Aktivirani tarča rapamicina pri sesalcih je potencialna terapevtska tarča želodčnega cancer

aktivira tarča rapamicina pri sesalcih je potencialna terapevtska tarča raka želodca
Abstract
Ozadje
tarča rapamicina pri sesalcih (mTOR) ima ključno vlogo pri celični rasti in homeostaze. Namen našega te študije je raziskati izražanje aktivnega mTOR (p-mTOR) pri bolnikih z rakom želodca, njihovo napovedni pomen in zaviranja učinek RAD001 na rast tumorjev in ugotoviti, ali bi lahko ciljno zaviranje mTOR je potencialna terapevtska strategija za raka želodca.
Metode
izraz p-mTOR so odkrili v vzorcih 181 želodčnega raka in ki so doživeli radikalno resekcijo (kurativna R0), ki jo imunohistokemijo. Korelacija p-mTOR izražanja clinicopathologic funkcij in preživetje raka želodca so proučevali. Ugotovili smo tudi zavirajo učinek RAD001 na rast tumorja z uporabo BGC823 in AGS človeške želodčne rak celičnih linij.
Rezultati
imunskim barvanjem za p-mTOR je bil pozitiven pri 93 181 (51,4%) želodca raka, ki je tesno povezana z limfo stanje vozlišča in stopnja pTNM. Bolniki z p-mTOR pozitiven pokazala preživetje bistveno krajši brez bolezni (DFS) in celokupno preživetje stopnje (OS), kot tistih, ki imajo p-mTOR-negativnimi tumorji v univariablinega analiz, in tam je bil trend v smeri korelacije med p-mTOR izražanja in preživetje v optimuma analiz. RAD001 izrazito zaviral odmerka odvisno proliferacijo človeških želodčnih celic karcinoma ga navzdol regulacijo izražanja p70s6k, p-p70s6k, C-myc, CyclinD1 in Bcl-2, up-regulacijo izražanja p53.
Sklepov
in želodca rak, p-mTOR je potencialna terapevtska tarča in RAD001 bil obetaven sredstvo za obdelavo z indukcijo aretaciji celičnega ciklusa in apoptozo, ki jih skozi regulacijo ekspresije C-myc, CyclinD1 in Bcl-2, up-regulacijo izražanja p53.
Ozadje
želodca karcinom je četrti najpogostejši rak in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka po vsem svetu, vključno z 1 milijona novih primerov na leto po vsem svetu [1]. Okoli 60% novih primerov raka želodca se pojavijo v vzhodni Aziji [2], še posebej na Kitajskem. Kirurška resekcija je najbolj učinkovita pri zdravljenju raka želodca in učinkovitost kemoterapije ostaja omejena [3]. Številne študije so pokazale, da je globina invazije in število metastatskih bezgavk najpomembnejši vplivni napovedujejo preživetja za bolnike želodca z rakom [4, 5]. Na primer, v predhodnih študijah [6, 7], smo ugotovili pozitivno razmerje bezgavk je neodvisen prognostični indikator po D2 resekcijo in intraperitonealnim kemoterapije je lahko koristna za bolnike z rakom želodca. Vendar pa je temeljni korak k izboljšanju rezultatov kliničnih raziskav je v boljšemu razumevanju biološkega vedenja tumorja, ki lahko pomaga identificirati možne tarče za individualno terapijo [8, 9].
V zadnjih letih, molekularno temelji pristope za zdravljenje v rak želodca je bila dana veliko zaskrbljenost. Več člankov so opisane nekatere potencialne molekularnih cilje za zdravljenje pri raku želodca, kot za epidermalni rastni faktor receptor (EGFR) [10-13], vaskularni endotelijski rastni faktor (VEGF) [14], recepteur d'origine NANTAIS (RON) [15 ].
tarča rapamicina pri sesalcih (mTOR) je nova potencialna molekularno cilj za terapijo proti raku. Njegov izraz je bila dokazana v različnih celičnih linijah in tumorskih vzorcev, kot so jetrnih novotvorb [16], raka dojke [17], žolčevodov adenokarcinomom [18], in raka materničnega vratu [19, 20]. Te študije so pokazale, da je bila mTOR izraz povezano s slabo klinično prognozo. Lang et al [21]. so tudi opazili aktivacijo mTOR raka človeške želodčne in vitro in in vivo. Navedli mTOR pogosto aktivira pri raku človeške želodčne. V zadnjem času, peroralno biološko derivat rapamicina, RAD001 (everolimus; Novartis Pharma AG), je bil razvit. Faze III preskušanja pokazala zdravljenje z everolimusom podaljša preživetje brez napredovanja bolezni pri bolnikih z metastatskim karcinomom ledvičnih celic, ki je napredovala na drugih ciljnih terapij [22]. RAD001 je bilo tudi dokazano, da zavira širjenje rast tumorskih celic v nekaterih karcinomov [23, 24]. Toda vloga RAD001 primerov raka celice želodca, ni jasno.
Cilji te študije so bili dodatno analizirati odnose z mTOR izraz z prognoze vrednosti aktivnega mTOR (p-mTOR), učinek RAD001 na rast in celične cikel človeške želodčne rakavih celic in vitro, in ugotoviti, ali je rak želodca dober kandidat za ciljno terapijo z zaviralci mTOR.
Metode
Bolniki študiral
v retrospektivno raziskavo je sestavljalo 181 bolnikih, ki so radikalno resekcijo ( R0) za histološko potrjenega raka želodca iz Cancer Center Sun Yat-sen University med januarjem 1997 in decembrom 2002. Vse bolnike s histološko potrjena adenokarcinom želodca so prestali niti bližnji po delni odstranitvi želodca, distalno po delni odstranitvi želodca ali celotnega želodca. Etično je bila odobritev pridobljena iz Sun Yat-sen University Cancer Center raziskovalne etiko.
Tisti z ustreznim histološko materiala in celotnih kliničnih podatkov so primerni za vključitev. Merila za upravičenost so vključeni tudi histološko potrjeni kurativna R0 resekcijo, ki je bil definiran kot ne makroskopski in mikroskopski preostalega tumorja in pooperativni čas preživetja starih 6 mesecev. Bolniki z oddaljenih zasevkov in rakom želodca panju po resekciji benigne bolezni, so bili izključeni iz študije. Razlog za to je, da je preživetje bolnikov z oddaljenih zasevkov od mnogih drugih dejavnikov, kot predoperativno kemoterapijo ali obstrukcijo pogosto prizadene
Vsi bolniki so imeli spremljanje po operaciji na 6 do 12 mesečnih presledkih.; končni datum spremljanja je bilo decembra 2008. Mediana spremljanje obdobje je bilo 50 (pomeni: 50.66; razponu od 10 do 128) mesecev za vse bolnike, in 74 mesecev (pomeni: 72,80; razpon 27-128) za preživetje. Mediano trajanje spremljanja bolnikov je bila 40 (povprečje: 43.71; razpon 11-125) pri bolnikih, ki so imeli tumorje p-mTOR pozitivnega izražanja in 60,5 mesecev (pomeni: 58.01; razponu od 10 do 128) za negativno izražanja. Preživetje je bila izračunana od datuma diagnoze do dneva smrti ali od zadnjega spremljanja.
Zbiranje vzorcu in imunskim barvanjem za p-mTOR
vseh tumorskih vzorcev so bili pridobljeni s kirurško odstranjenimi želodčnega raka pred adjuvantno terapijo. Formalinu fiksno,-parafin vgrajeni bloki tkiva smo hranili pri sobni temperaturi, označenega z identifikacijsko številko. Pet Lun debela odseki tkiva smo izrezali iz parafinskih blokov, deparaffinized v ksilena in hidracijo. Antigenski iskanje bil obdelan z natrijevim citratom. Drsniki smo nato inkubirali v 0,3% H 2O 2 za 10 min in blokiran 1% goveji serumski albumin za 60 minut, čemur sledi monoklonsko protitelo zajec specifično za p-mTOR (fosfo-mTOR, Ser2448, 49F9; Cell signalizacija Technology) pri 4 ° C čez noč, nato obarvamo z 3,3-diaminobenzidine. Po vizualizacijo radioinkorporacijo, so odseki jih nasprotno s hematoksilinom in nato nameščena.
Ocena Imunohistokemijsko
imunoreaktivnosti odseki so bili ocenjeni in tkiva iz človeških prostate adenokarcinome služil kot pozitivno kontrolo. Glede na nedavno opisane merila za ocenjevanje mTOR izražanja smo obarvanje intenzivnost določeno kot 0 (odsotnega), 1 (šibko) in 2 (močno) in ravni ekspresije biomarkerjev smo semiquantified uporabo rezultat imunohistokemija (razpon, 0-200), izračunan pomnoži intenzivnost obarvanja z odstotkom pozitivnih tumorskih celic [18]. Bolniki z imunohistokemično rezultatom ≤ 20 se je štelo, p-mTOR-negativna in tiste z rezultatom > 20 kot p-mTOR pozitivni. Vsi preparati so neodvisno ocenila dva neodvisna patologi brez poznavanja kliničnih podatkov pacientov. Ko so mnenja dveh ocenjevalcev razlikujejo, je bil dosežen dogovor temeljitem pogovoru
Celične linije in pogoji kultiviranja
človekovih linij želodčni rak celic BGC823 in AGS (ATCC številka: CRL-1739)., Ki so slabo diferenciran bili darila iz Peking University School of Oncology (Peking, PR China.) [25]. Celične linije smo vzdrževali v RPMI 1640 medija (Invitrogen), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (Hyclone), penicilin (100 enot /ml) in streptomicin (100 enot /ml) pri 37 ° C in 5% CO2 v vlažnem inkubatorju .
preživetja celic test
Za analizo vpliva RAD001 o človekovih želodca rakavih celic, je viabilnost celic določena z MTT testom. RAD001 je bil zagotovljen z Novartis Pharma (Basel, Švica). Za upravičenosti testu smo logaritmično rastoče celice stimulirali z različnimi odmerki RAD001 (0, 5, 10, 20 in 40 uM). Na koncu obdobja kulture, 20 xl od tetracolij barvila 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolijevega bromida (MTT) raztopini (Sigma, ZDA) pri 0,2 mg /ml, dodamo v PBS je optična gostota pri 490 nm (OD490) določimo z uporabo bralnik encimski imunski test (ELISA). Povprečne vrednosti so bile izračunane iz trojnih kultur. Analiziranje
celični cikel
Celice so bili zbrani in je določeno v 70% etanolu čez noč pri 4 ° C. Celice smo potem sprali in obarvamo s propidijevim jodidom (PI) (Sigma), 5 ug /ml. Po 30 min pri sobni temperaturi, zaščiteno pred svetlobo, smo celice analizirani z pretočno citometrijo z uporabo Becton Dickinson FACSCAN.
Aneksin V testu
Vzorce speremo s fosfatnim pufrom (PBS) in z uporabo aneksin V-fluorescein izotiocianatom (FITC) in PI barvanja za določanje izpostavljenosti fosfatidilserina na zunanji plazemske membrane. Po inkubaciji 30 minut pri sobni temperaturi, zaščiteno pred svetlobo, smo vzorce količinsko s pretočno citometrijo z uporabo Becton Dickinson FACSCAN.
Reverzno transkripcijo-PCR
Celotna RNA je bila ekstrahirana z metodo TRIzola. RNA smo obratno drugače zapisano uporabo komercialno dostopnim setom (Fermentas, ZDA). Mešanica (25 xl skupaj) za PCR sestavljalo 0,5 ul cDNA, 0.5 U Taq DNA polimerazo, 2.5 xl 10 × PCR pufer, 2,5 mM dNTP mešanice in 50 pM smiselnimi in protismiselnimi primerji vsak. CyclinD1 in C-myc smo analizirali z naslednjimi primerji: CyclinD1 5'GAACAGAAGTGCGAGGAGGAG3 "in nazaj premaz, 5'AGGCGGTAGTAGGACAGGAAG3"; C-myc, 5 'CGAGCTGCTGGGAGGAGACAT3' in 5 'AGCCGCCCACTTTTGACA GG3' aktina. 5'GGCACCCAGCACAATGAA 3 'in 5' TAGAAGCATTTGCGGTGG 3 '
celic lizat in Western analizo blot
Celice smo lizirali v liznem pufru in koncentracija proteina smo določili z metodo Bradfordu barvila (Bio-Rad Laboratories). Enaka količina ekstrakta celic so bili izpostavljeni SDS-PAGE in prenesli na PVDF membrano (Bio-Rad). Zahodni analize blot so bile izvedene z različnimi specifičnimi primarnih protiteles. Protitelesa priznavajo fosfo-p70S6K (Thr389), p70S6K, fosfo-mTOR (Ser2448), bcl-2 in p53 so bili iz signalizacijo med celicami.
Statistični analizira
primarno končno točko naši raziskavi je bilo celotno preživetje (OS). To je bila opredeljena kot obdobje v času med operacijo in smrt. Preživetje brez bolezni (DFS) je bil čas, v času med operacijo in ponovitve ali povezane s tumorjem smrti. Analizirano je bilo, kot sekundarne končne točke. Združenje p-mTOR izražanja z različnimi clinicalopathologic funkcijami smo analizirali s testom hi-kvadrat. Kumulativno preživetje in preživetje brez bolezni so bile ocenjene po metodi Kaplan-Meier. Preskus log-rank je bila uporabljena za oceno statistične značilnosti razlik med krivulj preživetja. Nanesemo Model po Cox sorazmerna nevarnosti (nazaj, postopno) za multivariabilnega analiz dejavnikov, ki so dosegle pomen v univariablinega analizo. Statistična analiza je bila opravljena s pomočjo SPSS programske opreme (različica 13 za Windows; SPSS, Chicago, IL). Razlike v P < 0,05 naj bi bile statistično značilne.
Rezultati
Clinicopathologic lastnosti
skupno 181 bolnikov, so bili vključeni v to študijo. Srednja starost je bila 59 let (razpon 23-83 let). V clinicopathologic značilnosti prebivalstva študije so povzeti v preglednici 1. 129 bolnikov je bilo moških in 52 žensk. 77 181 tumorjev (42,5), so bili iz zgornjega želodca, 74 181 bolnikov (40,9%) so bili iz spodnjega dela trebuha in ostali tumorji so bili iz srednjega in celoto želodcu. 118 od 181 (65,2%) velikost tumorja bolnikov so > 4 cm, in 63 (34,8%) je bilo ≤ 4 cm. V skladu z merili, Svetovne zdravstvene organizacije, je bilo 4 181 tumorjev (2,2%) ter diferencirano, 55 181 tumorjev (30,4%) je bilo zmerno diferenciranih, so 116 slabo diferenciran in 6 so nediferencirani. Pooperativna kirurški fazi je bil razvrščen v skladu z 2002 UICC /AJCC razvrstitev [26] .table 1 Clinicopathologic korelacije p-mTOR izražanja v raka želodca
Dejavniki
Vsi bolniki
No. bolnikov (%)
P

N
= 181 (%)
mTOR negativen
mTOR pozitiven

dobe (y)
0,256
< 60
95 (52,5)
50 (56,8)
45 (48,4)
≥60
86 (47,5)
38 (43,2)
48 (51,6)
Sex
.926
Moški
129 (71,3)
63 (71,6)
66 (71,0)
Moški
52 (28,7)
25 (28,4)
27 (29,0)
stran
0,053
Zgornja
77 (42,5)
33 (37,5)
44 (47,3)
Bližnji
28 ( 15.5)
10 (11,4)
18 (19,4)
nižja
74 (40,9)
43 (48,9)
31 (33,3)
razpršenih
2 ( 1.1)
2 (2.3)
0 (0.0)
Tumor velikost
.172
≤ 4 cm
63 (34,8)
35 (40,0)
28 (30.1)
> 4 cm
118 (65,2)
53 (60,0)
65 (69,9)
vrsto BORRMANN
0,398
v zgodnji fazi
7 (3,9)
6 ( 6.8)
1 (1.1)
sem
4 (2.2)
2 (2.3)
2 (2.1)
II
65 (35,9)
31 ( 35.2)
34 (36,6)
III
101 (55,8)
47 (53,4)
54 (58,1)
IV
4 (2.2)
2 ( 2.3)
2 (2.1)
razvrščanje
0,999
1
4 (2.2)
2 (2.3)
2 (2.1)
2
55 (30,4)
27 (30,7)
28 (30,1)
3
116 (64,1)
56 (63,6)
60 (64,5)
4
6 (3.3)
3 (3.4)
3 razvrstitev (3.3)
patoloških T
0,168
T1
17 (9.4)
12 (13,6)
5 (5.4)
T2
35 (19,3)
18 (20,5)
17 (18,3)
T3
119 (65,7)
55 (62,5)
stanje 64 (68,8)
T4
10 (5.5)
3 (3.4)
7 (7,5)
Patološka N
0,008
N negativna
44 ( 24.3)
29 (33,0)
15 (16,1)
N pozitiven
137 (75,7)
59 (67,0)
78 (83,9)
Patološka faza (pTNM)
0,026
I
26 (14,4)
17 (19,3)
9 (9,7)
II
47 (26,0)
28 (31,8)
19 (20,4)
III
100 (55,2)
41 (46,5)
59 (63,4)
IV
8 (4.4)
2 (2.3)
6 (6,5)
129 181 bolnikov (71,2%) je bilo bolj napredne fazi T bolezni (PT3 + PT4), in 137 bolnikov (75,7%) je limfnega vozla metastaz. Totally pacienti fazi I-IV so bili 26, 47, 100 in 8 primerov oz.
P-mTOR izraz na raka želodca
imunskim barvanjem p-mTOR je cytoplasmatic in delno membranska. Slika 1 prikazuje reprezentativne primere p-mTOR imunskim barvanjem. Normalna sluznica želodca je negativen za p-mTOR. 181 bolnikov je bilo 93 (51,4%) p-mTOR-pozitivnih tumorjev. Slika 1 Primeri p-mTOR imunskim barvanjem. (A) Normalna sluznice želodca je negativen za p-mTOR (originalni povečavi × 200). (B) Normalna sluznice želodca je negativen za p-mTOR (originalni povečavi × 400) (c) Pozitivna izražanja p-mTOR raka želodca (originalni povečavi × 200). (D) Negativni izraz p-mTOR raka želodca (original povečava × 200).
Analizo preživetja
bolnikih z p-mTOR pozitiven rak želodca pokazala bistveno krajši in splošne stopnje preživetja brez bolezni kot tisti z p- mTOR negativni rak želodca (DFS, 48,9% v primerjavi z 30,1%; p = 0,006; OS, 51,1% v primerjavi z 34,4%; p = 0,011; tabela 2, slika 2A, B). Univariablinega analiza je pokazala, da je čas preživetja je zmanjšala tudi z višjo razvrstitev pT (DFS, p = 0,001, OS, P = 0,005), na bezgavkah metastaze (DFS, p < 0,0001, OS, P = 0,001) in napredno pTNM stopnja (DFS, p < 0,001, OS, P = 0,001). Ni bilo nobene povezave med DFS ali OS in starost, spol ali tumorja size.Table 2 univariablinega analiza boleznijo bolezni in celokupno preživetje pri raku želodca


brez bolezni suivival
splošno survival

Characteristic

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

Age(y)
0,343
0,583
< 60
95
1.00
1.00
≥60
86
0,834
0,573-1,214
0,898
0.611-1.320
Sex
. 662
.950
Male
129
1.00
1.00
Moški
52
0,909
0,591-1,396
0,986
0,639-1,521
velikost tumorja
0,151
0,232
≤4 cm
63
1.00
1,00
> 4 cm
118
1.345
0,897-2,016
1,287
0,851-1,945
fazi pT
0,001
0,005
PT1
17
1,00
1.00
pT2
35
1.549
0.558-4.301
.401
1.535
0.553-4.264
.411
pT3
119
3.546
1.437-8.750
.006
3.237
1.310-8.001
.011
pT4
10
4.738
1.547-14.506
.006
4.068
1.289-12.836
.017
pN stage
< 0,0001
0,001
Negative
44
1.00
1.00
Positive
137
2,617
1,538-4,451
2,389
1.401- 4,075
pTNM stage
< 0,0001
0,001
sem
26
1,00
1,00
II
47
2.920
1.197-7.121
.018
2.860
1.173-6.973
.021
III
100
4.955
2.152-11.409
< 0,0001
4455
1,930-10,281
< 0,0001
IV
8
7,369
2,470-21,981
< 0,0001
6,103
1,965-18,957
0,002
P-mTOR
0,008
0,013
Negative
88
1,00
1,00
Pozitivni
93
1.667
1,146-2,454
1,644
1,112-2,430
sliki 2. ocena po Kaplan-Meier verjetnost preživetja. Bolniki z p-mTOR pozitivno pokazala bistveno krajši skupno preživetje (A) in cene od tistih, s p-mTOR negativen izraz za preživetje (B) prosta bolezni. (P = 0,011 in p = 0,006, v tem zaporedju)
V multivariabilnega analizi bezgavko metastaze (DFS, p = 0,018, OS, P = 0,038). In faza pT (DFS, p = 0,018; OS, so pomemben neodvisen napovedni dejavnik za čas preživetja P = 0,046). Poleg tega multivariabilen analiza (tabela 3) je tudi trend v smeri korelacije med p-mTOR izražanja in zmanjšano preživetje, vendar trend ni dosegla statistično značilnost (DFS, p = .059; OS, p = .070) .table 3 multivariatno cox regresijska analiza prostih bolezni in splošnih preživelih


brez bolezni suivival
splošno survival

Factors

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

p-mTOR
0,059
0.070
Negative
88
1.00
1.00
Positive
93
1,452
0,986-2,138
1,443
0,970-2,147
infiltracije globino
0,018
0,046
PT1
17
1.00
1.00
pT2
35
1.050
0.366-3.016
0.928
1.078
0.375-3.101
0.889
pT3
119
2.251
0.867-5.845
0.096
2.146
0.823-5.595
0.118
pT4
10
2.926
0.920-9.305
0.069
2.616
2.616-8.580
0.113
Lymph Stanje vozlišča
0,018
0,038
Negative
44
1.00
1.00
Positive
137
1.981
1,981-3,488
1,828
1,034-3,233
RAD001 zavira proliferacijo in preprečuje p70S6K fosforilacijsko
Da bi raziskali učinke RAD001 na širjenju človekovih želodčni rak celičnih linij BGC823 in AGS, smo izvedli teste orožja z 48-urno izpostavljenost RAD001. Kot rezultat, RAD001 ustvarja pomembno zaviranje na obeh celičnih linij na način, ki je odvisen od odmerka. (Slika 3A). Slika 3 (A) RAD001 inhibira proliferacijo želodčnih rakavih celic. Želodčne rakave celice smo obdelali z označenimi koncentracijami RAD001 v prisotnosti 10% FBS 48 h. sposobnost preživetja celic je bila ocenjena z MTT testom. (B) Fosforilacija p70s6K je bistveno zmanjšal v skladu z odmerkom odvisna tako letnem pregledu rasti in BGC823 celic z zdravljenjem z RAD001. Obe celični liniji smo inkubirali s povečanjem odmerka RAD001 48 ur, je bilo celični lizati podvržemo zahodni blot analizo s fosforiliranih p-S6K in S6K protiteles.
Western Blot eksperimente smo izvedli z RAD001 po 0, 5, 10, 20 uM 48 ur. P70s6 kinaza je pomemben nadaljnji cilj mTOR in njene mTOR odvisna od fosforilacije omogoča prevod ribosomske proteinov. preučila smo status fosforilacijo nadaljnjega ciljne p70s6K s imuno. Kot je prikazano na sliki 3B, smo ugotovili, da zdravljenje obeh celičnih linij BGC823 in AGS z RAD001 bistveno preprečiti fosforilacije p70s6K na način, ki je odvisen od odmerka.
RAD001 inducira aretacijo G0 /G1 celičnega ciklusa in apoptozo v želodcu rakavih celic
če želite ugotoviti, ali je bila odprava v proliferacijo celic zaradi G0 /G1 fazi aretacijo ali apoptozo, distribucija celičnega cikla, smo analizirali s FCM. Slika 4 je pokazala, da zdravljenje BGC823 celic z RAD001 48 ur povzročilo robustno G1 aretaciji in spodbuja apoptozo. Z naraščajočim odmerkom RAD001, več celic ostal v G1 fazi, medtem ko napredovanje celičnega ciklusa v S fazi se je zmanjševala (slika 4A). RT-PCR analiza je pokazala RAD001 v odvisnosti od odmerka zmanjšal nivo mRNA ciklina D1 in C-myc (slika 4B). Slika 4 RAD001 povzroča aretaciji celičnega ciklusa in apoptozo v BGC823 celicah. (A) BGC823 celice so bile izpostavljene različnim koncentracijam RAD001 48 ur. (B) RNA bili pridobljeni iz celic. Ciklin D1 in nivo izražanja C-myc so odkrili s pomočjo RT-PCR, aktina kot kontrole obremenitve. (C) celice inkubiramo 48 ur z označenimi odmerki RAD001 pred barvanjem z aneksina V-FITC. so prikazani odstotki apoptotskih celic. (D) Celice smo inkubirali 48 ur z označenimi odmerkov RAD001. Celice zberemo, lizirali in podvržemo Western blot analizo z Bcl-2 in p53 protiteles. GAPDH smo uporabili kot kontrolo nalaganja.
Aneksin-V testi so pokazali, da RAD001 bistveno inducirano apoptozo v BGC823 celicah. Povečanje stopnjo apoptoze smo analizirali z FCM s povečanjem odmerka (slika 4C). Western analizo blot pokazala RAD001 v odvisnosti od odmerka zmanjšal nivo protein Bcl-2 in večjo stopnjo proteina p53 (slika 4D). Podobni rezultati so bili v AGS celicah opazili (podatki niso prikazani).
Razprava
The tarča rapamicina pri sesalcih (mTOR) je bila odkrita v začetku leta 1990 s pri študiju mehanizma delovanja rapamicina, ki je bila prvotno ugotovljena kot protiglivično sredstvo in je bil kasneje priznan kot lastnosti proti raku [27]. Kot protein kinaze Ser /THR, mTOR igra ključno vlogo pri celični rasti in homeostaze [28]. MTOR protein tvori kompleks z adapterjem beljakovin, mTORC1 (tarča rapamicina pri sesalcih kompleksa 1) in mTORC2. Aktivacija mTORC1 uravnava rast celic s spreminjanjem sintezo beljakovin, ribosoma BIOGENESIS in avtofagija [29]. MTORC2 poti igra ključno vlogo aktiviranja Akt, kot PDK1 (3-fosfoinozitidnih-odvisna proteinska kinaza 1) in PI3K, potencialne tarče drog za raka, v katerem je Akt deregulacija [26].
V sedanji raziskavi, smo ugotovili, da je bilo 93 (51,4%) bolnikov pozitiven izraz p-mTOR pri 181 bolnikih z rakom želodca. V skladu z našim rezultatom, v drugi študiji, vključno s 1072 bolniki, izražanje p-mTOR je 46,5% [30].
Prejšnje študije so poročali o napovedni pomen p-mTOR izražanja. Herberger et al [18]. označene p-mTOR, da je neodvisen napovedni dejavnik za smrt pri bolnikih z biliarni trakt adenokarcinomom. V svoji raziskavi je bilo celotno preživetje bistveno krajši pri bolnikih s p-mTOR pozitivnih tumorjih v primerjavi z bolniki z p-mTOR-negativnimi tumorji (P = 0,004). V raka želodca, Yu et al. oceniti izraz p-mTOR pri 1.072 bolnikih z rakom želodca z uporabo mikromrež tkiva, kar dokazuje čezmernim p-mTOR je neodvisen napovedni dejavnik [30]. Vendar pa je v študiji, so 109 bolnikov z želodčno adenokarcinome ki so doživeli korenito želodca [31], Murayama et al. našel niti citoplazme p-mTOR niti jedrsko p-mTOR je neodvisen napovedni dejavnik, čeprav so označene citoplazme p-mTOR izraz je bila povezana s slabšim preživetjem in povezana z globino tumorske invazije, bezgavke in stopnjo tumorja. V tej raziskavi smo potrdili, da se razvrstitev pT in status bezgavk neodvisni napovedni kazalec kliničnim izidom pri bolnikih z rakom želodca s optimuma analiz. Vendar, ker je pri večini bolnikov prisotne z lokalno napredovalo boleznijo, drugih sekundarnih prognostičnih označevalcev, predvsem p-mTOR, morda uporabe [13]. Naši rezultati jasno kažejo, da je p-mTOR izraz tesno povezan s slabim splošnim in brez bolezni preživetja v univariablinega analiz s trendom v smeri korelacije v optimuma analizah.
V skladu z našo trenutno študijo, so številne študije priznana tudi antiproliferativne učinke inhibitorji mTOR v želodcu rakavih celic. Na primer, Lang et al [21]. označene rapamicin lahko zavira rast želodčne celice raka tako v podkožnem modela tumorja in poskusni model. Njihovi rezultati poudarjajo primernost inhibitorjev mTOR, ki se uporabljajo v antiangiogenim okviru za zdravljenje raka želodca.
Pa RAD001 je nov mTOR zaviralec sredstvom proti raku. Mehanizem o RAD001 na raka želodca, ni jasno. Cejka sod. pokazala antiangiogenskega dejavnost RAD001 v kombinaciji z visokim odmerkom ciklofosfamidom pokazale sinergistično protitumorsko aktivnost proti raku želodca [32]. so prav tako ugotovljeno, da so RAD001 zmanjšano proliferacijo in oslabljen proizvodnjo HIF-1 a, kot tudi VEGF v želodčnih rakavih celic in vitro [33]. V sedanji raziskavi, so naši podatki kažejo, da RAD001-terapija oslabljen fosforilacijo p70S6K in močno zaviral širjenja želodčnih rakavih celic z ustavitev celičnega cikla in apoptozo in vitro. Našli smo RAD001 napeljala G0 /G1 faza za prijetje, ki je bila povezana z zmanjšano ciklin D1 in C-myc. Poleg tega smo pokazali, prvič, da RAD001 kot nov zaviralec mTOR v odvisnosti od odmerka inducirane apoptoze v želodcu rakavih celic, ki ga aneksin V testih. Ta učinek se lahko narekuje mobilnega kontekst in spodnjem toku ciljev, vključno z p53 in Bcl-2. Te ugotovitve bi lahko dodatno pojasnilo učinkovitost RAD001.
Zaključek
Če povzamemo, smo opravili sistematičnega raziskovanja na mTOR raka želodca, kar kaže na odnose izraz z prognoze vrednosti aktivnega mTOR (p-mTOR) in vivo, učinek RAD001 in del mehanizmov v želodčnih rakavih celic in vitro. Naše ugotovitve so pokazali, da bi p-mTOR služi kot potencialno biološko marker za identifikacijo podskupino bolnikov želodca z rakom slabo prognozo. prav tako pokazala, da je bila RAD001 obetaven sredstvo za zdravljenje raka želodca z induciranje aretaciji celičnega ciklusa in apoptozo s navzdol regulacijo ekspresije C-myc, CyclinD1 in Bcl-2, se uravnava izražanje p53. Nadaljnje raziskave so potrebne za pojasnitev vloge aktivacijo mTOR in na koncu predlagati mTOR kot konkreten cilj za terapijo raka želodca
Opomba
Grant podpora:. National visoki tehnologiji in razvoj (863) Podprti Program Kitajska
ugotavlja
da-zhi Xu, Qi-rong Geng prav tako prispevali k temu delu.
deklaracij
Zahvala
je to delo podpirajo državnega visoki tehnologiji in razvoj (863) program za Kitajska. Avtorji cenijo odlično tehnično pomoč Li-hui Wang, Fei-Meng Zheng, Zheng-zhi Zou, Yan Zhang Zi-jie Long.
Avtorji "originalni predloženi datoteke za slike
Spodaj so povezave do prvotni avtorjev prenosov datotek za slike. "Izvirno datoteko na sliki 1 12885_2009_2335_MOESM2_ESM.pdf avtorjev 12885_2009_2335_MOESM1_ESM.pdf avtorjev prvotni datoteki številka 2 12885_2009_2335_MOESM3_ESM.pdf avtorjev prvotne datoteke za sliko 3 12885_2009_2335_MOESM4_ESM.pdf avtorji prvotno datoteko sliki 4 Konkurenčni interesi
Avtorji izjavljajo, da so nimajo konkurenčnih interesov.

• Napovednih učinek etničnosti za želodca in požiralnika raka: izkušnje, ki temeljijo na prebivalstvo v Britanski Kolumbiji v Kanadi
• Identifikacija prognostičnih dejavnikov in kirurške označb za metastatskega raka želodca