Šeimininko ląstelė invazija ir burnos infekcijos Trypanosoma cruzi padermių genetiniai grupes TCI ir TCIV iš chagasic pacientams

Šeimininko ląstelė invazija ir burnos infekcijos Trypanosoma cruzi pervežimas padermių genetiniai grupes TCI ir TCIV iš chagasic pacientų
tezės
Background pervežimas protrūkių ūmaus Chagas ligos pagal burnos infekcija buvo pranešta dažnai per pastaruosius dešimt metų su didesniu šiaurinėje Pietų Amerikos, kur Trypanosoma cruzi
lineage TCI dominuoja, yra atsakinga už pagrindinių priežasčių atgimstančios žmonių ligų, ir mažas procentas, kaip nustatyta, TCIV. Mechanizmai burnos infekcijos ir priimančiosios ląstelių invazija šių parazitų yra sunkiai suprantamas. Siekdama spręsti šį klausimą, mes analizavo T. cruzi
padermių, išskirtų iš chagasic pacientų Venesuela, Gvatemala ir Brazilijoje.
Metodai
Trypanosoma cruzi
metacyclic trypomastigotes buvo žodžiu pasėta į pelių. Surinkta keturių dienų pelės skrandžio, taip pat skrandžio ir surinkta 30 dienų po infekcijos širdies, buvo apdoroti histologinei analizės. Tyrimai imituoti parazitas migracija per skrandžio gleivių sluoksniu buvo atlikti skaičiuojant parazitų, kad vedama skrandžio mucino dengtos transwell filtrai. Mobilusis invazija tyrimai, žmogaus epitelio HeLa ląstelės inkubuojamos su metacyclic formų ir buvo skaičiuojami iš internacionalizuo parazitų skaičius.
Rezultatai
Visi TCI ir TCIV T. cruzi
padermių buvo prastai neužkrečiamas per burną. Parazitai buvo arba neaptinkamas, arba buvo aptikta nedidelių numerių pelės skrandžio keturias dienas rašyti burną. Atkartojantis parazitų buvo rasta skrandžio ir /arba širdies 30 dienų po užsikrėtimo. Palyginti su TCI linijos, migracijos talpa TCIV parazitai per skrandžio muciną dengtos filtru buvo didesnis, bet mažesnis nei eksponuojami TcVI metacyclic formų anksčiau įrodyta, kad būti labai užkrečianti per burną. Išraiška pepsino atsparus gp90, paviršiaus molekulė, kuri downregulates ląstelių invaziją, buvo didesnis TCI nei TCIV parazitų ir, atitinkamai, invazija talpa TCIV metacyclic formų buvo didesnis. Gp90 molekulės spontaniškai išleistas TCI metacyclic formų slopina parazito atvykti į šeimininko ląsteles. TCI parazitai eksponuojami mažą ląstelėje replikacijos norma.
Išvadas
Mūsų išvados rodo, kad prasta talpa TCI linijos, ir mažesniu laipsniu TCIV parazitams, visų užplūsta skrandžio epitelį išgertas infekcijos pelių gali būti susijęs su neefektyvumo iš metacyclic formų, visų pirma apie TCI parazitų, migruoti per skrandžio gleivių sluoksniu, įsiveržti į tikslines epitelio ląsteles ir atkartoti ląstelėse.
Raktiniai žodžiai
Trypanosoma cruzi
TCI ir TCIV linijas Metacyclic trypomastigotes Oralinis infekcija ląstelė-šeimininkė invazija faktai
infekcijos rezultatus pagal Trypanosoma cruzi
, kad Chagas ligos sukėlėjas gali labai skirtis: 20-30% lėtinėmis infekuotiems pacientams, kuriems pasireiškia sunkus miokarditas, pakitimai virškinimo trakto (megaesophagus ir /arba didele gaubtine žarna) pasitaiko rečiau, o dauguma lieka besimptomė gyvenime. Genetinė fono ir imunologinę būklę, priimančiosios taip pat iš parazito populiacijos heterogeniškumas gali prisidėti prie šios įvairovės [1] ir galbūt infekcijos maršrutu ir infekcinė dozė. Pagal nusistovėjusią 2009 vidurūšinei nomenklatūros T. cruzi
padermių skirstomi į šešias atskiras spausdinimo vienetų (DTUs), TCI-TcVI [2]. Tose šalyse į šiaurę nuo Pietų Amerikos ir Amazonės regione, kur megaesophagus ir didelė gaubtinė žarna yra reti ir chagasic kardiomiopatija yra įprastas, TCI yra dominuojantis agentas Chagas liga, priešingai TcII, kuri buvo izoliuota nuo Daugumai pacientų Brazilijos Vidurio Rytų regione kur T. cruzi
infekcijos paprastai yra susijusi su mega sindromų [1, 3]. TCI buvo nurodyta kaip pagrindinė priežastis atgimstančios žmonių ligų šiaurinėje Pietų Amerikos, remiantis genotipo už geografinės paskirstymo mažajame rezoliucijos, naudojant didelį skydą Polimorfinių mikrosatelitinių žymenų [4]. Pastaraisiais metais protrūkiai ūmių Chagas ligos pagal burnos infekcija buvo pranešta Venesuelos [5, 6], Kolumbija [7, 8] ir Brazilijos Amazonės [9, 10], kur TCI yra paplitęs ir nedidelis procentas buvo nustatyti kaip TCIV.
Metacyclic trypomastigotes yra susijęs pirmiau nurodytais atvejais burnos T. cruzi pervežimas infekcijos. Remiantis amastigote lizdų buvimas per skyriuose skrandžio gleivinės, tačiau jokių įrodymų dėl T. cruzi pervežimas invazijos per burnos ir ryklės ar stemplės ir oraliniu būdu vabzdžių gautas metacyclic formų gyvūnai, skrandžio gleivinės epitelio invazija buvo pasiūlyta būti unikalus portalas atvykti sisteminio T. cruzi pervežimas infekcijos [11]. Eksperimentai su TcII ir TcVI padermių iš chagasic pacientų parodė, kad metacyclic sceniniai-savitasis paviršius molekulės gp82 ir gp90, kurie veikia kaip rengėjo ir inhibitorius tikslinės ląstelių invaziją, atitinkamai [12, 13], vaidina pagrindinį vaidmenį burnos infekcijos [14, 15]. Gp82, kuris selektyviai jungiasi su skrandžio muciną [16] yra labai užkonservuoti tarp genetiškai skirtingos T. cruzi
linijų [17] ir pagal pepsino rūgštaus pH atsparus virškinimo, o gp90 izoformų su diferencialu jautrumo pepsinė virškinimą gali būti išreikštas skirtingų kamienų taip, kad didelės arba mažos infekciškumo per burną yra susijęs su pepsino-jautrūs arba pepsino-atsparus gp90 izoformos [14, 15] išraiška. Ar toks gp90 išraiškos ir burnos užkrečiamumo įvairovė taip pat nustatė, TCI ir TCIV DTUs dar turi būti ištirta. Nėra informacijos apie eksperimentinę burnos infekcijos šių parazitų, turimi duomenys yra susiję su pelėmis švirkščiamas su kraujo trypomastigotes ar metacyclic formas į pilvaplėvės ertmę maršrutu [18], kuris yra nenatūralus būdas infekcijos. Čia mes analizuojami metacyclic trypomastigotes iš TCI ir TCIV padermių, išskirtų iš chagasic pacientų įvairiuose geografiniuose regionuose, dėl gp82 ir gp90 išraiška, gebėjimas migruoti per skrandžio muciną sluoksniu ir įsiveržti į skrandžio gleivinės epitelis nuo Išgertas į pelių. Norint patikslinti parazitų invazijos mechanizmus, in vitro
buvo atlikta ląstelių invazija tyrimai, naudojant žmogaus epitelio ląsteles. Kaip paviršiniai antigenai spontaniškai mesti iš audinių kultūroje gautas trypomastigotes [19] buvo pranešta, kad vaidinti vaidmenį T. cruzi
infekcijos [20], mes nagrinėjo, ar paviršiaus molekulės buvo išleistas metacyclic formų ir įtakos šeimininko ląstelių invaziją.
metodų
Parazitai ir ląstelė-šeimininkė invazija tyrimas
Trypanosoma cruzi
padermės iš Trypanosomatid kultūros kolekcijos (TCC), departamento parazitologijos, Universidade de São Paulo, buvo maloniai pateikė dr Marta MG Teixeira. Jie buvo izoliuoti nuo chagasic pacientų įvairiuose geografiniuose regionuose: TCC: 28 ( "Amazon", Brazilija), TCC: 515 (Venesuela), TCC: 588 (Gvatemala), TCC: 1522 (Paraíba Brasil) TCC: 1434 (Amapa, Brazilija ). Padermių, 28, 515, 588 ir 1522 buvo TCI ir įtampą 1434, išskirtos iš individo užsikrėtę per burną, buvo TCIV. Kaip kontrolės, CL padermė (TcVI) buvo naudojamas keliais eksperimentams. Parazitai išliko cikliškai pelėms ir kepenų infuzijos Triptozė terpėje. Skatinti diferenciaciją, parazitai buvo auginami vieno ištrauka TC100 (Vitrocell, Brazilija) ar Grace terpe (Invitrogen) ir metacyclic formos buvo gryninamas plaukimo DEAE-celiuliozės skiltyje, kaip aprašyta [21]. HeLa ląstelės, žmogaus karcinomos gautas epitelinės ląstelės, buvo auginamos 37 ° C temperatūroje, Dulbecco Minimali pagrindinė terpė (DMEM), po to papildomai su 10% vaisiaus serumas iš veršiuko (FCS), streptomicino (100 mikrogramų /ml) ir penicilino V (100 V /ml) temperatūroje drėgnoje 5% CO 2 atmosferoje. Mobilusis invazija tyrimai buvo atliekami kaip nurodyta kitur [22], kurį sėja išgrynintas metacyclic trypomastigotes ant kiekvieno 24 duobučių lėkštelėse, turinčiose 13 mm skersmens apvalių stiklinių coverslips gerai pasidengtų 1,4 × 10 5 HeLa ląstelės, arba DMEM su 10 % FCS (D10), arba PBS ++ (PBS su už litrą: 140 mg CaCl 2 400 mg KCl 100 mg MgCl 2.6H 2O 100 mg MgSO 4.7H 2O, 350 mg NaHCO 3). Po 1 h inkubacijos su parazitais, dublikato coverslips buvo nustatytos BOUIN tirpalu, tamsintas su Giemsa ir nuosekliai dehidratuoti acetone, laipsniško serijos acetonu: ksilolas (9: 1, 7: 3, 3: 7), o ksilolas. Iš ląstelėje parazitų skaičius buvo skaičiuojamas 250 ląstelių viso.
Burnos infekcija
penkių iki šešių savaičių amžiaus Patelė BALB /c pelių, veisiami gyvūnų įrenginys, Universidade Federacinės de São Paulo, buvo naudojamas. Visos procedūros ir eksperimentai atitiko institucinės etikos komiteto eksperimentų su gyvūnais reglamentą, ir tyrimas buvo patvirtintas komiteto (protokolas Nr 0234/12). Pelės buvo užsikrėtę T. cruzi pervežimas metacyclic formų per burną (5 × 10 7 parazitų 0,1 ml PBS vienam gyvūnui), naudojant 1 ml švirkštą su įvedant pro skrandžio zondą adata, kuri buvo įdėta į gyvūnų burnoje. Aptikti parazitų skrandžio gleivinės epitelio, pelių inokuliacija žodžiu su metacyclic formų skrandžio buvo surinkti 4 dienas po infekcijos, fiksuoto su 10% neutralaus formaldehido už 24 h. Po apdorojimo palaipsniui dehidratacijos diferencijuotai serijos etanolio tirpalu, po to ksilenas pakrovimas ir įdėjimas į parafino, serijos 5 mkm audinio skyriai buvo supjaustyti ir tamsintas hematoksilinu ir eozinu. Kitoje eksperimentų rinkinys, buvo suteikta metacyclic formos žodžiu į peles (1 × 10 6 parazitų 0,1 ml PBS vienam gyvūnui) ir pradedant 10 diena po suleistas, parasitemia buvo stebimas du kartus per savaitę nagrinėjant 5 iL kraujo mėginius surinkti iš uodegos, tuo fazių kontrasto mikroskopu. 30 dieną po užsikrėtimo, skrandžio, širdies ir kepenų buvo surinkti ir tvarkomi histologinių preparatų, kaip aprašyta aukščiau.
Analizės nuo parazitų migracijos per skrandžio muciną sluoksnio
Polikarbonato transwell filtrai (3 mkm poras, 6,5 mm skersmens; , Costar) buvo padengtos 50 pL preparato, turinčio 10 mg /ml skrandžio mucino į vandenį. Metacyclic formos, suspenduotos 600 iL PBS buvo įtraukta į 24-duobučių lėkštelėse (1 × 10 7 parazitai /duobutėje), kad mucino dengtos transwell filtrai buvo dedamas parazitų, kurių sudėtyje yra šulinių ir 100 mikrol PBS buvo apačioje įtraukta į filtro kamerą. Po 30 min ir /arba 1 h inkubacijos 37 ° C, 10 iL mėginiai buvo imami iš filtro kamerą parazitų skaičių.
Tėkmės citometrijos ir netiesioginės imunofluorescencines tyrimai
Live metacyclic trypomastigotes (1 × 10 7 ) buvo inkubuojami ant ledo 1 h su monokloninis antikūnas 3 F6 arba 1G7, atitinkamai nukreiptas į metacyclic stadijos-specifinis paviršiaus molekulės gp82 arba gp90. Po to, šių parazitų buvo nustatyti su 4% para-formaldehido 20 min. Po skalbimų PBS, parazitai buvo inkubuojami Alexa Fluor 488-konjuguoto anti-IgG 1 val kambario temperatūroje ir fluorescencinės parazitų skaičius buvo įvertintas su BD AccuriTM C6 tėkmės citometre. Kenkėjams buvo inkubuojamos su tik antriniais antikūnais. Vizualizuoti HeLa ląstelių lizosomų, coverslips su prisitvirtinę ląstelės buvo inkubuojami 1 h 37 ° C temperatūroje, D10 arba PBS ++, arba buvo inkubuojamos su parazitų D10 1 h. Po to, kai fiksavimo su 4% p-formaldehido PBS 30 min, ląstelės buvo gydomi 50 mM NH 4Cl PBS 30 min ir išplautos PBS. Po to ląstelės buvo inkubuojami 1 h kambario temperatūroje su pelės anti-žmogaus LAMP2 atskiestų 1: 8 (v /v) PBS "tirpalo, kuriame yra 0,15% želatinos, 0,1% natrio azido ir 1% saponinų (PGN-saponino). Po skalbimų PBS, kad coverslips buvo inkubuojami 1 h Alexa Fluor 568-konjuguoto anti-pelės IgG (Invitrogen), santykiu 1: 300 PGN-Saponinas, kurių sudėtyje yra 500 ng /ml faloidinas-FITC ir 10 g /m DAPI (4 ", 6'-1-diamino-2-fenilindolo dihidrochlorido), o po to plauna ir PBS ir po to montavimui coverslips į PRAILGINA auksas (Invitrogen). Confocal vaizdai buvo įsigytas "Leica TKS SP8 lazeriu skenavimo mikroskopu (Leica, Vokietija), naudojant alyvai planas-Apochromat 63X tikslas (skaitmeninė apertūra 1,4). Vaizdų serija gauti iš confocal Z-kaminai buvo apdoroti ir analizuojami naudojant Leica LAS AF (Leica, 2012, Vokietija) ir Imaris (Bitplane) programinę įrangą.
Paruošimas parazitų sąlygoja vidutinio pervežimas Metacyclic formų (10 8) buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje 1 valandą, o iš 100 pL pilnas D10 terpė, maistinių medžiagų-netenka PBS ++ arba PBS. Po centrifugavimo, granulių buvo išmetami ir supernatantas (kondicionieriumi vidutinės) buvo surinkti. NAUDOTI ląstelių invaziją tyrimai sąlyginis vidutinio buvo skiedžiamas 1: 100 į D10 arba PBS ++ ir Vakarų dėmė 10 mikrol buvo pakrautas gamyba ir valymo rekombinantinio gp82 baltymų
rekombinantinis baltymas, kuriame yra. pilnametražis T. cruzi
gp82 seka (GenBank TM duomenų bazės prisijungimas skaičius L14824) į rėmo gluthatione S-transferazės (GST), buvo pagaminta E. coli pervežimas DH5-alfa ir išgrynintas kaip išsamius kitur [23].
Statistinė analizė Viesbutis The Stjudento t pervežimas bandymu, kaip įgyvendinamas GraphPad programinė įranga (versija 6,01), dirbo.
rezultatai
Oralinis infekcija pelių su T. cruzi
metacyclic formos
iš TCI parazitų mikroorganizmo gebėjimo užkrėsti peles per burną buvo nagrinėjamas eksperimentų rinkinys. Keturiasdešimt pelių buvo atskirtos viena nuo 8 grupes po penkis gyvūnus. Vienu rinkinį eksperimentus, kuriais siekiama patikrinti skrandžio epitelio invazija metacyclic trypomastigotes, 4 grupės buvo naudojami ir kiekvienas iš penkių pelių grupė gavo kitą parazitų padermės (5 × 10 7 parazitai vienam gyvūnui). Keturias dienas po to, kai per burną, pelių skrandžio buvo surinkti ir apdoroti histologinei preparatų. Daug parazitų buvo naudojamas šiuo atveju, nes ankstesniuose tyrimuose su TCI padermės G, nuo laukinių perdavimo ciklą, mes nustatėme, kad net ir su aukštos užkratas labai mažai amastigote lizdai, kurie atitinka intracellulary atkartojantis amastigotes, buvo aptikti 4 dieną po burnos infekcija. Nepaisant didelio sėjimo kultūra, mes negalėjome aptikti amastigote lizdus, ​​mikroskopu analizuojant histologinių skyriuose skrandį (1 lentelė). buvo atliktas Kita eksperimentų serija, siekiant nustatyti, ar yra kokių nors audinių tropizmą tarp T. cruzi pervežimas padermių skirtumas. Šiam tikslui, likę 4 grupės buvo naudojami ir kiekvienas iš penkių pelių grupė gavo kitą parazitas įtampą (1 × 10 6 parazitų iš vieno gyvūno) ir infekcijos eiga buvo stebimi 30 dienų. Pradedant nuo 10 dieną, kad parasitemia lygiai buvo stebėti du kartus per savaitę, ir 30 dieną skrandžio, širdies ir kepenų buvo surinkti histologinei analizės. Šiuo atveju užkratas buvo mažesnis, nes mes argumentavo, kad po kelių raundų ląstelių invazija ir ląstelėje replikacija, amastigote lizdai būtų pastebimi. Parasitemia buvo neaptinkamas per visą stebėjimo laikotarpį bet infekcija buvo patvirtinta visose grupėse pagal aptiktą amastigote lizdų į skrandį ir /arba pelių (1 lentelė) širdyje, bet ne kepenyse. Paminėti buvo ta, kad infekuotų su įtempimo 1522 pelių skrandžio, kuris išvestas iš lėtinio chagasic pacientui, sergančiam paskutinės stadijos širdies nepakankamumo [24], parazitų buvo rasta širdies, bet ne į skrandį kadangi priešingoje taikoma infekcijos štamo 28 (1 lentelė). Amastigote lizdai dalyvavo aukštų skaičių kai kurių pelių užsikrėtusių padermės 28 arba 588 (1 lentelė), skrandžio, matyt iš kelių raundų invazija ir ląstelėje replikacijos skrandžio epitelį. Tas faktas, kad parazitai nebuvo aptikta pelės skrandžio 4 dieną išgertas bet tik vėliau laiko taške, po ląstelėje replikacijos ciklų, pasiūlė arba neveiksmingą migracijos metacyclic formų per gleivių sluoksniu, neefektyvaus invazijos į tikslinių epitelio ląstelių ir /arba viduląstelinis parazitas daugyba. Be TCI padermių, mes išnagrinėjo vieną TCIV įtampą, 1434, paimtas iš žodžiu infekuotus pacientus. Amastigote lizdai, nedideliais kiekiais, buvo aptikta 3 pelių 4 dienų po infekcijos histologinių sekcijų, skrandžio, bet parazitų nebuvo rasta skrandžio arba širdies 30 dienų po to, kai infekcija (1 lentelė). Parasitemia buvo neigiamas per visą 30 dienų infekcijos metu. Teigiamas hemoculture patvirtino infekcija visų atmainų. Taip pat buvo išnagrinėti histologiniai preparatai uždegiminių procesų buvimą. Nepriklausomai nuo parazitų padermės, uždegimo židiniai buvo vos aptinkamas skrandžio 4 dieną arba 30 po užsikrėtimo, arba širdį dieną 30.Table 1 žodžiu infekcijos pelių su metacyclic formų T. cruzi
strainsa
T. cruzi
padermės
(kilmės)
Pelės
Amastigote lizdai (numeris audinių skyriuose)
Skrandis (4 diena)

Skrandžio (30 diena)
Širdies (30 diena)
28
(Brazilija Amazon ")
1
0 (20)
0 (20)
0 (20)
2
0 (20)
60 (20)
0 (21)
3
0 (20)
285 (20)
0 (20)
4
0 (20)
11 (18)
0 (23)
5
0 (20)
NDB
0
(20)
515 (Venesuela)
1
0 (21)
0 (24)
0 (20)
2
0 (19)
0 (13)
0 (25)
3
0 (20)
0 (21)
0 (23)
4
0 (20)
45 (11)
0 (21)
5
0 (20)
5 (21)
0 (24)
588
(Gvatemala)
1
0 (09)
31 (19)
10 (21)
2
0 (12)
0 (20) 17 (18)
3
0 (09)
6 (20)
3 (15)
4
0 (12)
87 (19) 0 (19)
5
0 (16)
990 (20)
0 (16)
1522
(Brazilija Šiaurės)
1
0 (16)
0 (17)
0 (20)
2
0 (19)
0 (15)
4 (20)
3
0 (20)
0 (17)
0 (20)
4
0 (21)
0 (20)
6 (20)
5
0 (21)
0 (16)
4 (18)
1434
(Brazilija Amazon)
1
5 (40)
0 (18)
0 (20)
2
3 (40)
0 (24)
0 (20)
3
0 (36)
0 (20)
0 (20)
4
0 (35)
0 (20)
0 (21)
5
5 (40)
0 (20)
0 (21)
aMetacyclic buvo suteikta formos nurodytuose parazitų padermių žodžiu į pelių. Viename eksperimente pelės gavo 5 × 107 parazitus ir 4 dienas vėliau skrandis buvo surinktus histologinių preparatų. Kitame eksperimente, gavo pelių 1 × 106 parazitai ir 30 dienų, skrandis ir širdis buvo renkami histologinių preparatų
b ND
nenustatyta
migracijos T. cruzi
metacyclic formų per skrandžio mucino sluoksnis
testas imituoti parazitas translokaciją per gleivių sluoksniu, kad skrandžio buvo atliekama naudojant transwell filtrai padengtas skrandžio muciną, kuri yra pagrindinis stambiamolekulinį sudedamoji dalis gleivių. Ankstesni tyrimai parodė, kad TcVI metacyclic formas, kurios efektyviai įsiveržti skrandžio epitelį Išgertas į pelių, taip pat veiksmingai feed skrandžio mucino dengtos transwell filtrą kaip tuščio filtro ir šis turtas yra susijęs su pepsino atsparus G82 molekulės raiškos kuris selektyviai jungiasi su skrandžio muciną [16, 25]. Skrandžio mucino dengtos transwell filtrai buvo dedamas ant šulinių, kuriuose metacyclic formas. Po to, kai 30 ir 60 min inkubacijos 37 ° C temperatūroje, buvo suskaičiuotos parazitų skaičius, kad pasiekė viršutinę kamerą. TCI parazitai rodomas mažesnės talpos migruoti per skrandžio muciną sluoksniu, palyginti su padermės CL (TcVI), kad tarnavo kaip kontrolės (1a pav.), Patvirtinanti, kad skrandžio mucino veikė kaip migracijos barjerą. Metacyclic formos TCIV padermės 1434 vedama skrandžio mucino dengtos filtrai efektyviau nei TCI parazitų, bet vis dar mažesnėmis palūkanomis negu CL kamieno (pav. 1a). Mes išnagrinėjo gp82 raišką ir jos atsparumą pepsino į TCI ir TCIV padermių. Metacyclic formos buvo gydomi 1 h su 2 mg /ml pepsino citrato tirpalas, kurio pH 3,5, sąlyga, kad plačiai zdegradowanych BSA (Fig. 1b), ir ploviklių tirpių ekstraktai buvo analizuojami Western Blot, kartu su neapdorotų parazitų, naudojant monokloninius antikūnas (mab) 3 F6, nukreiptas į gp82. Prieš reakcijos su mAb 3 F6, lygus pakrovimo parazito mėginių buvo patikrintas Ponso-S dažymo (Papildoma failų 1: S1A pav). Išraiška gp82, kuris buvo išsaugotas nepaliestas po pepsino gydymo, buvo panašus visose padermių, matyt, šiek tiek aukštesnių lygių padermės 1434 negu TCI padermių (pav. 1b). Kaip tai galima paaiškinti didesnį migracijos pajėgumą padermės 1434, mes palyginti gp82 išraišką šio kamieno su ta CL padermės, efektyviai vedama skrandžio mucino dengtos filtrą (pav. 1a). Gp82 išraiška buvo panaši į 1434 ir CL padermių (Papildoma failų 1: S1B pav viršutinis skydelis). Iš gp82 molekulių buvimas parazito paviršiaus buvo patvirtinta tėkmės citometrijos analize (1c pav.). Toliau nagrinėti, ar padermė 1434 išreikšti didesnes gp82 lygį nei TCI padermių, Vakarų dėmė analizė buvo pakartota, naudojant įtampą 515 kaip TCI linijos atstovas. MT mėginiai iš dviejų padermių, paruoštos tą pačią dieną ir elektroforezė toje pačioje SDS-PAGE metodu, parodė, panašaus profilio (papildomas failą 1: S1C pav). Iš visų šių duomenų ir papildomos FACS analizės dviejų kamienų, rodomi šiek tiek didesnes gp82 lygį kamieno 1434 (Papildoma failą 1: S1D paveikslą), neįmanoma daryti išvadą, kad santykinis efektyvumas padermė 1434 metacyclic formų migruoja per skrandžio mucino sluoksnis yra dėl to, diferencinė ekspresija gp82. Kaip T. cruzi
yra žinoma, kad spontaniškai išleisti paviršiaus molekules [19, 20, 26], parazitas-mesti molekulės taip pat galėtų būti atsakingas už pastebėtą poveikį. Mes patikrinome, ar gp82 buvo pralietas į terpę per 1 h inkubacijos PBS, Būklė Naudota skrandžio muciną migracijos tyrimu. Vakarų dėmė analizė po parazitų pašalinimą virš nuosėdų, gaunamas kaip aprašyta metodai skyriuje, atskleidė, kad kamienai 515 ir 1434 barsto nemažai gp82, priešingai CL padermės, kad išleido gp82 ne vos aptikti lygių, o gp90 buvo pralietas ne aukšto lygio iki padermės 515 ir labai žemo lygio pagal padermių 1434 ir KI (. 1d pav). Jei molekulės diferencijuotai išleistas padermių 515, 1434 ir CL iš tiesų trukdyti parazito migracijos per skrandžio muciną kailio, kad būtų galima paaiškinti aukštos ir žemos efektyvumą padermių CL ir 515 atitinkamai, taip pat tarpinis gebėjimą eksponavo iki kamieno (1a pav.) 1434. Eksperimentas įrodyti išleistas gp90 įtaką kamieno 515 migracija buvo atliktas pateikiant skrandžio mucino dengtos transwell filtrai ant šulinių, kurių sudėtyje yra vien metacyclic formas, arba sumaišyti su anti-gp90 mAb 5E7, kad nepripažįsta gyvų parazitų arba sumaišyti su nesusijusiomis mAb 2C2 nukreiptas į T. cruzi pervežimas amastigote molekulės [27]. Po 30 ir 60 min inkubacijos mėginiai iš filtro kameroje buvo imtasi parazitų skaičių. Parazitai sumaišyti su anti-gp90 mAb 5E7, bet ne tiems, sumaišyti su nesusijusia mAb 2C2, vedama skrandžio mucino kailis ne didesni skaičiai, nei kontrolės parazitų (. 1E pav), nurodant, kad mesti gp90 konfliktuoja su parazitais migracijos per nežinomo mechanizmo, kuris neapima privalomas, su sąlyga, kad gp90 nesijungia prie skrandžio muciną [28]. Kišimasis gp82, kurios negalėjo būti įrodytas, nes prieš gp82 mAb 3 F6 jungiasi gyventi parazitų, būtų suprantama, nes jis jungiasi su skrandžio muciną. Mes taip pat išnagrinėjo, ar gp90 ir gp82 buvo diferencijuotai išleistas į neutralią ir rūgštus. Kondicionieriumi vidutinės gauti iš metacyclic formų, įtempimui 515 inkubuoto PBS, pH 7,2, arba į citrato buferio, pH 3,5, buvo analizuojami Western Blot. Išleidimo gp82 buvo panašus tiek pH, o gp90 praliejimo buvo mažesnis rūgštaus pH (Papildoma failų 1: S1B pav mažesnė grupė). Pav. 1 migracija gp82 ekspresija T. cruzi pervežimas metacyclic formų per skrandžio muciną sluoksniu. a Transwell filtrai padengtos skrandžio muciną buvo dedamas ant šulinių, kuriuose yra nurodyta parazitų padermės. Mėginiai buvo imami iš filtro kameroje 30 min ir 60 minučių iki parazito jų skaičių. Vertybės yra priemonė ± SD trijų nepriklausomų eksperimentų. Palyginti su CL padermės, gerokai mažesnę migracijos TCI padermių (** p
< 0,0005) ir TCIV padermė 1434 (* p
< 0,005) buvo stebimas 60 min. b Metacyclic formos, neapdorotas (-) arba apdoroti (+) su 2 mg /ml pepsino, esant pH 3,5, buvo analizuojami Western Blot naudojant mAb 3 F6, nukreiptą į gp82. Kaip kontroliuoti pepsino aktyvumo BSA susitepę Coomassie mėlyna rodomas. c Gyvos parazitų buvo inkubuojami ant ledo 1 h, nesant arba mAb 3 F6 buvimą. Po fiksavimo, parazitai buvo inkubuojami Alexa Fluor 488-konjuguoto anti-IgG ir buvo apskaičiuota iš fluorescencinių parazitų skaičius. d parazitų buvo inkubuojami 1 h PBS. Po centrifugavimo pašalinti parazitus, The kondicionieriai PBS buvo analizuojami imunoblotingo naudojant mAb 3 F6 ir mAb 5E7, nukreiptą atitinkamai gp82 ir gp90. E Transwell filtrai padengtos skrandžio muciną buvo dedamas ant šulinių, kurių sudėtyje yra vien metacyclic formų kamieno 515, arba anti-gp90 mAb 5E7, kad nepripažįsta gyvų parazitų arba nesusijusius mAb 2C2 buvimą. Po 30 ir 60 min inkubacijos mėginiai iš filtro kameroje buvo imtasi parazitų skaičių. Vertybės yra priemonė ± variacijos dublikatų
šeimininko ląstelė invazija T. cruzi pervežimas metacyclic formų
lėtesnės iš metacyclic formų užplūsta skrandžio epitelį nuo Išgertas į pelių buvo susijęs su saviraiškos pepsino atsparus gp90 dideli, ir yra susijęs su prasta užkrečiamumo link išauginti žmogaus epitelio ląstelių [14, 15]. Mes išnagrinėjo TCI ir TCIV metacyclic formų persijungia į šeimininko ląstelių. Parazitai buvo inkubuojami su HeLa 1 h, visiškai maistinių medžiagų DMEM ir buvo skaičiuojamas intraceliulinės parazitų skaičius. Žemas invazija talpa buvo bendras bruožas visi štamai, TCIV padermė 1434 padermės eksponuoti didesnį efektyvumą, nei TCI padermių (pav. 2a). Vakarų dėmė analizė, naudojant monokloniniai antikūnai į gp90, parodė, kad visi parazitai išreiškė pepsino atsparus gp90 (pav 2b.). Iš gp90 buvimas parazitų paviršiaus buvo tikrinami tėkmės citometrijos analizės atmainų 515 ir 1434 Kartotinių tyrimų naudojant skirtingus parazitų mėginius, gp90 buvo rastas gerokai žemesnio lygio kamieno 1434 (pav 2C, Papildoma failų 1. S1E pav). Tikėjomės didesnę ląstelių invazija pajėgumą padermės 1434, nes pastebėtas profilis gp90 yra panašus į CL padermės metacyclic formų (Papildoma failą 1: Pav S1B viršutinis skydelis), kurie nėra pripažįstami anti-gp90 monokloninius antikūnus (MAB), gp90 yra aptinkamas ploviklio ekstrakto Vakarų dėmė. Pav. 2 Ląstelė šeimininkė, įsiveržimas gp90 ekspresija T. cruzi
metacyclic formų. a HeLa ląstelės buvo inkubuojami 1 h, nurodantis, parazitų padermės visiškai maistinių medžiagų DMEM. Po fiksacijos ir Giemsa dažymą, kad ląstelėje parazitų skaičius buvo skaičiuojamas 250 ląstelių viso. Vertybės yra priemonė ± SD keturių nepriklausomų tyrimų atliekama dviem egzemplioriais. Palyginti su CL padermės, gerokai mažesnę invaziją padermių 28, 588 ir 1522 (*** p
< 0,0005), kamienas 515 (** p
< 0,001) ir deformacijų 1434 (* p
< 0,005) buvo aptikta Studentų t pervežimas testą. b Metacyclic formos, neapdorotas (-) arba apdoroti (+) su 2 mg /ml pepsino, esant pH 3,5, buvo analizuojami Western Blot naudojant anti-gp90 mAb 1G7. Kaip kontroliuoti pepsino aktyvumo BSA susitepę Coomassie mėlyna rodomas. c Gyvos parazitų buvo inkubuojami ant ledo 1 valandą, o, nesant arba mAb 1G7 buvimą. Po fiksavimo, parazitai buvo inkubuojami Alexa Fluor 488-konjuguoto anti-IgG ir fluorescencinės parazitų skaičius buvo įvertintas
poveikis paviršinių molekulių išleistas T. cruzi
metacyclic formų ląstelės šeimininkės invazijos
Nustatėme ar gp82 ir gp90 buvo mesti į terpę per 1 h inkubacijos visiškai D10, ty, su sąlyga, naudojami ląstelių invazija tyrimu. Vakarų dėmė analizė sąlygoja vidutinės, paruošto, kaip aprašyta metodai skyriuje, atskleidė, kad gp90 buvo pralietas aukščiausiu lygiu padermės 515 ir žemiausio lygio pagal deformacijų CL, o gp82 išleis padermių 515 ir 1434 buvo aiškiai vizualizuoti, bet buvo vos aptinkamas KI padermės virš nuosėdų (pav. 3a). Be to, mes patikrinome galimybę, kad invazinių metacyclic formų pajėgumai buvo įtakota gp90 išleistas į terpę. KI įtempimo metacyclic formos buvo inkubuojami 1 h su HeLa ląstelių atskirai arba D10 plius 1% apdorotas laikmenoje 515 padermės D10 terpėje anksto inkubuojamas ar ne su anti-gp90 mAb 1G7 arba nesusijusia mAb 2C2. KI padermės buvo naudojamas, nes jo ląstelės didesnės invazijos pajėgumų ir reakcijos su mAb 1G7 trūkumo. Kaip parodyta Fig. 3b, kondicionieriai vidutinio žymiai sumažino parazitas invazija, jos slopina daugiausia buvo neutralizuota anti-gp90 mAb 1G7, bet ne nesusijusiam mAb 2C2. Manoma, kad gp82 esančių apdorotas terpėje taip pat prisidėjo prie pastebėtas slopinančio poveikio, bet tai buvo sunku įrodyti, nes prieš gp82 mAb kad nepripažįsta gyvų parazitų nėra. Be HeLa inkubuojami D10 30 min su metacyclic formų kamieno 515 ar 1434, ten buvo keletas plitimo lizosomas (3c pav.), Kurie gali pasireikšti dėl sąveikos su gp82 išleistas į terpę. Rekombinantinis gp82 baltymai buvo įrodyta, kad sukelti Lizosomos sklaida į mobilųjį periferijoje [29] ir įvykį, kad svarbiausias akcentas egzocitozės būdu ir prisideda už parasitophorous vacuole formavimo reikalingą T. cruzi
invazijos [30-32]. Pav. 3 Poveikis gp90 išleido T. cruzi
metacyclic formų ląstelės šeimininkės invazijos. Pav. Kaip parodyta Fig. Pav. Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinę versiją rankraščio.

• Sisteminė apžvalga ir metaanalizė laparoskopinės ir atviros pašalintas skrandis Progresavusiąi skrandžio cancer
• Serumas CD26 koncentracija pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu: romanas potencialas diagnostikos marker