme metacyclic insetto-derivato, l'invasione della mucosa gastrica dell'epitelio stato suggerito essere un portale unico di ingresso per l'infezione da T. cruzi
sistemico [11]. Gli esperimenti con ceppi TCII e TcVI da pazienti Chagas hanno rivelato che le molecole di superficie metacyclic specifico stadio gp82 e GP90, che agiscono come promotore e inibitore dell'invasione bersaglio cellule rispettivamente [12, 13], svolgono un ruolo cardine nel infezione orale [14, 15]. Gp82, che si lega selettivamente al mucina gastrica [16] è altamente conservata tra geneticamente divergenti T. cruzi
linee [17] ed è resistente alla digestione da pepsina a pH acido, mentre isoforme GP90 con sensibilità differenziale di digestione peptica possono essere espressi in diversi ceppi cosicché alta o bassa infettività per via orale è associata con l'espressione di pepsina sensibili o pepsina resistente GP90 isoforma [14, 15]. Se una tale diversità di espressione GP90 e infettività orale si trova anche in TCI e TcIV DTU resta ancora da esplorare. Non ci sono informazioni sulla infezione sperimentale per via orale da questi parassiti, i dati disponibili si riferiscono a topi iniettati con tripomastigoti sangue o forme metacyclic per via intraperitoneale [18], che è un modo innaturale di infezione. Qui abbiamo analizzato tripomastigoti metacyclic di ceppi TCI e TcIV isolati da pazienti Chagas in diverse regioni geografiche, per quanto riguarda la gp82 e l'espressione GP90, la possibilità di migrare attraverso lo strato di mucina gastrica e di invadere gastrica epitelio della mucosa sulla somministrazione orale in topi. Per chiarire i meccanismi di invasione del parassita, in vitro
sono stati eseguiti test di invasione delle cellule, utilizzando cellule epiteliali umane. Come antigeni di superficie spontaneamente capannone da tessuto tripomastigoti cultura di derivazione [19] sono stati segnalati a svolgere un ruolo in T. cruzi
infezione [20], abbiamo esaminato se molecole di superficie sono stati rilasciati dalle forme metacyclic e influenzato l'invasione della cellula ospite.
Metodi
saggio di parassiti e l'invasione della cellula ospite
Trypanosoma cruzi
ceppi trypanosomatidae Culture Collection (TCC), Dipartimento di Parassitologia, Universidade de São Paulo, sono stati gentilmente forniti dal Dr. Marta MG Teixeira. Essi sono stati isolati da pazienti Chagas in diverse regioni geografiche: TCC: 28 (Amazon, Brasile), TCC: 515 (Venezuela), TCC: 588 (Guatemala), TCC: 1522 (Paraíba, Brasile), TCC: 1434 (Amapá, Brasile ). Ceppi 28, 515, 588 e il 1522 erano TCI e ceppo 1434, isolato da un individuo infetto per via orale, è stato TcIV. Come controllo, ceppo CL (TcVI) è stato utilizzato in diversi esperimenti. I parassiti sono stati mantenuti ciclicamente nei topi e nel fegato medio infusione Triptosio. Per stimolare la differenziazione, i parassiti sono state coltivate per un passaggio a TC100 (Vitrocell, Brasile) o media di Grace (Invitrogen) e forme metacyclic sono stati purificati dal passaggio attraverso colonna DEAE-cellulosa, come descritto [21]. cellule HeLa, le carcinoma derivate cellule epiteliali umane, sono state coltivate a 37 ° C in terreno essenziale minimo di Dulbecco (DMEM), supplementato con 10% di vitello siero fetale (FCS), streptomicina (100 mcg /ml) e la penicillina (100 U /ml) in un umidificata al 5% CO 2 atmosfere. saggi cellulari invasione sono stati eseguiti come descritto altrove [22], dalla semina tripomastigoti metacyclic purificati su ciascun pozzetto di piastre da 24 pozzetti contenenti diametro vetrini rotondi 13 mm rivestito con 1,4 × 10 5 cellule HeLa, sia in DMEM con 10 % FCS (D10) o in PBS ++ (PBS contenente per litro: 140 mg CaCl 2, 400 mg KCl, 100 mg MgCl 2.6h 2O, 100 mg MgSO 4.7H 2O, 350 mg di NaHCO 3). Dopo 1 h di incubazione con parassiti, i coprioggetti duplicati sono stati fissati in soluzione di Bouin, colorate con Giemsa e sequenzialmente disidratato in acetone, una serie graduata di acetone: xylol (9: 1, 7: 3, 3: 7) e xilolo. Il numero di parassiti intracellulari è stato contato in un totale di 250 cellule.
Infezione orale
Cinque o sei topi BALB /c femmine settimane di età, allevati nella struttura animali a Universidade Federal de São Paulo, sono stati utilizzati. Tutte le procedure e gli esperimenti conformi con il regolamento del Comitato Etico istituzionale per la sperimentazione animale, e lo studio è stato approvato dal Comitato (protocollo n 0234/12). I topi sono stati infettati con T. cruzi
forme metacyclic per via orale (5 × 10 7 parassiti in 0,1 ml di PBS per animale), utilizzando 1 ml siringa con ago sonda gastrica che è stata inserita nella bocca dell'animale. Per il rilevamento di parassiti nell'epitelio della mucosa gastrica, lo stomaco di topi inoculati per via orale con forme metacyclic state raccolte 4 giorni dopo l'infezione, fisso con formaldeide neutra 10% per 24 ore. Dopo la trasformazione da un graduale disidratazione in una serie graduata di soluzione di etanolo, seguito da immersione xilene e inclusione in paraffina, seriali 5 micron sezioni di tessuto sono state tagliate e colorate con ematossilina ed eosina. In un'altra serie di esperimenti, forme metacyclic sono stati somministrati per via orale in topi (1 × 10 6 parassiti in 0,1 ml di PBS per animale) e a partire dal giorno 10 post-inoculazione, parassitemia è stato monitorato due volte alla settimana, esaminando 5 campioni di sangue microlitri raccolti dalla coda, al microscopio a contrasto di fase. A dopo l'infezione di 30 giorni, lo stomaco, il cuore e il fegato sono stati raccolti e trattati per i preparati istologici, come descritto in precedenza
. Saggio di migrazione parassita attraverso lo strato di mucina gastrica
filtri transwell policarbonato (3 micron pori, diametro 6,5 millimetri , Costar) sono stati rivestiti con 50 ml di una preparazione contenente 10 mg /ml mucina gastrica in acqua. forme Metacyclic, sospesa in 600 microlitri di PBS, sono stati aggiunti al fondo di piastre da 24 pozzetti (1 × 10 7 parassiti /pozzetto), i filtri transwell mucina rivestite sono state poste su pozzi parassita contenenti e 100 microlitri di PBS erano aggiunto alla camera del filtro. Dopo 30 min e /o di 1 h di incubazione a 37 ° C, 10 campioni microlitri sono stati raccolti dalla camera filtro per il conteggio del parassita.
Citometria a flusso e dosaggi in immunofluorescenza indiretta
tripomastigoti live metacyclic (1 × 10 7 ) sono state incubate in ghiaccio per 1 ora con l'anticorpo monoclonale 3 F6 o 1G7, diretto rispettivamente metacyclic molecola di superficie specifica stadi gp82 o GP90. Successivamente, i parassiti sono stati fissati con 4% para-formaldeide per 20 min. Dopo lavaggio in PBS, i parassiti sono state incubate con Alexa Fluor 488 coniugato anti-IgG per 1 ora a temperatura ambiente ed il numero di parassiti fluorescenti stato stimato con un BD AccuriTM C6 citometro a flusso. parassiti controllo sono stati incubati con il solo anticorpo secondario. Per visualizzare lisosomi cellule HeLa, coprioggetto con cellule aderenti sono state incubate per 1 ora a 37 ° C in D10 o in PBS ++, o sono state incubate con parassiti in D10 per 1 h. Dopo fissazione con 4% p-formaldeide in PBS per 30 minuti, le cellule sono state trattate con 50 mM NH 4Cl in PBS per 30 minuti e lavate in PBS. Le cellule sono state poi incubate per 1 ora a temperatura ambiente con il mouse LAMP2 anti-umano diluito 1: 8 (v /v) in una soluzione di PBS contenente 0,15% di gelatina, 0,1% di sodio azide e 1% di saponina (PGN-saponina). Dopo lavaggio in PBS, i vetrini sono stati incubati per 1 h con Alexa Fluor 568 coniugato anti-IgG di topo (Invitrogen), diluito 1: 300 in PGN-saponina contenente 500 ng /ml phalloidin-FITC e 10 ug /m DAPI (4 ', dicloridrato 6'-1-diammino-2-fenilindolo), seguito da lavaggi in PBS e successivo montaggio di coprioggetto in ProLong Gold (Invitrogen). immagini confocali sono state acquisite in una Leica TCS SP8 laser-microscopio a scansione (Leica, Germania) con un obiettivo Plan-Apochromat 63X immersione in olio (apertura numerica 1.4). La serie di immagini ottenute da confocale z-stack sono stati elaborati e analizzati utilizzando Leica LAS AF (Leica 2012, Germania) e software Imaris (Bitplane).
Preparazione del parassita mezzo condizionato
forme Metacyclic (10 8) sono state incubate a 37 ° C per 1 h in 100 microlitri completo medio D10, nutrienti privato PBS ++ o PBS. Dopo centrifugazione, il pellet è stato scartato e il surnatante (medium condizionato) è stato raccolto. Per l'utilizzo in invasione delle cellule saggi il mezzo condizionato è stato diluito 1: 100 in D10 o PBS ++ e Western Blot 10 microlitri è stato caricato
Produzione e purificazione di proteine ​​gp82 ricombinante
La proteina ricombinante contenente il. full-length T. cruzi
sequenza gp82 (GenBank TM banca dati, il numero di adesione L14824) nel telaio con gluthatione S-transferasi (GST), è stato prodotto in E. coli
DH5-α e purificato come dettagliate altrove [23] analisi statistica
test t di Student
Il
., come implementato nel software GraphPad (versione 6.01), è stato impiegato
. Risultati
infezione orale di topi con T. cruzi
forme metacyclic
la capacità dei parassiti TCI per infettare topi per via orale è stata esaminata in una serie di esperimenti. Quaranta topi sono stati separati in 8 gruppi di cinque animali. In una serie di esperimenti, volti a verificare l'invasione dell'epitelio gastrico tripomastigoti metacyclic, 4 gruppi sono stati utilizzati e ogni gruppo di cinque topi hanno ricevuto un diverso ceppo del parassita (5 × 10 7 parassiti per animale). Quattro giorni dopo somministrazione orale, lo stomaco di topi sono stati raccolti e trattati per preparati istologici. Un elevato numero di parassiti è stato utilizzato in questo caso, perché in precedenti studi con ceppo TCI G, dal ciclo di trasmissione selvaggio, avevamo trovato che anche con un elevato inoculo pochissimi nidi amastigote, che corrispondono a intracellulary amastigoti replicano, erano rilevabili in 4 giorno dopo l'infezione per via orale. Nonostante il gran inoculo, non siamo riusciti a rilevare nidi amastigote da analisi microscopica delle sezioni istologiche dello stomaco (Tabella 1). Un'altra serie di esperimenti è stata effettuata per determinare se vi fosse alcuna differenza nel tropismo tissutale tra T. cruzi
ceppi. A tal fine, i restanti 4 gruppi sono stati usati ed ogni gruppo di cinque topi hanno ricevuto un diverso ceppo parassita (1 × 10 6 parassiti per animale) e il corso dell'infezione è stata seguita per 30 giorni. A partire dal giorno 10, i livelli di parassitemia sono stati monitorati due volte la settimana, e al giorno 30 lo stomaco, il cuore e il fegato sono stati raccolti per l'analisi istologica. In questo caso, l'inoculo era più piccolo, perché abbiamo concluso che, dopo diversi cicli di invasione delle cellule e la replica intracellulare, nidi amastigote sarebbero rilevabili. Parassitemia era rilevabile durante tutto il periodo di osservazione ma l'infezione è stata confermata in tutti i gruppi per il rilevamento di nidi amastigote nello stomaco e /o nel cuore di topi (Tabella 1), ma non nel fegato. Di nota è che nello stomaco di topi infettati con il ceppo 1522, che deriva da un paziente Chagas cronica con insufficienza cardiaca allo stadio terminale [24], i parassiti sono stati trovati nel cuore, ma non nello stomaco mentre l'opposto applicata alle infezioni da sforzo 28 (Tabella 1). nidi amastigote erano presenti un numero elevato nello stomaco di alcuni topi infettati con il ceppo 28 o 588 (Tabella 1), presumibilmente derivanti da vari cicli di invasione e la replicazione intracellulare nell'epitelio gastrico. Il fatto che i parassiti non sono stati rilevati nello stomaco del mouse alle 4 del giorno dopo la somministrazione per via orale, ma solo in un punto secondo momento, dopo cicli di replicazione intracellulare, suggerito sia una migrazione inefficiente delle forme metacyclic attraverso lo strato di muco, l'invasione inefficiente delle cellule epiteliali bersaglio e /o moltiplicazione parassita intracellulare. Oltre a ceppi TCI, abbiamo esaminato un ceppo TcIV, 1434, derivata da un paziente per via orale infettato. nidi amastigote, in piccole quantità, sono stati rilevati in 3 topi a 4 ° giorno dopo l'infezione in sezioni istologiche di stomaco, ma parassiti non sono state trovate nello stomaco o nel cuore 30 giorni dopo l'infezione (Tabella 1). Parassitemia è stata negativa per tutto il corso di infezione di 30 giorni. emocoltura positiva confermato l'infezione da tutti i ceppi. preparati istologici sono stati esaminati per la presenza di processi infiammatori. Indipendentemente dal ceppo del parassita, focolai infiammatori erano appena rilevabili nello stomaco al giorno 4 o 30 dopo l'infezione, o nel cuore al giorno 30.Table 1 infezione orale di topi con forme metacyclic di T. cruzi
strainsa
T. cruzi
ceppo
(origine)
mouse
amastigote nidi (numero di sezioni di tessuto)
stomaco (4 ° giorno)

Stomaco (Giorno 30)
Cuore (Giorno 30)
28
(Brasile Amazon)
1 0 (20)
0 (20)
0 (20) 2
0 (20)
60 (20)
0 (21) 3
0 (20)
285 (20)
0 (20) 4
0 (20)
11 (18)
0 (23)
5
0 (20)
NDB
0 (20)
515
(Venezuela)
1 0 (21)
0 (24)
0 (20) 2
0 (19)
0 (13)
0 (25) 3
0 (20)
0 (21)
0 (23) 4
0 (20)
45 (11)
0 (21)
5
0 (20)
5 (21)
0 (24)
588
(Guatemala)
1
0 (09)
31 (19)
10 (21) 2
0 (12)
17 (18)
0 (20)
3
0 (09)
6 (20) Pagina 3 (15) 4
0 (12)
87 (19)
0 (19)
5
0 (16)
990 (20)
0 (16)
1522
(Brasile nord-est)
1 0 (16) 0
(17)
0 (20) 2
0 (19)
0 (15) Pagina 4 (20) 3
0 (20) 0
(17)
0 (20) 4
0 (21)
0 (20)
6 (20)
5
0 (21) 0
(16) Pagina 4 (18)
1434
(Brasile Amazon)
1 5 (40)
0 (18)
0 (20) Pagina 2 Pagina 3 (40)
0 (24)
0 (20) 3
0 (36)
0 (20)
0 (20) Pagina 4
0 (35)
0 (20)
0 (21)
5
5 (40)
0 (20)
0 (21)
aMetacyclic forme di ceppi di parassiti indicati, sono stati somministrati per via orale in topi. In un esperimento, i topi hanno ricevuto 5 × 107 parassiti e 4 giorni dopo lo stomaco sono stati raccolti per i preparati istologici. In un altro esperimento, i topi hanno ricevuto 1 × 106 parassiti e 30 giorni più tardi, lo stomaco e il cuore sono stati raccolti per i preparati istologici
b ND non
determinato
migrazione di T. cruzi
forme metacyclic attraverso la strato di mucina gastrica
Un test per imitare la traslocazione parassita attraverso lo strato di muco nello stomaco è stato eseguito utilizzando filtri transwell rivestiti con mucina gastrica, che è il principale componente macromolecolare del muco. Studi precedenti avevano dimostrato che TcVI forme metacyclic, che invadono in modo efficiente l'epitelio gastrico quando somministrato per via orale in topi, attraversano il filtro transwell mucina rivestite gastrica nel modo più efficace il filtro vuoto e questa proprietà è associata con l'espressione di pepsina resistente molecola G82 che selettivamente si lega alla mucina gastrica [16, 25]. Gastrico filtri transwell mucina rivestite sono stati collocati in cima pozzetti contenenti forme metacyclic. Dopo 30 e 60 minuti di incubazione a 37 ° C, il numero di parassiti che raggiunge la camera superiore è stato contato. parassiti Tci visualizzati ridotta capacità di migrare attraverso lo strato di mucina gastrica, rispetto al ceppo CL (TcVI) che serviva come controllo (Fig. 1a), confermando che mucina gastrica agito come una barriera per la migrazione. forme Metacyclic di TcIV ceppo 1434 attraversato i filtri mucina rivestite gastrici più efficiente rispetto parassiti TCI, ma ancora a tassi inferiori rispetto ceppo CL (Fig. 1a). Abbiamo esaminato l'espressione di gp82 e la sua resistenza alla pepsina in ceppi TCI e TcIV. forme Metacyclic sono stati trattati per 1 h con 2 mg /pepsina ml in soluzione di citrato a pH 3,5, a condizione che ampiamente degradata BSA (Fig. 1b), e gli estratti solubili detergenti sono stati analizzati mediante Western blot, insieme con parassiti non trattati, utilizzando monoclonale anticorpo (mAb) 3 F6 indirizzato a gp82. Prima reazione con mAb 3 F6, pari carico dei campioni del parassita è stata controllata da Ponceau S-colorazione (sui file 1: Figura S1A). Espressione di gp82, che è stata conservata intatta dopo il trattamento di pepsina, era simile in tutti i ceppi, a quanto pare a livelli leggermente superiori a ceppo 1434 che in ceppi TCI (fig. 1b). Come questo potrebbe spiegare la capacità di migrazione elevato di ceppo 1434, abbiamo confrontato l'espressione gp82 di questo ceppo a quella del ceppo CL che efficientemente attraversato il filtro mucina gastrica rivestite (Fig. 1a). espressione Gp82 era paragonabile nel 1434 e ceppi CL (file aggiuntivo 1: Figura S1B pannello superiore). La presenza di molecole gp82 sulla superficie del parassita è stata confermata mediante analisi citofluorimetrica (Fig. 1c). Per esaminare ulteriormente se ceppo 1434 ha espresso livelli più elevati rispetto gp82 ceppi TCI, l'analisi Western Blot è stata ripetuta utilizzando ceppo 515 come rappresentante del Tci lignaggio. MT campioni dei due ceppi, preparate nello stesso giorno ed elettroforesi sullo stesso gel SDS-PAGE, mostrato profilo simile (file complementare 1: Figura S1C). Da tutti questi dati e ulteriori analisi FAC dei due ceppi, che mostrano livelli gp82 leggermente superiori a ceppo 1434 (sui file 1: Figura S1D), non è possibile concludere che l'efficienza relativa di ceppo 1434 forme metacyclic nella migrazione attraverso il gastrica strato di mucina è causa dell'espressione differenziale della gp82. Come T. cruzi
è noto per rilasciare spontaneamente molecole di superficie [19, 20, 26], molecole parassita-capannone potrebbe anche essere responsabile degli effetti osservati. Abbiamo controllato se gp82 è stato versato in media per 1 h di incubazione in PBS, condizione utilizzata nel test di migrazione mucina gastrica. Analisi Western blot del surnatante dopo la rimozione del parassita, ottenuto come descritto nella sezione Metodi, ha rivelato che i ceppi 515 e 1434 capannone considerevoli quantità di gp82, in contrasto con CL ceppo che chiarificati gp82 a livelli malapena rilevabili, che GP90 fu versato ad alti livelli dal ceppo 515 e a livelli molto bassi da ceppi 1434 e CL (Fig. 1D). Se le molecole differenzialmente rilasciate da ceppi 515, 1434 e il CL infatti interferire con la migrazione parassita attraverso il cappotto mucina gastrica, che spiegherebbe le efficienze alte e basse di ceppi CL e 515, rispettivamente, così come la capacità intermedia esposti da ceppo 1434 (Fig. 1a). Un esperimento per dimostrare l'influenza della GP90 rilasciato il ceppo 515 di migrazione è stato eseguito posizionando filtri transwell gastrici mucina rivestite in cima pozzetti contenenti forme metacyclic da solo, o mescolato con anti-GP90 monoclonale 5E7 che non riconosce i parassiti dal vivo o mescolato con estranei mAb 2C2 diretto verso T. cruzi
molecola amastigote [27]. Dopo 30 e 60 min di incubazione, sono stati prelevati campioni dalla camera del filtro per il conteggio parassita. I parassiti mescolati con anti-GP90 mAb 5E7, ma non quelli mescolati con mAb estranei 2C2, attraversate il cappotto mucina gastrica a numeri più alti rispetto parassiti di controllo (Fig. 1e), indicando che capannone GP90 interferisce con la migrazione del parassita attraverso il meccanismo sconosciuto che non coinvolge vincolanti, a condizione che GP90 non si lega a mucina gastrica [28]. L'interferenza da gp82, che non è stato possibile dimostrare in quanto anti-gp82 mAb 3 F6 si lega a vivere parassiti, sarebbe comprensibile perché si lega a mucina gastrica. Abbiamo inoltre esaminato se GP90 e gp82 sono stati rilasciati in modo differenziale pH neutro e acido. medium condizionato ottenuto da forme metacyclic di tensione 515 incubate in PBS, pH 7,2, o in tampone citrato, pH 3,5, è stato analizzato mediante Western blot. Rilascio di gp82 era simile sia a pH, mentre spargimento GP90 è stata inferiore a pH acido (sui file 1: Figura S1B pannello inferiore). Figura. 1 Migrazione di gp82 che esprimono T. cruzi
forme metacyclic attraverso lo strato di mucina gastrica. un filtro Transwell rivestiti con mucina gastrica sono stati collocati sui pozzetti contenenti i ceppi di parassiti indicati. I campioni sono stati prelevati dalla camera filtro a 30 min e 60 min per il conteggio parassita. I valori sono la media ± SD di tre esperimenti indipendenti. Rispetto al CL ceppo, una significativa minore migrazione di ceppi Tci (** P
< 0,0005) e la tensione TcIV 1434 (* P
< 0,005) è stata osservata a 60 min. b forme Metacyclic, non trattati (-) o trattate (+) con 2 mg /ml di pepsina, a pH 3,5, sono stati analizzati mediante Western blot utilizzando mAb 3 F6 diretto verso gp82. Poiché il controllo di attività della pepsina, è mostrato BSA macchiato da Coomassie blu. c parassiti vivo sono state incubate in ghiaccio per 1 h, in assenza o in presenza di mAb 3 F6. Dopo la fissazione, i parassiti sono state incubate con Alexa Fluor 488 coniugato anti-IgG e il numero di parassiti fluorescenti stato stimato. d I parassiti sono state incubate per 1 h in PBS. Dopo la centrifugazione per rimuovere i parassiti, la PBS condizionata è stato analizzato mediante Western blotting utilizzando mAb 3 F6 e mAb 5E7, per la regia di gp82 e GP90, rispettivamente. filtri e Transwell rivestiti con mucina gastrica sono stati collocati su pozzetti contenenti forme metacyclic di tensione 515 da solo, o in presenza di anticorpi anti-GP90 monoclonale 5E7 che non riconosce i parassiti dal vivo o mAb 2C2 estranei. Dopo 30 e 60 min di incubazione, sono stati prelevati campioni dalla camera del filtro per il conteggio parassita. I valori sono i mezzi ± variazione di duplicati
invasione della cellula ospite da T. cruzi
forme metacyclic
ridotta capacità di forme metacyclic a invadere dell'epitelio gastrico in seguito a somministrazione orale in topi è stata associata con l'espressione di GP90 pepsina resistente ad alti livelli, e correla con una scarsa infettività verso cellule epiteliali umane in coltura [14, 15]. Abbiamo esaminato la capacità di TCI e TcIV forme metacyclic per entrare cellule ospiti. I parassiti sono stati incubati con cellule HeLa per 1 h in piena DMEM nutrienti e il numero dei parassiti intracellulari è stato contato. bassa capacità di invasione è stata una caratteristica comune di tutti i ceppi, TcIV ceppo 1434 ceppo esibendo una maggiore efficienza rispetto ai ceppi TCI (Fig. 2a). Western blot, utilizzando anticorpo monoclonale diretto alla GP90, ha rivelato che tutti i parassiti hanno espresso GP90 pepsina-resistente (Fig. 2b). La presenza di GP90 sulla superficie del parassita è stata verificata mediante citometria di flusso di analisi in ceppi 515 e 1434. Nei saggi ripetuti utilizzando diversi campioni di parassiti, GP90 è stata trovata a livelli molto più bassi di ceppo 1434 (Fig 2c, file aggiuntivo 1:. Figura S1E). Ci aspettavamo una maggiore capacità di invasione delle cellule del ceppo 1434 perché il profilo osservato dei GP90 è simile a quello di CL forme ceppo metacyclic (sui file 1: Figura S1B pannello superiore), che non sono riconosciute da anticorpi monoclonali anti-GP90 (MAK, MAB), GP90 essendo rilevabile in estratto detergente da Western blot. Figura. invasione delle cellule 2 Host GP90-esprimono T. cruzi
forme metacyclic. un cellule HeLa sono state incubate per 1 ora con i ceppi di parassiti indicati per esteso DMEM nutrienti. Dopo la fissazione e colorazione Giemsa, il numero di parassiti intracellulari è stato contato in un totale di 250 cellule. I valori sono i mezzi ± SD di quattro analisi indipendenti eseguiti in duplicato. Rispetto al CL ceppo, una significativa invasione minore dei ceppi 28, 588 e il 1522 (*** P
< 0,0005), ceppo 515 (** P
< 0,001) e la tensione 1434 (* P
< 0.005) è stato rilevato dal test t di Student
. b forme Metacyclic, non trattati (-) o trattate (+) con 2 mg /ml di pepsina, a pH 3,5, sono stati analizzati mediante Western blot utilizzando anticorpi anti-GP90 mAb 1G7. Poiché il controllo di attività della pepsina, è mostrato BSA macchiato da Coomassie blu. c parassiti vivo sono state incubate in ghiaccio per 1 h, in assenza o in presenza di mAb 1G7. Dopo la fissazione, i parassiti sono state incubate con Alexa Fluor 488-coniugato anti-IgG e il numero di parassiti fluorescenti è stata stimata
Effetto di molecole di superficie rilasciati da T. cruzi
forme metacyclic nell'invasione cellula ospite
Abbiamo determinato se gp82 e GP90 sono state versate in media durante 1 h di incubazione a D10 completo, cioè, in condizioni usato nel saggio di invasione cellulare. Analisi Western Blot del mezzo condizionato, preparato come descritto nella sezione Metodi, ha rivelato che GP90 è stato versato ai massimi livelli dal ceppo 515 e ai livelli più bassi di tensione CL, mentre il rilascio gp82 da ceppi 515 e il 1434 è stato chiaramente visualizzato, ma è stato appena rilevabile in CL ceppo surnatante (Fig. 3a). Successivamente abbiamo testato la possibilità che la capacità invasiva delle forme metacyclic stata influenzata da GP90 rilasciati nel mezzo. deformazione CL forme metacyclic sono state incubate per 1 ora con le cellule HeLa in media D10 D10 da solo o in più 1% di mezzo condizionato di 515 ceppo, preincubate o no con l'anti-GP90 monoclonale 1G7 o con mAb 2C2 estranei. ceppo CL è stato utilizzato a causa della sua cella di una maggiore capacità di invasione e la mancanza di reazione con mAb 1G7. Come mostrato in Fig. 3b, condizionato medio significativamente ridotto parassita invasione, la sua attività inibitoria è stata in gran parte neutralizzato da anti-GP90 monoclonale 1G7, ma non di MAB estraneo 2C2. Presumibilmente, la gp82 presente in mezzo condizionato anche contribuito alla effetto inibitorio osservato, ma questo era difficile da dimostrare in quanto anti-gp82 monoclonale che non riconosce i parassiti vivi non è disponibile. Nelle cellule HeLa incubate in D10 per 30 minuti con forme metacyclic di tensione 515 o 1434, c'era qualche diffusione dei lisosomi (Fig. 3c) che possono derivare dall'interazione con gp82 rilasciato medio. La proteina gp82 ricombinante ha dimostrato di indurre lisosomi dispersione verso la periferia delle cellule [29], e l'evento che culmina in esocitosi e contribuisce alla formazione vacuoli parassitoforo richiesto per T. cruzi
invasione [30-32]. Figura. 3 Effetto della GP90 rilasciato da T. cruzi
forme metacyclic in invasione della cellula ospite. Figura. Come mostrato in Fig. Figura. Tutti gli autori hanno letto e approvato la versione finale del manoscritto.

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