Vært celle invasion og oral infektion med Trypanosoma cruzi stammer af genetiske grupper TCI og TcIV fra chagasic patients

Host celle invasion og oral infektion med Trypanosoma cruzi
stammer af genetiske grupper TCI og TcIV fra chagasic patienter
Abstract
Baggrund
udbrud af akut Chagas sygdom ved oral infektion er blevet rapporteret hyppigt i de sidste ti år, med højere forekomst i det nordlige Sydamerika, hvor Trypanosoma cruzi
afstamning TCI fremherskende, er ansvarlig for den største årsag til genopståede sygdomme hos mennesker, og en lille procentdel er identificeret som TcIV. Mekanismer for oral infektion og vært-celleinvasion ved disse parasitter er dårligt forstået. For at løse dette spørgsmål, vi analyserede T. cruzi
stammer isoleret fra chagasic patienter i Venezuela, Guatemala og Brasilien.
Metoder
Trypanosoma cruzi
metacyclic trypomastigotes blev oralt indpodet i mus. Musen mave opsamlet fire dage senere, samt maven og hjertet samlet 30 dage efter infektion, blev forarbejdet til histologisk analyse. Assays til at efterligne parasit migration gennem den gastriske slimlag blev udført ved tælling af parasitter, der gennemløbes gastrisk mucin-belagte transwell filtre. For celle invasion assays blev humane epiteliale HeLa celler inkuberet med metacyclic former, og antallet af internaliserede parasitter blev talt.
Resultater
Alle TCI og TcIV T. cruzi
stammer blev dårligt inficeret oralt. Parasitter var enten målbart eller blev påvist i mindre mængder i muse maven fire dage efter oral indgivelse. Replikerende parasitter blev fundet i maven og /eller i hjertet 30 dage efter infektion. Sammenlignet med TCI afstamning, migration kapacitet TcIV parasitter gennem den gastriske mucin-belagte filter var højere, men lavere end den, der udvises af TcVI metacyclic former tidligere har vist sig at være yderst smitsom ad oral vej. Ekspression af pepsin-resistent gp90, overfladen molekyle, der nedregulerer celleinvasion, var højere i TCI end i TcIV parasitter og dermed invasionen kapacitet TcIV metacyclic former var højere. Gp90 molekyler spontant frigivet af TCI metacyclic former hæmmede parasitten trådt i værtsceller. TCI parasitter udviste lav intracellulær replikation sats.
Konklusioner
Vores resultater indikerer, at den ringe evne af TCI afstamning, og i mindre grad af TcIV parasitter, invaderende gastrisk epitel efter oral infektion af mus kan være forbundet med den ineffektive af metacyclic former, navnlig af TCI parasitter, at vandre gennem den gastriske slim lag, til at invadere target epitelceller og at replikere intracellulært.
Nøgleord
Trypanosoma cruzi
TCI og TcIV slægter metacyclic trypomastigotes Oral infektion Host celle invasion Baggrund
resultatet af infektion med Trypanosoma cruzi
, agent for Chagas sygdom, kan variere meget: 20-30% af kronisk inficerede patienter udvikler alvorlig myocarditis, ændringer i fordøjelseskanalen (mega-oesophagus og /eller megacolon) forekomme mindre hyppigt, mens hovedparten forbliver asymptomatisk for livet. Den genetiske baggrund og den immunologiske status vært samt heterogenitet parasitten befolkning kan bidrage til denne mangfoldighed [1] og eventuelt smittevej og infektiøs dosis. Ifølge den intraspecifikke nomenklatur etableret i 2009, er T. cruzi
stammer inddeles i seks diskrete skrive enheder (DTUs), TCI-TcVI [2]. I lande Nord i Sydamerika og i Amazonas-regionen, hvor mega-oesophagus og megacolon er sjældne og chagasic kardiomyopati er hverdagskost, TCI er den fremherskende agent for Chagas sygdom i modsætning til TCII, som er blevet isoleret fra de fleste patienter på brasilianske centrale øst region hvor T. cruzi
infektion er normalt forbundet med mega syndromer [1, 3]. TCI er blevet påpeget som den vigtigste årsag til genopståen human sygdom i det nordlige Sydamerika, baseret på genotypning for fine-skala opløsning på den geografiske fordeling, ved hjælp af et stort panel af polymorfe mikrosatellitmarkører [4]. I de senere år har udbrud af akut Chagas sygdomme ved oral infektion blevet rapporteret i Venezuela [5, 6], Colombia [7, 8] og i den brasilianske Amazonas [9, 10], hvor TCI er fremherskende og en lille procentdel har været identificeret som TcIV.
Metacyclic trypomastigotes er impliceret i ovenstående henvist tilfælde af oral T. cruzi
infektion. Baseret på tilstedeværelsen af ​​amastigote reder inden sektioner af maveslimhinden, men ingen beviser for T. cruzi
invasion i oropharynx eller spiserøret af dyr oralt udsættes insekt-afledte metacyclic former, blev invasionen af ​​maveslimhinden epitel foreslået at være en unik indgangsport til systemisk T. cruzi
infektion [11]. Forsøg med TCII og TcVI stammer fra chagasic patienter har vist, at de metacyclic fase-specifikke overflademolekyler gp82 og gp90, som virker som promotor og inhibitor af target celleinvasion, henholdsvis [12, 13], spiller afgørende roller i oral infektion [14, 15]. Gp82, som selektivt binder til gastrisk mucin [16] er stærkt konserveret mellem genetisk afvigende T. cruzi
slægter [17] og er modstandsdygtig overfor fordøjelse med pepsin ved sur pH, hvorimod gp90 isoformer med differentiel følsomhed over for peptisk spaltning kan udtrykkes i forskellige stammer, således at højt eller lavt infektivitet ad oral vej er forbundet med ekspressionen af ​​pepsin-modtagelige eller pepsin-resistent gp90 isoform [14, 15]. Om en sådan mangfoldighed i gp90 udtryk og oral infektivitet findes også i TCI og TcIV DTUs mangler at blive undersøgt. Der er ingen oplysninger om eksperimentel oral infektion med disse parasitter, de tilgængelige data refererer til mus injiceret med blod trypomastigotes eller metacyclic former ad intraperitoneal vej [18], som er en unaturlig tilstand for infektion. Her analyserede vi metacyclic trypomastigotes af TCI og TcIV stammer isoleret fra chagasic patienter i forskellige geografiske regioner, hvad angår gp82 og gp90 udtryk, evnen til at migrere gennem gastrisk mucin lag og at invadere maveslimhinden epitel efter oral administration i mus. At klarlægge de mekanismer, parasit invasion in vitro
celleinvasion assays blev udført under anvendelse af humane epitelceller. Som overfladeantigener spontant kaste fra vævskulturer-afledte trypomastigotes [19] er blevet rapporteret at spille en rolle i T. cruzi
infektion [20], undersøgte vi, om overflademolekyler blev frigivet ved metacyclic former og påvirket værtscelle invasion.
Metoder
Parasitter og værtscelle invasion assay
Trypanosoma cruzi
stammer fra Trypanosomatid Culture Collection (TCC), Institut for Parasitologi, Universidade de São Paulo, blev venligst stillet til rådighed af Dr. Marta MG Teixeira. De blev isoleret fra chagasic patienter i forskellige geografiske regioner: TCC: 28 (Amazon, Brasil), TCC: 515 (Venezuela), TCC: 588 (Guatemala), TCC: 1522 (Paraíba, Brasil), TCC: 1434 (Amapá, Brasil ). Stammer 28, 515, 588 og 1522 var TCI og stamme 1434, isoleret fra et individ inficeret med den orale vej, var TcIV. Som en kontrol blev CL-stamme (TcVI) anvendt i adskillige eksperimenter. Parasitter blev opretholdt cyklisk i mus og i lever infusion tryptose medium. For at stimulere differentiering, blev parasitter dyrket i én passage i TC100 (Vitrocell, Brasilien) eller Graces medium (Invitrogen) og metacyclic former blev oprenset ved passage gennem DEAE-cellulose-søjle, som beskrevet [21]. HeLa-celler, de humane carcinoma-afledte epitelceller, blev dyrket ved 37 ° C i Dulbeccos minimale essentielle medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), streptomycin (100 ug /ml) og penicillin (100 E /ml) i en befugtet 5% CO 2 atmosfære. Celleinvasion assays blev udført som beskrevet detaljeret andetsteds [22], ved podning oprensede metacyclic trypomastigotes på hver brønd af 24-brønds plader indeholdende 13-mm diameter runde dækglas overtrukket med 1,4 × 10 5 HeLa-celler, enten i DMEM med 10 % FCS (D10) eller i PBS ++ (PBS indeholdende per liter: 140 mg CaCl 2, 400 mg KCI, 100 mg MgCl 2,6H 2O, 100 mg magnesiumsulfat 4.7H 2O, 350 mg NaHCO 3). Efter 1 times inkubering med parasitter, blev dublerede dækglas fikseret i Bouin-opløsning, farvet med Giemsa, og sekventielt dehydreret i acetone, en gradueret række af acetone: xylol (9: 1, 7: 3, 3: 7) og xylol. Antallet af intracellulære parasitter blev talt i alt 250 celler.
Oral infektion
Fem til seks uger gamle BALB /c mus, opdrættet i dyret facilitet på Universidade Federal de São Paulo, blev anvendt. Alle procedurer og eksperimenter tilpasset med reguleringen af ​​den institutionelle Etisk udvalg for dyreforsøg, og undersøgelsen blev godkendt af udvalget (protokol 0234/12). Mus blev inficeret med T. cruzi
metacyclic former ad oral vej (5 x 10 7 parasitter i 0,1 ml PBS per dyr) under anvendelse af 1 ml sprøjte med sondeernæring nål, der blev indsat i dyret munden. Til påvisning af parasitter i maveslimhinden epitel, blev maven på mus inokuleret oralt med metacyclic former opsamlet 4 dage efter infektion, fikseret med 10% neutral formaldehyd i 24 timer. Efter bearbejdning ved gradvis dehydrering i en gradueret række af ethanol, efterfulgt af xylen nedsænkning og indlejring i paraffin, serielle 5 um vævssnit blev skåret og farvet med hematoxylin og eosin. I et andet sæt af eksperimenter blev metacyclic former givet oralt i mus (1 x 10 6 parasitter i 0,1 ml PBS per dyr) og begyndende på dag 10 efter podning, parasitæmi blev overvåget to gange om ugen ved at undersøge 5 pi blodprøver opsamlet fra halen, ved fasekontrastmikroskop. Ved 30 dag efter infektion blev maven, hjerte og lever indsamles og behandles til histologiske præparater, som beskrevet ovenfor.
Assay af parasit migration gennem gastrisk mucin lag
Polycarbonat transwell filtre (3 um porer, 6,5 mm diameter , Costar) blev overtrukket med 50 pi af et præparat indeholdende 10 mg /ml gastrisk mucin i vand. Metacyclic former suspenderet i 600 pi PBS, blev tilsat til bunden af ​​24-brønds plader (1 × 10 7 parasitter /brønd) blev mucin-belagte transwell filtre anbragt på parasit-holdige brønde og 100 pi PBS var tilsat til filterkammeret. Efter 30 minutter og /eller 1 times inkubering ved 37 ° C blev 10 pi prøver indsamlet fra filterkammeret for parasit tælling.
Flowcytometri og indirekte immunofluorescens assays
LIVE metacyclic trypomastigotes (1 × 10 7 ) blev inkuberet på is i 1 time med monoklonalt antistof 3 F6 eller 1G7, instrueret henholdsvis metacyclic trinspecifik overflademolekyle gp82 eller gp90. Derefter blev parasitter fikseret med 4% paraformaldehyd i 20 min. Efter vaskninger i PBS blev parasitter inkuberet med Alexa Fluor 488-konjugeret anti-IgG i 1 time ved stuetemperatur, og antallet af fluorescerende parasitter blev estimeret med en BD AccuriTM C6 Flow Cytometer. Kontrol- parasitter blev inkuberet med kun det sekundære antistof. At visualisere HeLa celle lysosomer, dækglassene med vedhæftende celler blev inkuberet i 1 time ved 37 ° C i D10 eller i PBS ++, eller inkuberet med parasitter i D10 i 1 time. Efter fiksering med 4% p-formaldehyd i PBS i 30 min, blev cellerne behandlet med 50 mM NH 4CL i PBS i 30 minutter og vasket i PBS. Cellerne blev derefter inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med muse-anti-humant LAMP2 fortyndet 1: 8 (v /v) i en PBS-opløsning indeholdende 0,15% gelatine, 0,1% natriumazid og 1% saponin (PGN-Saponin). Efter vaskninger i PBS blev dækglassene inkuberet i 1 time med Alexa Fluor 568-konjugeret anti-muse-IgG (Invitrogen), fortyndet 1: 300 i PGN-Saponin indeholdende 500 ng /ml phalloidin-FITC og 10 ug /m DAPI (4 ', 6'-1-diamino-2-phenylindol dihydrochlorid), efterfulgt af vask i PBS og efterfølgende montering af dækglas i forlænge Gold (Invitrogen). Konfokal billeder blev erhvervet i en Leica TCS SP8 laser-scanning mikroskop (Leica, Tyskland) ved hjælp af en fordybelse olie Plan-Apochromat 63X målsætning (blændetal 1.4). Den serie af billeder fås fra konfokale z-stakke blev bearbejdet og analyseret ved hjælp af Leica LAS AF (Leica, 2012, Tyskland) og Imaris (Bitplane) software.
Udarbejdelse af parasit medium
Metacyclic formularer (10 8) blev inkuberet ved 37 ° C i 1 time i 100 pi komplet D10 medium, næringsstof-berøvet PBS ++ eller PBS. Efter centrifugering blev pelleten kasseret, og supernatanten (konditioneret medium) blev opsamlet. Til anvendelse i celleinvasion assays det konditionerede medium blev fortyndet 1: 100 i D10 eller PBS ++ og for Western blot 10 pi blev indlæst
Produktion og oprensning af rekombinant gp82 protein
rekombinante protein indeholdende. fuld længde T. cruzi
gp82 sekvens (GenBank TM database, adgangsnummer L14824) i ramme med gluthation S-transferase (GST), blev produceret i E. coli
DH5-α og oprenset som detaljerede andetsteds [23].
Statistisk analyse
Students t
test, som implementeret i GraphPad software (version 6.01), blev ansat.
Resultater
Oral infektion af mus med T. cruzi
metacyclic former
evne TCI parasitter til at inficere mus ved oral vej blev undersøgt i et sæt af eksperimenter. Fyrre mus blev separeret i 8 grupper af fem dyr. I et sæt af forsøg, der sigter mod at kontrollere invasionen af ​​gastrisk epitel ved metacyclic trypomastigotes, blev 4 grupper anvendes, og hver gruppe på fem mus modtog en anden parasit-stamme (5 x 10 7 parasitter per dyr). Fire dage efter oral indgivelse blev maven af ​​mus opsamlet og behandlet til histologiske præparater. Et stort antal parasitter blev anvendt i dette tilfælde, fordi i tidligere undersøgelser med TCI-stamme G, i naturen transmissionscyklus, havde vi fundet, at selv med en høj inokulum meget få amastigote reder, som svarer til intracellulært replikerende amastigoter, var påviselige ved 4 dag efter oral infektion. Trods den store inokulum, kunne vi ikke påvise amastigote reder ved mikroskopisk analyse af histologiske snit i maven (tabel 1). Et andet sæt af eksperimenter blev udført for at bestemme, om der var nogen forskel i væv tropisme mellem T. cruzi
stammer. Til det formål blev de resterende 4 grupper anvendes, og hver gruppe på fem mus modtog en anden parasit-stamme (1 × 10 6 parasitter per dyr) og infektionens forløb blev fulgt i 30 dage. Startende på dag 10, blev parasitæmi niveauer overvåges to gange om ugen, og på dag 30 maven, blev hjerte og lever opsamlet til histologisk analyse. I dette tilfælde inokulummet var mindre, fordi vi ræsonnerede, at efter flere runder af celleinvasion og intracellulær replikation, ville amastigote reder kunne detekteres. Parasitæmi kunne ikke påvises i hele observationsperioden men infektionen blev bekræftet i alle grupper ved påvisning af amastigote reder i maven og /eller i hjertet hos mus (tabel 1), men ikke i leveren. Bemærk var at i maven på mus inficeret med stamme 1522 som afledt af en kronisk chagasic patient med slutstadiet af hjertesvigt [24], blev parasitter findes i hjertet, men ikke i maven mens det modsatte gælder for infektion med stamme 28 (tabel 1). Amastigote reder var til stede ved høje numre i maven af ​​nogle mus inficeret med stamme 28 eller 588 (tabel 1), formentlig som følge af flere runder af invasion og intracellulær replikation i det gastriske epitel. Det forhold, at parasitter ikke blev detekteret i muse maven ved 4 dag efter oral administration, men først på et senere tidspunkt, efter intracellulære replikering cyklusser foreslået enten en ineffektiv migration af metacyclic former gennem slimlaget, ineffektiv invasion af target epitelceller og /eller intracellulær parasit multiplikation. Foruden TCI-stammer, undersøgte vi en TcIV stamme, 1434, afledt af en oralt inficeret patient. Amastigote reder, i mindre mængder, blev påvist i 3 mus ved 4. dag efter infektion i de histologiske snit i maven, men parasitter blev ikke fundet i maven eller i hjertet 30 dage efter infektion (tabel 1). Parasitæmi var negativ hele løbet af 30 dage infektion. Positive hemoculture bekræftet infektion med alle stammer. Histologiske præparater blev også undersøgt for tilstedeværelse af inflammatoriske processer. Uanset parasitten stamme, inflammatoriske foci var knap påviselige i maven på dag 4 eller 30 efter infektion, eller i hjertet på dag 30.Table 1 Oral infektion af mus med metacyclic former for T. cruzi
strainsa
T. cruzi
stammen
(oprindelse)
mus
Amastigote reder (antal vævssnit)
mave (Dag 4)

mave (dag 30)
Heart (dag 30)
28
(Brasilien Amazon)
1
0 (20)
0 (20)
0 (20)
2
0 (20)
60 (20)
0 (21)
3 fotos 0 (20)
285 (20)
0 (20)
4
0 (20)
11 (18)
0 (23)
5
0 (20)
NDB
0 (20)
515 Hotel (Venezuela)
1
0 (21)
0 (24)
0 (20)
2
0 (19)
0 (13)
0 (25)
3 fotos 0 (20)
0 (21)
0 (23)
4
0 (20)
45 (11)
0 (21)
5
0 (20)
5 (21)
0 (24)
588 Hotel (Guatemala)
1
0 (09)
31 (19)
10 (21)
2
0 (12)
17 (18)
0 (20)
3
0 (09)
6 (20)
3 (15)
4
0 (12)
87 (19)
0 (19)
5
0 (16)
990 (20)
0 (16)
1522
(Brasilien Nordøst)
1
0 (16)
0 (17)
0 (20)
2
0 (19)
0 (15)
4 (20)
3
0 (20)
0 (17)
0 (20)
4
0 (21)
0 (20)
6 (20)
5
0 (21)
0 (16)
4 (18)
1434
(Brasilien Amazon)
1
5 (40)
0 (18)
0 (20)
2
3 (40)
0 (24)
0 (20)
3
0 (36)
0 (20)
0 (20)
4
0 (35)
0 (20)
0 (21)
5
5 (40)
0 (20)
0 (21)
aMetacyclic former af de angivne parasit stammer blev givet oralt i mus. I et forsøg fik mus 5 × 107 parasitter og 4 dage senere maven blev indsamlet til histologiske præparater. I et andet eksperiment modtog mus 1 × 106 parasitter og 30 dage senere blev maven og hjertet indsamles til histologiske præparater
b ND ikke
bestemt
Migration af T. cruzi
metacyclic former gennem gastrisk mucin lag
Et assay til efterligning parasitten translokation gennem slimlaget i maven blev udført under anvendelse transwell filtre overtrukket med gastrisk mucin, som er den vigtigste makromolekylære komponent af slim. Tidligere undersøgelser havde vist, at TcVI metacyclic former, som effektivt invaderer gastrisk epithel ved oral indgivelse i mus, krydse gastrisk mucin-belagte transwell filter så effektivt som det tomme filter og denne egenskab er associeret med ekspressionen af ​​pepsin-resistente G82 molekyle, der selektivt binder til gastrisk mucin [16, 25]. Gastric mucin-belagte transwell filtre blev placeret på toppen af ​​brønde indeholdende metacyclic former. Efter 30 og 60 minutters inkubation ved 37 ° C blev antallet af parasitter, der nåede det øvre kammer talt. TCI parasitter vises reduceret kapacitet til at migrere gennem den gastriske mucin lag i forhold til stammen CL (TcVI), der tjente som kontrol (fig. 1a), bekræfter, at gastrisk mucin fungerede som en barriere for migration. Metacyclic former for TcIV stamme 1434 gennemkøres mavens mucin-coatede filtre mere effektivt end TCI parasitter, men stadig til lavere takster end CL-stammen (Fig. 1a). Vi undersøgte ekspressionen af ​​gp82 og dens modstandsdygtighed over for pepsin i TCI og TcIV stammer. Metacyclic former blev behandlet i 1 time med 2 mg /ml pepsin i citratopløsning ved pH 3,5, en tilstand, der i udstrakt grad nedbrudt BSA (fig. 1b), og de detergentopløselige ekstrakter blev analyseret ved Western blot, sammen med ubehandlede parasitter, anvendelse af monoklonalt antistof (mAb) 3 F6 rettet mod gp82. Før reaktion med mAb 3 F6 blev lige belastning af parasitten prøver kontrolleret af Ponceau-S-farvning (Yderligere fil 1: Figur S1A). Ekspression af gp82, som blev bevaret intakt efter pepsin behandling, var ens i alle stammer, tilsyneladende ved noget højere niveauer i stamme 1434 end i TCI stammer (fig. 1b). Da dette kan forklare den højere migration kapacitet af stamme 1434 sammenlignede vi gp82 ekspression af denne stamme med den for CL-stamme, der effektivt gennemkøres den gastriske mucin-belagte filter (fig. 1a). Gp82 udtryk var sammenlignelig i 1434 og CL stammer (Yderligere fil 1: Figur S1B øverste panel). Tilstedeværelsen af ​​gp82 molekyler på parasitten overflade blev bekræftet ved flowcytometri analyse (fig. 1c). For yderligere at undersøge, om stammen 1434 udtrykte højere gp82 niveauer end TCI stammer, blev Western blot-analyse gentages ved hjælp af stamme 515 som repræsentant for TCI afstamning. MT prøver af de to stammer, fremstillet i den samme dag og elektroforese i samme SDS-PAGE-gel, viste lignende profil (Yderligere fil 1: Figur S1c). Fra alle disse data og yderligere FACS-analyse af de to stammer, der viser lidt højere gp82 niveauer i stammen 1434 (Yderligere fil 1: Figur S1D), er det ikke muligt at konkludere, at den relative effektivitet af stammen 1434 metacyclic former i at migrere gennem den gastriske mucin lag skyldes den differentielle ekspression af gp82. Som T. cruzi
er kendt for spontant at frigive overflademolekyler [19, 20, 26], parasit-skur molekyler kunne også være ansvarlig for de observerede virkninger. Vi kontrolleret, om gp82 blev udgydt i mediet under 1 time inkubation i PBS, tilstand anvendes i gastrisk mucin migration assay. Western blot analyse af supernatanten efter parasit fjernelse, opnået som beskrevet i metodeafsnittet, afslørede, at stammerne 515 og 1434 kaste betydelige mængder gp82, i modsætning til CL stamme, udgivet gp82 på knap påviselige niveauer, hvorimod gp90 blev kastet i høje niveauer ved stamme 515 og til meget lave niveauer af stammerne 1434 og CL (fig. 1d). Hvis molekylerne differentielt frigivet af stammerne 515, 1434 og CL faktisk interferere med parasitten migration gennem den gastriske mucin pels, ville dette forklare de høje og lave virkningsgrader stammerne CL og 515, henholdsvis, samt den mellemliggende evne udstillet af stamme 1434 (fig. 1a). Et eksperiment for at påvise indflydelsen af ​​frigivet gp90 på stamme 515 migration blev udført ved at anbringe gastriske mucin-belagte transwell filtre oven på brønde indeholdende metacyclic former alene eller blandet med anti-gp90-mAb 5E7, der ikke anerkender levende parasitter eller blandet med ubeslægtet mAb 2C2 rettet til T. cruzi
amastigote molekyle [27]. Efter 30 og 60 minutters inkubation, blev prøver fra filterkammeret tages for parasit tælling. Parasitter blandet med anti-gp90-mAb 5E7, men ikke dem blandet med ubeslægtet mAb 2C2, gennemløbes den gastriske mucin frakke ved højere antal end kontrol parasitter (fig. 1e), hvilket indikerer, at kaste gp90 forstyrrer parasit migration gennem ukendt mekanisme, som ikke involverer binding, forudsat at gp90 ikke binder til gastrisk mucin [28]. Interferens af gp82, som ikke kunne påvises, fordi anti-gp82 mAb 3 F6 binder at leve parasitter, ville være forståeligt, fordi det binder sig til gastrisk mucin. Vi undersøgte også, om gp90 og gp82 forskelligt blev udgivet i neutral og sur pH. Konditioneret medium opnået fra metacyclic former for stamme 515 inkuberet i PBS, pH 7,2, eller i citratpuffer, pH 3,5, blev analyseret ved Western blot. Frigivelse af gp82 var ens på både pH, mens gp90 udgydelse var lavere ved sur pH (Yderligere fil 1: Figur S1B nederste panel). Fig. 1 Migration af gp82-udtrykkende T. cruzi
metacyclic former gennem den gastriske mucin lag. a Transwell filtre overtrukket med gastriske mucin blev anbragt på brønde indeholdende de indikerede parasitstammer. Prøver blev opsamlet fra filterkammeret ved 30 min og 60 min for parasit tælling. Værdier er middelværdierne ± SD af tre uafhængige forsøg. Sammenlignet med CL-stammen, en signifikant lavere migration af TCI stammer (** P
< 0,0005) og TcIV stamme 1434 (* P
< 0,005) blev observeret ved 60 min. b Metacyclic former, ubehandlet (-) eller behandlede (+) med 2 mg /ml pepsin ved pH 3,5, blev analyseret ved Western blot under anvendelse af mAb 3 F6 rettet mod gp82. Som kontrol med pepsinaktivitet er BSA farvet med Coomassie blue viste. c Levende parasitter blev inkuberet på is i 1 time, i fravær eller i nærvær af mAb 3 F6. Efter fiksering blev de parasitter inkuberet med Alexa Fluor 488-konjugeret anti-IgG og antallet af fluorescerende parasitter blev estimeret. d Parasitter blev inkuberet i 1 time i PBS. Efter centrifugering for at fjerne parasitter, blev betinget PBS analyseret ved Western blotting hjælp mAb 3 F6 og mAb 5E7, dirigeret til gp82 og gp90 hhv. e Transwell filtre overtrukket med gastriske mucin blev anbragt på brønde indeholdende metacyclic former for stamme 515 alene, eller i nærvær af anti-gp90-mAb 5E7, der ikke anerkender levende parasitter eller ubeslægtet mAb 2C2. Efter 30 og 60 minutters inkubation, blev prøver fra filterkammeret tages for parasit tælling. Værdier er middel ± variation af dubletter
Host celle invasion af T. cruzi
metacyclic former
Reduceret kapacitet metacyclic former i invaderende gastrisk epitel efter oral administration i mus har været forbundet med udtryk for pepsin-resistent gp90 på et højt niveau, og korrelerer med dårlig infektivitet mod dyrkede humane epitelceller [14, 15]. Vi undersøgte evne TCI og TcIV metacyclic former at indtaste værtsceller. Parasitter blev inkuberet med HeLa-celler i 1 time i fuld næringsstof DMEM og antal intracellulære parasitter blev talt. Lav invasion kapacitet var et fælles træk ved alle stammer, TcIV stamme 1434-stamme som udviser højere effektivitet end TCI-stammer (fig. 2a). Western blot analyse under anvendelse af monoklonalt antistof rettet mod gp90, viste, at alle parasitter udtrykte pepsin-resistent gp90 (Fig. 2b). Tilstedeværelsen af ​​gp90 på parasit overflade blev kontrolleret ved flowcytometri analyse i stammer 515 og 1434. I gentagne analyser ved hjælp af forskellige parasit prøver blev gp90 fundet ved meget lavere niveauer i stamme 1434 (fig 2c, Yderligere fil 1:. Figur S1E). Vi forventede en højere celleinvasion kapacitet af stamme 1434 fordi den observerede profil gp90 er svarende til den i CL-stamme metacyclic former (Yderligere fil 1: Figur S1B øverste felt), som ikke genkendes af anti-gp90 monoklonale antistoffer (mAb'er), gp90 er påviselig i detergentekstrakt ved Western blot. Fig. 2 Værtscelle invasion ved gp90-udtrykkende T. cruzi
metacyclic former. en HeLa-celler blev inkuberet i 1 time med de angivne parasitstammer i fuld næringsstof DMEM. Efter fiksering og Giemsa-farvning, blev antallet af intracellulære parasitter talt i alt 250 celler. Værdier er middelværdierne ± SD af fire uafhængige assays udført in duplo. Sammenlignet med CL-stammen, en signifikant lavere invasion af stammer 28, 588 og 1522 (*** P
< 0,0005), stamme 515 (** P
< 0,001) og stamme 1434 (* P
< 0,005) blev opdaget af Student t
test. b Metacyclic former, ubehandlet (-) eller behandlede (+) med 2 mg /ml pepsin ved pH 3,5, blev analyseret ved Western blot under anvendelse af anti-gp90-mAb 1G7. Som kontrol med pepsinaktivitet er BSA farvet med Coomassie blue viste. c Levende parasitter blev inkuberet på is i 1 time i fravær eller i nærvær af mAb 1G7. Efter fiksering blev de parasitter inkuberet med Alexa Fluor 488-konjugeret anti-IgG og antallet af fluorescerende parasitter blev anslået
Effekt af overflademolekyler frigivet af T. cruzi
metacyclic former i værtscelle invasion
bestemte vi hvorvidt gp82 og gp90 blev kastet ind i mediet under 1 times inkubering i komplet D10, dvs. under betingelser, der anvendes i celleinvasion assay. Western blot analyse af det konditionerede medium, fremstillet som beskrevet i afsnittet metoder, afslørede, at gp90 blev udgydt på højeste niveau ved belastning 515 og på de laveste niveauer ved stammen CL, mens gp82 frigivelse af stammer 515 og 1434 var klart visualiseret men var næppe påviselig i CL-stamme supernatant (fig. 3a). Dernæst testede vi muligheden for, at den invasive kapacitet metacyclic former var påvirket af gp90 frigivet i mediet. CL-stamme metacyclic former blev inkuberet i 1 time med HeLa-celler i alene eller i D10 plus 1% af konditioneret medium af 515 stamme D10 medium, præinkuberet eller ikke med anti-gp90 mAb 1G7 eller med ubeslægtet mAb 2C2. CL-stamme blev anvendt på grund af sin celle højere invasion kapacitet og manglende reaktion med mAb 1G7. Som vist i fig. 3b, konditioneret medium væsentligt reduceret parasit invasion, dets hæmmende aktivitet blev det meste neutraliseret af anti-gp90 mAb 1G7 men ikke af uafhængige mAb 2C2. Det antages, at gp82 til stede i konditioneret medium også bidraget til den observerede inhibitoriske virkning, men dette var vanskeligt at påvise, fordi anti-gp82-mAb, som genkender ikke levende parasitter er ikke tilgængelig. I HeLa celler inkuberet i D10 i 30 min med metacyclic former for stamme 515 eller 1434, var der nogle spredning af lysosomer (fig. 3c), der kan skyldes interaktion med gp82 frigivet til medium. Det rekombinante gp82 protein er blevet vist at inducere lysosomer spredning til cellens periferi [29], og begivenhed der kulminerer i exocytose og bidrager til parasitophore vacuole dannelse kræves for T. cruzi
invasion [30-32]. Fig. 3 Virkning af gp90 udgivet af T. cruzi
metacyclic former i værtscelle invasion. Fig. Som vist i fig. Fig. Alle forfattere læst og godkendt den endelige version af manuskriptet.

• Systematisk gennemgang og meta-analyse af laparoskopisk og åben gastrektomi til avanceret gastrisk kræft
• Serum CD26-niveauer i patienter med gastrisk cancer: en hidtil ukendt potentiel diagnostisk markør