Hôte invasion des cellules et de l'infection orale par Trypanosoma cruzi souches de groupes génétiques TCI et TCIV de patients chagasiques

Hôte invasion des cellules et de l'infection orale par Trypanosoma cruzi
souches de groupes génétiques TCI et TCIV de patients chagasiques
Résumé de l'arrière-plan
foyers de la maladie de Chagas aiguë par une infection par voie orale ont été fréquemment rapportés au cours des dix dernières années , avec une incidence plus élevée dans le nord de l'Amérique du Sud, où la lignée de Trypanosoma cruzi TcI prédomine, étant responsable de la principale cause de la maladie humaine renaissante, et un petit pourcentage est identifié comme TCIV. Les mécanismes de l'infection par voie orale et de l'invasion de la cellule hôte par ces parasites sont mal comprises. Pour répondre à cette question, nous avons analysé T. cruzi
souches isolées chez les patients Chagas au Venezuela, au Guatemala et au Brésil.
Méthodes
Trypanosoma cruzi
métacyclique trypomastigotes ont été inoculées par voie orale à des souris. L'estomac de souris recueilli quatre jours plus tard, ainsi que l'estomac et le cœur recueilli 30 jours après l'infection, ont été traitées pour l'analyse histologique. Des essais pour mimer la migration du parasite à travers la couche de mucus gastrique ont été réalisés par comptage des parasites qui ont traversé les filtres Transwell revêtus de mucine gastrique. Pour les essais d'invasion de cellules, les cellules HeLa épithéliales humaines ont été incubées avec des formes métacycliques et le nombre de parasites intériorisées a été compté.: Résultats
Tous TcI et TCIV T. cruzi
souches ont été mal infectieux par voie orale. Les parasites ont été soit indétectable ou ont été détectés en petits nombres dans l'estomac de souris quatre jours après l'administration par voie orale. parasites Réplication ont été trouvés dans l'estomac et /ou au cœur de 30 jours après l'infection. Par rapport à la lignée TcI, la capacité de migration des TCIV parasites à travers le filtre de type mucine gastrique revêtu était supérieure, mais inférieure à celle présentée par TcVI métacycliques précédemment révélés être hautement infectieux par voie orale. L'expression de la pepsine résistant à la gp90, la molécule de surface qui régule négativement l'invasion des cellules, était plus élevée dans TcI que chez les parasites TCIV et, par conséquent, la capacité d'invasion des formes métacycliques TCIV était plus élevé. molécules gp90 spontanément libérés par des formes métacycliques Tci inhibé l'entrée du parasite dans les cellules hôtes. parasites Tci présentaient un faible taux de réplication intracellulaire.
Conclusions
Nos résultats indiquent que la faible capacité de TcI lignée, et à un moindre degré des parasites TCIV, à envahir l'épithélium gastrique après l'infection par voie orale de souris peut être associée à l'inefficacité des formes métacycliques, en particulier des parasites Tci, à migrer à travers la couche de mucus gastrique, pour envahir les cellules épithéliales cibles et de répliquer intracellulairement
Mots-clés
Trypanosoma cruzi
Tci et TCIV lignées trypomastigotes métacycliques infection orale cellule hôte. invasion Contexte
le résultat de l'infection par Trypanosoma cruzi
, l'agent de la maladie de Chagas, peut varier considérablement: 20-30% des patients chroniquement infectés développent une myocardite sévère, des altérations de l'appareil digestif (megaesophagus et /ou mégacôlon) moins fréquentes, alors que la majorité reste asymptomatique pour la vie. L'arrière-plan génétique et l'état immunologique de l'hôte ainsi que l'hétérogénéité de la population de parasites peuvent contribuer à cette diversité [1] et peut-être la voie d'infection et la dose infectieuse. Selon la nomenclature intraspécifique établie en 2009, T. cruzi
souches sont classées en six unités de typage discrètes (DTU), ECI-TcVI [2]. Dans les pays du Nord de l'Amérique du Sud et dans la région amazonienne, où megaesophagus et mégacôlon sont cardiomyopathie rare et chagasiques est monnaie courante, ECI est l'agent prédominant de la maladie de Chagas, contrairement à TCII, qui a été isolé à partir de la plupart des patients dans la région centre-est du Brésil où T. cruzi
infection est généralement associée à des méga syndromes [1, 3]. TcI a été souligné que la principale cause de la maladie humaine renaissante dans le nord de l'Amérique du Sud, sur la base de génotypage pour la résolution fine échelle de la répartition géographique, en utilisant un large panel de marqueurs microsatellites polymorphes [4]. Au cours des dernières années, l'apparition de maladies Chagas aiguës par infection par voie orale ont été rapportés au Venezuela [5, 6], la Colombie [7, 8] et dans l'Amazonie brésilienne [9, 10], où TcI est répandue et un petit pourcentage a été identifiés comme TCIV.
trypomastigotes métacycliques sont impliqués dans les cas de T. cruzi orale
infection visée ci-dessus. Sur la base de la présence de nids amastigotes dans les sections de la muqueuse gastrique, mais aucune preuve de T. cruzi
invasion au sein de l'oropharynx ou de l'œsophage des animaux provoqués par voie orale avec des formes métacycliques insectes dérivés, l'invasion de l'épithélium de la muqueuse gastrique a été suggéré d'être un portail unique d'entrée pour systémique T. cruzi
infection [11]. Des expériences avec des souches TCII et TcVI de patients chagasiques ont révélé que les molécules de surface métacyclique spécifiques au stade gp82 et gp90, qui agissent en tant que promoteur et de l'inhibiteur de l'invasion cible cellulaire, respectivement [12, 13], jouent un rôle essentiel dans l'infection par voie orale [14, 15]. Gp82, qui se lie sélectivement à la mucine gastrique [16] est hautement conservée entre génétiquement divergentes T. cruzi
lignées [17] et est résistant à la digestion par la pepsine à un pH acide, tandis que les isoformes gp90 ayant une sensibilité différentielle à la digestion gastro-duodénal peuvent être exprimées dans différentes souches de sorte que l'infectivité élevée ou faible par voie orale est associée à l'expression de la pepsine sensible ou résistant à la pepsine gp90 isoforme [14, 15]. Que ce soit une telle diversité dans l'expression gp90 et l'infectiosité orale se retrouve également dans TcI et TCIV DTU reste à étudier. Il n'y a pas d'information sur l'infection par voie orale expérimentale par ces parasites, les données disponibles se réfèrent à des souris injectées avec trypomastigotes sanguins ou formes métacycliques par voie intrapéritonéale [18] qui est un mode non naturelle de l'infection. Ici, nous avons analysé trypomastigotes métacycliques de Tci et TCIV souches isolées chez les patients chagasiques dans différentes régions géographiques, en ce qui concerne la gp82 et gp90 expression, la capacité de migrer à travers la couche de mucine gastrique et d'envahir la muqueuse gastrique épithélium lors de l'administration par voie orale à des souris. Afin de clarifier les mécanismes d'invasion parasitaire, in vitro
essais d'invasion de cellules ont été réalisées, en utilisant des cellules épithéliales humaines. Comme antigènes de surface spontanément versé du tissu trypomastigotes de culture dérivés [19] ont été signalés à jouer un rôle dans T. cruzi
infection [20], nous avons examiné si les molécules de surface ont été libérés par des formes métacycliques et influencé l'invasion de la cellule hôte.
Méthodes de parasites et de l'invasion de la cellule hôte de test
Trypanosoma cruzi
souches de trypanosomatide Culture Collection (TCC), Département de parasitologie, Universidade de São Paulo, ont été aimablement fournies par le Dr Marta MG Teixeira. Ils ont été isolés de patients chagasiques dans différentes régions géographiques: TCC: 28 (Amazon, Brasil), TCC: 515 (Venezuela), TCC: 588 (Guatemala), TCC: 1522 (Paraíba, Brésil), TCC: 1434 (Amapá, Brasil ). Souches 28, 515, 588 et 1522 étaient TcI et la souche 1434, isolée à partir d'un individu infecté par voie orale, était TCIV. En tant que témoin, la souche CL (TcVI) a été utilisé dans plusieurs expériences. Les parasites ont été maintenus de façon cyclique chez la souris et dans le foie milieu de perfusion tryptose. Pour stimuler la différenciation, les parasites ont été cultivées pendant un passage dans TC100 (Vitrocell, Brésil) ou de milieu de Grace (Invitrogen) et métacycliques ont été purifiés par passage à travers une colonne de DEAE-cellulose, comme décrit [21]. les cellules HeLa, les cellules épithéliales de carcinome dérivées de l'homme, ont été cultivées à 37 ° C dans un milieu essentiel minimal de Dulbecco (DMEM) additionné de 10% sérum de veau foetal (FCS), de la streptomycine (100 ug /ml) et de la pénicilline (100 U /ml) dans un humidifiée à 5% de CO 2 atmosphère. des dosages de l'invasion des cellules ont été effectuées comme décrit précédemment [22], par ensemencement trypomastigotes métacycliques purifiés sur chaque puits de plaques à 24 puits contenant du diamètre des lamelles de verre rondes de 13 mm revêtu de 1,4 × 10 5 cellules HeLa, que ce soit dans un milieu DMEM avec 10 % FCS (D10) ou dans PBS ++ (PBS contenant par litre: 140 mg de CaCl 2, 400 mg de KCl, 100 mg de MgCl 2.6H 2O, 100 mg MgSO 4.7H 2O, 350 mg de NaHCO 3). Après 1 h d'incubation avec les parasites, les lamelles en double ont été fixés dans une solution de Bouin, colorées au Giemsa, et séquentiellement déshydratés dans de l'acétone, une série graduée d'acétone: xylol (9: 1, 7: 3, 3: 7) et le xylol. Le nombre de parasites intracellulaires a été compté dans un total de 250 cellules.
Infection orale
Cinq à six souris femelles BALB /c semaine-vieux, élevés dans l'animalerie à l'Universidade Federal de São Paulo, ont été utilisés. Toutes les procédures et les expériences étaient conformes à la réglementation du Comité d'éthique institutionnel pour l'expérimentation animale, et l'étude a été approuvé par le Comité (protocole n ° 0234/12). Les souris ont été infectées par T. cruzi
métacycliques par voie orale (5 x 10 7 parasites dans 0,1 ml de PBS par animal), en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille de gavage qui a été inséré dans la bouche de l'animal. Pour la détection de parasites dans l'épithélium de la muqueuse gastrique, l'estomac des souris inoculées par voie orale avec métacycliques ont été recueillis 4 jours après l'infection, fixées avec 10% de formaldehyde neutre pendant 24 h. Après traitement par déshydratation progressive dans une série progressive d'une solution d'éthanol, suivie par une immersion du xylène et l'incorporation dans la paraffine, des sections en série de 5 um de tissus ont été coupées et colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine. Dans une autre série d'expériences, les formes métacycliques ont été administrés par voie orale à des souris (1 x 10 6 parasites dans 0,1 ml de PBS par animal) et à partir du jour 10 post-inoculation, la parasitémie a été contrôlée deux fois par semaine en examinant 5 échantillons de sang de pi ont été recueillies à partir de la queue, au microscope à contraste de phase. Au post-infection 30 jours, l'estomac, le coeur et le foie ont été recueillies et traitées pour des préparations histologiques, comme décrit ci-dessus de. Dosage de la migration du parasite à travers la couche de mucine gastrique
filtres Transwell Polycarbonate (3 um pores, diamètre de 6,5 mm , Costar) ont été revêtues avec 50 ul d'une préparation contenant 10 mg /ml de mucine gastrique dans de l'eau. métacycliques, en suspension dans 600 ul de PBS ont été ajoutés au fond des plaques à 24 puits (1 x 10 7 parasites /puits), les filtres Transwell mucine revêtus ont été placés dans des puits contenant des parasites et 100 ul de PBS étaient ajouté à la chambre de filtration. Au bout de 30 min et /ou une heure d'incubation à 37 ° C, des échantillons de 10 pi ont été prélevés dans la chambre de filtre pour le comptage parasite.
Cytométrie en flux et des analyses d'immunofluorescence indirecte trypomastigotes métacycliques
direct (1 x 10 7 ) ont été mises en incubation sur de la glace pendant 1 h avec l'anticorps monoclonal 1G7 ou 3 F6, réalisé respectivement à métacyclique molécule de surface spécifique au stade gp82 ou gp90. Par la suite, les parasites ont été fixées avec 4% de paraformaldehyde pendant 20 minutes. À la suite de lavages en PBS, les parasites ont été mises en incubation avec Alexa Fluor 488 conjugué anti-IgG pendant 1 heure à la température ambiante et le nombre de parasites fluorescents a été estimée avec un BD AccuriTM C6 cytomètre de flux. des parasites témoins ont été incubées avec l'anticorps secondaire. Pour visualiser les lysosomes des cellules HeLa, les cellules adhérentes avec des lamelles couvre-objet ont été mises en incubation pendant 1 h à 37 ° C dans du PBS ou D10 ++ ou ont été incubées avec des parasites dans D10 pendant 1 h. Après fixation avec 4% de p-formaldéhyde dans du PBS pendant 30 min, les cellules ont été traitées avec 50 mM de NH 4Cl dans du PBS pendant 30 minutes et lavées dans du PBS. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 1 h à température ambiante avec une souris LAMPE2 anti-humain dilué 1: 8 (v /v) dans une solution PBS contenant 0,15% de gélatine, de l'azoture de sodium à 0,1% et 1% de saponine (PGN saponine). Après des lavages en PBS, les lamelles ont été incubées pendant 1 h avec Alexa Fluor 568 conjugué IgG anti-souris (Invitrogen), dilué à 1: 300 dans PGN saponine contenant 500 ng /ml phalloïdine-FITC et 10 pg /m DAPI (4 ', 6'-dichlorhydrate de 1-diamino-2-phénylindole), suivie par des lavages dans du PBS et le montage ultérieur des lamelles couvre-objet en or ProLong (Invitrogen). Les images confocales ont été acquises dans un Leica TCS SP8 laser microscope à balayage (Leica, Allemagne) en utilisant un objectif Plan-Apochromat 63X immersion dans l'huile (ouverture numérique 1.4). Préparation de la série d'images obtenues à partir z piles confocale ont été traitées et analysées à l'aide Leica LAS AF (Leica, 2012, Allemagne) et Imaris (Bitplane) logiciel. Du parasite milieu conditionné
formes métacycliques (10 8) ont été incubées à 37 ° C pendant 1 h dans 100 pi de milieu complet D10, nutriments privés du PBS ++ ou PBS. Après centrifugation, le culot a été jeté et le surnageant (milieu conditionné) a été recueilli. Pour une utilisation dans l'invasion des cellules Assays le milieu conditionné a été dilué 1: 100 dans du PBS ou D10 ++ et par Western Blot 10 ul a été chargé de la production et la purification de la protéine recombinée gp82
La protéine recombinante contenant. pleine longueur T. cruzi
séquence gp82 (GenBank de base de données TM, le numéro d'accès L14824) dans le cadre avec glutathion S-transférase (GST), a été produite dans E. coli
DH5-α et purifié comme L'infection orale
. Résultats ailleurs [23] L'analyse statistique de.
t
Le test de Student, mis en œuvre dans le logiciel GraphPad (version 6.01), a été employé détaillées des souris avec T. cruzi
formes métacycliques
la capacité des parasites Tci pour infecter des souris par voie orale a été examiné dans une série d'expériences. Quarante souris ont été séparées en 8 groupes de cinq animaux. Dans une série d'expériences visant à vérifier l'invasion de l'épithélium gastrique par trypomastigotes métacycliques, 4 groupes ont été utilisés et chaque groupe de cinq souris ont reçu une souche de parasite différent (5 x 10 7 parasites par animal). Quatre jours après l'administration orale, l'estomac des souris ont été recueillies et traitées pour des préparations histologiques. Un nombre élevé de parasites a été utilisé dans ce cas parce que dans les études précédentes avec la souche TcI G, à partir du cycle de transmission sauvage, nous avions constaté que même avec un haut inoculum très peu de nids amastigotes, qui correspondent à intracellulaire amastigotes répliquant, était détectable à 4 jour après l'infection par voie orale. Malgré le grand inoculum, nous ne pouvions pas détecter les nids amastigotes par analyse microscopique des coupes histologiques de l'estomac (tableau 1). Une autre série d'expériences a été effectuée pour déterminer s'il y avait une différence dans le tropisme tissulaire entre T. cruzi
souches. A cet effet, les 4 groupes restants ont été utilisés et chaque groupe de cinq souris ont reçu une souche de parasite différent (1 × 10 6 parasites par animal) et le cours de l'infection a été suivie pendant 30 jours. À partir du jour 10, le taux de parasitémie ont été contrôlés deux fois par semaine, et au jour 30 de l'estomac, le cœur et le foie ont été prélevés pour l'analyse histologique. Dans ce cas, l'inoculum était plus petite parce que nous avons pensé que, après plusieurs séries de l'invasion cellulaire et la réplication intracellulaire, les nids amastigotes seraient détectables. Parasitémie était indétectable pendant toute la période d'observation mais l'infection a été confirmée dans tous les groupes par la détection des nids amastigotes dans l'estomac et /ou dans le coeur de la souris (Tableau 1), mais pas dans le foie. À noter est que dans l'estomac de souris infectées par la souche 1522, qui provient d'un patient chronique chagasiques d'insuffisance cardiaque en phase terminale [24], les parasites ont été trouvés dans le cœur, mais pas dans l'estomac alors que l'inverse appliquée à l'infection par la souche 28 (tableau 1). nids amastigotes étaient présents à des nombres élevés dans l'estomac des souris infectées par la souche 28 ou 588 (tableau 1), résultant vraisemblablement de plusieurs tours d'invasion et de la réplication intracellulaire de l'épithélium gastrique. Le fait que les parasites ne sont pas détectés dans l'estomac de la souris au jour 4 après l'administration par voie orale, mais seulement à un moment ultérieur, après des cycles de réplication intracellulaire, a suggéré soit une migration inefficace des métacycliques à travers la couche de mucus, l'invasion inefficace des cellules epitheliales cibles et /ou la multiplication intracellulaire du parasite. En plus des souches Tci, nous avons examiné une souche TCIV, 1434, provenant d'un patient infecté par voie orale. nids amastigotes, en petit nombre, ont été détectés chez trois souris au jour 4 après l'infection dans les coupes histologiques de l'estomac, mais les parasites ne sont pas trouvées dans l'estomac ou dans le coeur 30 jours après l'infection (tableau 1). Parasitémie a été négative tout au long de l'infection de 30 jours. hémoculture positive a confirmé l'infection par toutes les souches. préparations histologiques ont également été examinées pour la présence de processus inflammatoires. Quelle que soit la souche de parasite, foyers inflammatoires étaient à peine détectables dans l'estomac au jour 4 ou 30 post-infection, ou dans le coeur au jour 30.Table 1 infection orale des souris avec des formes métacycliques de T. cruzi
strainsa
T. cruzi
souche
(origine)
Souris
amastigotes nids (nombre de coupes de tissus)
estomac (jour 4)

estomac (jour 30)
Heart (jour 30)
28
(Brésil Amazone) 1
0 (20)
0 (20)
0 (20) 2
0 (20)
60 (20)
0 (21) 3
0 (20)
285 (20)
0 (20) 4
0 (20)
11 (18)
0 (23)
5
0 (20)
NDB
0 (20)
515
(Venezuela) 1
0 (21)
0 (24)
0 (20) 2
0 (19)
0 (13) 0
(25) 3
0 (20)
0 (21)
0 (23) 4
0 (20)
45 (11)
0 (21)
5
0 (20)
5 (21)
0 (24)
588
(Guatemala)
1
0 (09)
31 (19)
10 (21) 2
0 (12)
17 (18)
0 (20)
3
0 (09)
6 (20)
3 (15) 4
0 (12)
87 (19)
0 (19)
5
0 (16)
990 (20)
0 (16)
1522
(Brésil Nord-Est) 1
0 (16) 0
(17)
0 (20) 2
0 (19)
0 (15)
4 (20) 3
0 (20) 0
(17)
0 (20) 4
0 (21)
0 (20)
6 (20)
5
0 (21) 0
(16)
4 (18)
1434
(Amazonie brésilienne) 1
5 (40)
0 (18) 0
(20)
2
3 (40)
0 (24)
0 (20) 3
0 (36)
0 (20)
0 (20)
4
0 (35) 0
(20)
0 (21)
5
5 (40)
0 (20)
0 (21)
aMetacyclic formes des souches de parasites indiqués ont été administrés par voie orale à des souris. Dans une expérience, les souris ont reçu 5 x 107 parasites et 4 jours plus tard, l'estomac ont été recueillis pour les préparations histologiques. Dans une autre expérience, les souris ont reçu 1 × 106 parasites et 30 jours plus tard, l'estomac et le cœur ont été recueillies pour les préparations histologiques
b ND
non déterminé
Migration de T. cruzi
formes métacycliques à travers le la couche de mucine gastrique
Un essai pour mimer la translocation du parasite à travers la couche de mucus dans l'estomac a été réalisée en utilisant des filtres transwell revêtus de la mucine gastrique, ce qui est le principal composant macromoléculaire du mucus. Des études antérieures avaient montré que TcVI formes métacycliques, qui envahissent efficacement l'épithélium gastrique lorsqu'il est administré par voie orale à des souris, traversent le filtre Transwell mucine enduit gastrique aussi efficacement que le filtre vide et cette propriété est associée à l'expression de la pepsine résistant molécule G82 qui sélectivement se lie à la mucine gastrique [16, 25]. filtres Transwell mucine revêtus gastriques ont été placés sur le dessus des puits contenant des formes métacycliques. Après 30 et 60 minutes d'incubation à 37 ° C, le nombre de parasites qui atteint la chambre supérieure a été compté. parasites Tci affichent une capacité réduite à migrer à travers la couche de mucine gastrique, par rapport à la souche CL (TcVI) qui a servi de contrôle (Fig. 1a), confirmant que la mucine gastrique a agi comme une barrière pour la migration. formes métacycliques de souche TCIV 1434 traversèrent les filtres mucine enduit gastrique plus efficacement que les parasites Tci, mais encore à des taux inférieurs à la souche CL (Fig. 1a). Nous avons examiné l'expression de gp82 et de sa résistance à la pepsine dans des souches Tci et TCIV. métacycliques ont été traitées pendant 1 heure avec 2 mg /ml de pepsine dans une solution de citrate à un pH de 3,5, une condition largement dégradé de BSA (figure 1b.) et les extraits solubles de détergent ont été analysés par transfert de type Western, ainsi que des parasites non traités, en utilisant monoclonale anticorps (mAb) 3 F6 dirigé vers gp82. Avant la réaction avec mAb 3 F6, charge égale des échantillons de parasites a été vérifiée par Ponceau-S coloration (fichier supplémentaire 1: Figure S1A). Expression de gp82, qui a été conservé intact après traitement à la pepsine, était semblable dans toutes les souches, apparemment à des niveaux légèrement plus élevés dans la souche 1434 que dans les souches Tci (Fig. 1b). Comme cela pourrait expliquer la capacité de migration plus élevé de la souche 1434, nous avons comparé l'expression gp82 de cette souche à celle de la souche CL qui efficacement traversé le filtre de mucine enduit gastrique (Fig. 1a). expression Gp82 était comparable en 1434 et les souches de CL (fichier supplémentaire 1: panneau supérieur Figure S1B). La présence de molécules gp82 sur la surface du parasite a été confirmée par analyse de cytométrie en flux (Fig. 1c). Pour examiner plus avant si la souche 1434 a exprimé des niveaux plus élevés que gp82 souches Tci, l'analyse Western blot a été répété en utilisant la souche 515 en tant que représentant de la TcI lignée. échantillons MT des deux souches, préparées dans le même jour et dans le même électrophorèse sur gel SDS-PAGE, ont montré le même profil (fichier additionnel 1: Figure S1C). De toutes ces données et AAAF analyse complémentaire des deux souches, montrant des niveaux gp82 légèrement plus élevés dans la souche 1434 (fichier supplémentaire 1: Figure S1D), il est impossible de conclure que l'efficacité relative de la souche 1434 formes métacycliques dans la migration à travers l'estomac la couche de mucine est due à l'expression différentielle de gp82. Comme T. cruzi
est connu pour libérer spontanément des molécules de surface [19, 20, 26], les molécules du parasite hangar pourrait également être responsable des effets observés. Nous avons vérifié si gp82 a été versé dans un milieu pendant 1 h d'incubation dans du PBS, condition utilisée dans l'essai de migration mucine gastrique. Analyse par Western blot du surnageant après élimination du parasite, obtenu comme décrit dans la section des méthodes, a révélé que les souches 515 et 1434 versé des quantités considérables de gp82, contrairement à la souche CL qui a libéré gp82 à des niveaux à peine détectables, alors que gp90 a été versé à des niveaux élevés par la souche 515 et à de très faibles niveaux par des souches 1434 et CL (Fig. 1d). Si les molécules différentiellement libérées par des souches 515, 1434 et CL en fait interférer avec la migration du parasite à travers la couche de mucine gastrique, ce qui expliquerait les rendements élevés et faibles de souches CL et 515, respectivement, ainsi que la capacité intermédiaire exposées par la souche 1434 (Fig. 1a). Une expérience pour démontrer l'influence de la gp90 libéré de la souche 515 de migration a été réalisée en plaçant des filtres Transwell à la mucine revêtue gastrique au-dessus des puits contenant métacycliques seul ou mélangé avec de l'anti-gp90 mAb 5E7, qui ne reconnaît pas les parasites vivants ou mélangé avec aucun rapport mAb 2C2 dirigé vers T. cruzi
molécule amastigote [27]. Après 30 et 60 minutes d'incubation, les échantillons provenant de la chambre de filtration ont été prélevés pour le comptage parasite. Parasites mélangés avec anti-gp90 mAb 5E7, mais pas mélangés avec mAb sans rapport 2C2, traversé la couche de mucine gastrique à un nombre plus élevé que les parasites du contrôle (Fig. 1E), indiquant que hangar gp90 interfère avec la migration du parasite à travers un mécanisme inconnu qui ne comporte pas la liaison, à condition que gp90 ne se lie pas à la mucine gastrique [28]. Ingérence gp82, qui n'a pas pu être démontrée parce anti-gp82 mAb 3 F6 se lie à des parasites vivants, serait compréhensible, car il se lie à la mucine gastrique. Nous avons également examiné si gp90 et gp82 ont été libérés de manière différentielle dans un pH neutre et acide. un milieu conditionné obtenu à partir métacycliques de la souche 515 mises en incubation dans du PBS, pH 7,2, ou dans du tampon citrate, pH 3,5, ont été analysées par Western Blot. Libération de gp82 était similaire à la fois le pH, alors que l'excrétion gp90 était inférieure à un pH acide (fichier supplémentaire 1: Figure S1B panneau inférieur). Figue. 1 Migration de T. cruzi de gp82 exprimant
formes métacycliques à travers la couche de mucine gastrique. un filtre Transwell revêtus de la mucine gastrique ont été placés dans des puits contenant les souches de parasites indiqués. Des échantillons ont été prélevés dans la chambre de filtre à 30 min et 60 min pour les parasites de comptage. Les valeurs sont les moyennes ± écart-type de trois expériences indépendantes. Par rapport à la souche CL, une migration inférieure significative des souches Tci (** P
< 0,0005) et la souche TCIV 1434 (* P
< 0,005) a été observée à 60 min. b métacycliques, non traitées (-) ou traitées (+) avec 2 mg /ml de pepsine à pH 3,5, ont été analysés par buvardage de Western en utilisant un mAb dirigé vers 3 F6 gp82. Comme le contrôle de l'activité de la pepsine, BSA teinté par le bleu de Coomassie est représenté. c parasites vivants ont été mises en incubation sur de la glace pendant 1 h, en l'absence ou en présence de mAb 3 F6. Après fixation, les parasites ont été incubées avec Alexa Fluor 488 anti-IgG conjugué, et le nombre de parasites fluorescents a été estimée. d parasites sont incubés pendant 1 h dans du PBS. Après centrifugation pour éliminer les parasites, le PBS conditionné a été analysé par Western blot en utilisant mAb 3 F6 et mAb 5E7, dirigé vers gp82 et gp90, respectivement. e filtres Transwell revêtus de la mucine gastrique ont été placés sur des puits contenant métacycliques de la souche 515 seul, soit en présence d'anticorps anti-gp90 mAb 5E7, qui ne reconnaît pas les parasites vivants ou sans rapport avec le mAb 2C2. Après 30 et 60 minutes d'incubation, les échantillons provenant de la chambre de filtration ont été prélevés pour le comptage parasite. Les valeurs sont les moyennes ± variation des doublons de l'invasion de la cellule hôte par T. cruzi
formes métacycliques
capacité réduite des formes métacycliques à envahir l'épithélium gastrique lors de l'administration par voie orale à des souris a été associée à l'expression de gp90 pepsine résistant à des niveaux élevés, et en corrélation avec une mauvaise infectivité vers les cellules épithéliales humaines en culture [14, 15]. Nous avons examiné la capacité des formes métacycliques Tci et TCIV pour entrer dans les cellules hôtes. Les parasites ont été incubés avec des cellules HeLa pendant 1 h en pleine DMEM des éléments nutritifs et le nombre de parasites intracellulaires a été compté. la capacité d'invasion faible était une caractéristique commune de toutes les souches, la souche TCIV 1434 souche présentant une plus grande efficacité que les souches Tci (fig. 2a). L'analyse Western blot en utilisant un anticorps monoclonal dirigé contre gp90, a révélé que tous les parasites expriment gp90 pepsine résistant (fig. 2b). La présence de gp90 sur la surface du parasite a été vérifiée par cytométrie de flux dans les souches 515 et 1434. Dans des essais répétés en utilisant différents échantillons de parasites, gp90 a été trouvé à des niveaux beaucoup plus faibles dans la souche 1434 (figure 2c, de fichiers supplémentaires 1:. Figure S1E). Nous nous attendions à une capacité d'invasion cellulaire plus élevée de la souche 1434 parce que le profil observé de gp90 est similaire à celle des CL formes souche métacycliques (fichier supplémentaire 1: Figure S1B panneau supérieur), qui ne sont pas reconnus par les anticorps monoclonaux anti-gp90 (Acm), gp90 étant détectable dans l'extrait de détergent par Western blot. Figue. 2 Host invasion des cellules par gp90-exprimant T. cruzi
formes métacycliques. un cellules HeLa ont été incubées pendant 1 h avec les souches de parasites indiqués dans DMEM complet des éléments nutritifs. Après fixation et coloration au Giemsa, le nombre de parasites intracellulaires a été comptée dans un total de 250 cellules. Les valeurs sont les moyennes ± écart-type de quatre essais indépendants effectués en double. Par rapport à la souche CL, une invasion inférieure significative des souches 28, 588 et 1522 (*** P
< 0,0005), la souche 515 (** P
< 0,001) et la souche 1434 (* P
< 0,005) a été détectée par t de Student
test. b métacycliques, non traitées (-) ou traitées (+) avec 2 mg /ml de pepsine à pH 3,5, ont été analysées par Western Blot utilisant des anticorps anti-gp90 mAb 1G7. Comme le contrôle de l'activité de la pepsine, BSA teinté par le bleu de Coomassie est représenté. c parasites vivants ont été mises en incubation sur de la glace pendant 1 h, en l'absence ou en présence de mAb 1G7. Après fixation, les parasites ont été incubés avec Alexa Fluor 488 conjugué anti-IgG et le nombre de parasites fluorescents a été estimé
Effet de molécules de surface libérées par T. cruzi
formes métacycliques dans l'invasion de la cellule hôte
Nous avons déterminé si gp82 et gp90 ont été versées dans un milieu pendant 1 h d'incubation à D10 complète, soit dans des conditions utilisées dans l'essai d'invasion cellulaire. Une analyse par transfert Western du milieu conditionné, préparé comme décrit dans la section des méthodes, a révélé que gp90 a été versé au plus haut niveau par la souche 515 et au plus bas niveau par la souche CL, alors que la libération gp82 par des souches 515 et 1434 a été clairement visualisé mais était à peine détectable dans CL souche surnageant (Fig. 3a). Ensuite, nous avons testé la possibilité que la capacité invasive des formes métacycliques a été influencée par gp90 libérées dans le milieu. la souche CL métacycliques ont été incubées pendant 1 h avec des cellules HeLa dans un milieu D10 D10 seul ou en plus 1% du milieu conditionné de la souche 515, préincubés ou non avec un anticorps anti-gp90 mAb 1G7 ou non liée avec mAb 2C2. souche CL a été utilisée en raison de sa cellule une plus grande capacité d'invasion et de l'absence de réaction avec mAb 1G7. Comme on le voit sur la Fig. 3b, moyenne réduit de manière significative l'invasion parasitaire conditionnée, son activité inhibitrice a été principalement neutralisé par anti-gp90 mAb 1G7, mais pas par le mAb sans rapport 2C2. On peut supposer que le présent gp82 dans un milieu conditionné a également contribué à l'effet inhibiteur observé, mais cela était difficile à démontrer, car anti-gp82 mAb qui ne reconnaît pas les parasites vivants ne sont pas disponibles. Dans les cellules HeLa incubées en D10 pendant 30 min avec des formes métacycliques de la souche 515 ou 1434, il y avait une certaine diffusion de lysosomes (Fig. 3c) qui peuvent résulter de l'interaction avec gp82 publié à moyen. La protéine gp82 recombinante a été montré pour induire la diffusion lysosome à la périphérie de la cellule [29], et l'événement qui se termine par une exocytose et contribue à la formation de vacuole parasitophore nécessaire pour T.cruzi
invasion [30-32]. Figue. 3 Effet de gp90 publié par T. cruzi
formes métacycliques dans l'invasion de la cellule hôte. Figue. Comme on le voit sur la Fig. Figue.

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