alvo de mamíferos activado da rapamicina é um potencial alvo terapêutico em cancer

gástrica activado alvo da rapamicina em mamíferos é um potencial alvo terapêutico no cancro gástrico da arte abstracta
Fundo
O alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) desempenha um papel fundamental na o crescimento celular e a homeostase. O objetivo do nosso estudo é investigar a expressão de mTOR activado (p-mTOR) em pacientes com câncer gástrico, o seu significado prognóstico e do efeito de inibição de RAD001 no crescimento do tumor e para determinar se a inibição específica de mTOR poderia ser uma estratégia terapêutica potencial para o câncer gástrico.
Métodos
A expressão de p-mTOR foi detectada em amostras de 181 tipos de câncer gástrico submetidos à ressecção radical (R0) por imuno-histoquímica. A correlação de expressão p-mTOR às características clínico-patológicas e sobrevida do câncer gástrico foi estudada. Nós também determinado o efeito de inibição da RAD001 sobre o crescimento tumoral utilizando linhas celulares de cancro gástrico humano BGC823 e AGS.

Resultados da imunocoloração para p-mTOR foi positiva em 93 dos 181 (51,4%) cancros gástricos, estreitamente relacionado com a linfa status do nó e estágio pTNM. Os pacientes com p-mTOR positiva mostrou significativamente menor sobrevida livre de doença (DFS) e sobrevida global taxas (OS) do que aqueles com tumores p-mTOR-negativos em análises univariáveis, e houve uma tendência para uma correlação entre a expressão p-mTOR e a sobrevivência em análise multivariada. RAD001 proliferação dependente da dose, inibiu marcadamente de células de carcinoma gástrico humano por expressão-regulação para baixo de p70s6k, p-p70S6K, C-myc, CyclinD1 e Bcl-2,-se-regulação da expressão de P53.
Conclusões Online em gástrica cancro, p-mTOR é um alvo terapêutico potencial e RAD001 era um agente de tratamento promissor com indução de paragem do ciclo celular e a apoptose através da expressão de C-myc-regulação para baixo, CyclinD1 e Bcl-2,-se-regulação da expressão de P53.
Background
carcinoma gástrico é o quarto câncer mais comum ea segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo, incluindo 1 milhão de novos casos por ano em todo o mundo [1]. Cerca de 60% dos novos casos de câncer gástrico ocorrem no leste da Ásia [2], especialmente na China. A ressecção cirúrgica é o tratamento mais eficaz para o cancro gástrico e a eficácia da quimioterapia permanece limitada [3]. Muitos estudos têm indicado que a profundidade da invasão e do número de linfonodos metastáticos são os indicadores poderosos mais importantes de sobrevivência de pacientes com câncer gástrico [4, 5]. Por exemplo, em estudos anteriores [6, 7] Relação de linfonodo positivo, nós encontramos é um indicador prognóstico independente após D2 ressecção e quimioterapia intraperitoneal pode ser benéfico para pacientes com câncer gástrico. No entanto, um passo fundamental para melhorar o resultado clínico encontra-se no aumento da compreensão do comportamento biológico do tumor, o que pode ajudar a identificar os possíveis alvos para a terapia individual [8, 9].
Nos últimos anos, molecularmente abordagens para o tratamento baseado na câncer gástrico tem sido dada grande preocupação. Vários artigos descreveram alguns alvos moleculares potenciais para a terapia de cancro gástrico, tais como o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) [10-13], factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) [14], RECEPTOR d'origine nantais (RON) [15 ].
O alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) é um novo alvo molecular potencial para a terapia antineoplásica. Sua expressão foi demonstrada em várias linhas celulares e amostras de tumor, tais como neoplasias de fígado [16], o cancro da mama [17], adenocarcinoma do trato biliar [18], e cancro do colo do útero [19, 20]. Estes estudos mostraram que a expressão mTOR foi associada com mau prognóstico clínico. Lang et ai [21]. também observaram activação mTOR no cancro gástrico humano in vitro e in vivo. Eles indicaram mTOR é frequentemente ativada no câncer gástrico humano. Recentemente, um derivado de rapamicina biodisponível oralmente, RAD001 (everolimus; Novartis Pharma AG), tem sido desenvolvido. Um estudo de fase III de tratamento revelados com everolimus prolonga a sobrevida livre de progressão em pacientes com carcinoma de células renais metastático que tinham progredido em outras terapias específicas [22]. RAD001 também foi demonstrado inibir a proliferação do crescimento de células de tumor em alguns carcinomas [23, 24]. Mas o papel de RAD001 na célula cânceres gástrico não é clara.
Os objetivos deste estudo foram analisar mais detalhadamente as relações a expressão mTOR com o valor prognóstico da activado mTOR (p-mTOR), o efeito de RAD001 sobre o crescimento e do ciclo celular das células cancerosas gástricas humanas in vitro e determinar se o câncer gástrico é um bom candidato para a terapia alvo com inibidores de mTOR.
Métodos
pacientes estudados
Este estudo retrospectivo consistiu de 181 pacientes submetidos à ressecção radical ( R0) para confirmação histológica de carcinoma gástrico Cancer Center de Sun Yat-sen University entre janeiro de 1997 e dezembro de 2002. Todos os pacientes com diagnóstico histológico de adenocarcinoma do estômago haviam sido submetidos à gastrectomia parcial proximal, distal gastrectomia parcial ou gastrectomia total. A aprovação ética foi obtida a partir de Sun Yat-sen University Cancer Center comitê de ética em pesquisa.
Aqueles com material histológico adequado e dados clínicos completos foram elegíveis para inclusão. Os critérios de elegibilidade também incluiu confirmado histologicamente ressecção R0, que foi definida como ausência de tumor residual macroscópica e microscópica e tempo de sobrevivência pós-operatória ≥ 6 meses. Os pacientes com metástases à distância e carcinoma de coto gástrico após a ressecção para doença benigna foram excluídos do estudo. A razão é que a sobrevida de pacientes com metástases à distância é muitas vezes afetado por muitos outros fatores, como a quimioterapia pré-operatória ou obstrução
Todos os pacientes tiveram acompanhamento após a cirurgia em intervalos de 6 a 12 meses.; a data final de follow-up foi de Dezembro de 2008. A mediana de seguimento foi de 50 (média: 50,66; intervalo de 10 a 128) meses para todos os pacientes, e 74 meses (média: 72,80; gama 27-128) para a sobrevivência. A duração média do acompanhamento foi de 40 (média: 43,71; gama 11 a 125) para os pacientes que tinham tumores de expressão de p-mTOR positiva e 60,5 meses (média: 58.01; intervalo de 10 a 128) para a expressão negativa. A sobrevida foi calculado a partir da data do diagnóstico até a data da morte ou último follow-up.
A recolha de amostras e imunocoloração para todas as amostras tumorais p-mTOR
foram obtidos a partir de cancros gástricos cirurgicamente ressecados antes da terapia adjuvante. , blocos de tecido embebidos em parafina e fixados em formalina foram armazenadas à temperatura ambiente, identificada por um número de identificação. Cinco-um de espessura foram cortadas secções de tecido a partir dos blocos de parafina, desparafinadas em xileno e re-hidratados. recuperação antigénico foi processado com citrato de sódio. As lâminas foram então incubadas em 0,3% H 2O 2 durante 10 min, e bloqueado em 1% de albumina de soro de bovino durante 60 min seguido por um anticorpo monoclonal de coelho específico para o P-mTOR (Phospho-mTOR, Ser2448, 49F9; Cell Signaling Technology), a 4 ° C durante a noite, e depois coradas com 3,3-diaminobenzidina. Após a visualização da imunorreactividade, as secções foram contra-coradas com hematoxilina e, em seguida, montado.
Avaliação da imuno-coloração
As secções foram avaliadas e tecidos de adenocarcinomas da próstata humana serviu como controlo positivo. De acordo com critérios recentemente descritos para a expressão de classificação de mTOR, a intensidade da coloração foi determinada como 0 (ausente), 1 (fraca), e 2 (forte) e os níveis de expressão foram biomarcadores semiquantificadas utilizando uma pontuação de imuno-histoquímica (gama, 0-200), calculado multiplicando a intensidade da coloração com a percentagem de células tumorais positivas para [18]. Os pacientes com uma pontuação de imuno-histoquímica de ≤ 20 foram considerados como p-mTOR-negativo e aqueles com uma pontuação de > 20, como-p-mTOR positivo. Todas as lâminas foram avaliadas independentemente por dois patologistas independentes sem qualquer conhecimento das informações clínicas dos pacientes. Quando os pareceres dos dois avaliadores eram diferentes, foi alcançado um acordo pela discussão cuidadosa As linhas celulares
e condições de cultura
linhas de células humanas de câncer gástrico BGC823 e AGS (número ATCC: CRL-1739). Que são pouco diferenciadas foram presentes de Peking University School of Oncology (Beijing, República Popular da China.) [25]. As linhas de células foram mantidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com 10% de soro bovino fetal (Hyclone), penicilina (100 unidades /ml) e estreptomicina (100 unidades /ml) a 37 ° C e 5% de CO2 numa incubadora humidificada .
ensaio de viabilidade celular
Para analisar o efeito de RAD001 em células de cancro gástrico humano, a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT. RAD001 foi fornecido pela Novartis Pharma (Basileia, Suíça). Para o ensaio de viabilidade, as células de crescimento logarítmico foram estimuladas com várias doses de RAD001 (0, 5, 10, 20 e 40 uM). No final do período de cultura, 20 uL de corante de tetrazólio (-dimetiltiazol-2-il 4,5) -2,5- solução (Sigma, EUA) a 0,2 mg de brometo de difeniltetrazólio (MTT) /foi adicionado 3- ml em PBS , a densidade óptica a 490 nm (OD490) foi determinada usando um leitor de ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Os valores médios foram calculados a partir de culturas em triplicado. análise do ciclo celular

As células foram recolhidas e fixadas em etanol a 70% durante a noite a 4 ° C. As células foram então lavadas e coradas com iodeto de propídio (PI) (Sigma), 5 ug /mL. Após 30 minutos à temperatura ambiente protegida da luz, as células foram analisadas através de citometria de fluxo utilizando um Becton Dickinson FACScan. Ensaio de Anexina V

As amostras foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e utilizando Anexina V-fluoresceína isotiocianato (FITC) e PI coloração para a determinação de exposição de fosfatidilserina na membrana plasmática externa. Após incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente protegida da luz, as amostras foram quantificadas por citometria de fluxo, utilizando um FACScan Becton Dickinson.
A transcrição reversa-PCR
ARN total foi extraído utilizando o método de TRIzol. O RNA foi transcrito inversamente usando um kit disponível comercialmente (Fermentas, EUA). A mistura (25 ul total) para PCR consistiu em 0,5 uL de ADNc, 0,5 U de polimerase Taq de ADN, 2,5 ul de tampão 10 × de PCR, dNTP 2,5 mM de mistura, e 50 sensoriais pM e anti-sentido iniciadores cada. CyclinD1 e C-myc foram analisados ​​por seguintes iniciadores: CyclinD1 5'GAACAGAAGTGCGAGGAGGAG3 'e iniciador reverso 5'AGGCGGTAGTAGGACAGGAAG3'; C-myc, 5 'CGAGCTGCTGGGAGGAGACAT3' e 5 Actin AGCCGCCCACTTTTGACA GG3 ':. 5'GGCACCCAGCACAATGAA 3' e 5 'TAGAAGCATTTGCGGTGG 3'
lisado celular e análise por Western blot
As células foram lisadas em tampão de lise e a concentração de proteína foi determinada pelo método do corante de Bradford (Bio-Rad Laboratories). Quantidades iguais de extracto de células foram submetidas a SDS-PAGE e transferidas para membrana de PVDF (Bio-Rad). As análises de Western blot foram realizados com vários anticorpos primários específicos. Os anticorpos que reconhecem fosfo-p70S6K (Thr389), p70S6K, fosfo-mTOR (Ser2448), Bcl-2 e p53 foram de Cell Signaling analisa.
Estatística
O desfecho primário do estudo foi a sobrevida global (OS). Ele foi definido como o período entre o tempo da cirurgia e a morte. sobrevida livre de doença (DFS) foi o tempo entre o momento da cirurgia e recaída ou morte relacionada com o tumor. Foi analisado como um ponto final secundário. A associação de expressão p-mTOR com várias características clinicalopathologic foi analisada utilizando o teste do qui-quadrado. sobrevida cumulativa e sobrevida livre de doença foram estimadas pelo método de Kaplan-Meier. O teste de log-rank foi utilizado para avaliar a significância estatística das diferenças entre as curvas de sobrevida. Um modelo de Cox proporcional perigo (para trás, passo a passo) para a análise multivariada foi aplicada para os fatores que alcançaram significância na análise univariada. A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS (versão 13 para Windows; SPSS, Chicago, IL). Diferenças na P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados características clínico-patológicas
Um total de 181 pacientes foram incluídos neste estudo. A idade média foi de 59 anos (variação, 23-83 anos). As características clínico-patológicas da população do estudo estão resumidos na Tabela 1. 129 pacientes eram do sexo masculino e 52 do sexo feminino. 77 de 181 (42,5) tumores eram da parte superior do estômago, 74 dos 181 pacientes (40,9%) eram da parte inferior do estômago, e os tumores foram restantes do corpo do meio e todo o estômago. 118 de 181 (65,2%) o tamanho do tumor do paciente foram > 4 cm, e 63 (34,8%) eram ≤ 4 cm. De acordo com critérios da Organização Mundial da Saúde, 4 de 181 tumores (2,2%) foram bem diferenciado, 55 de 181 tumores (30,4%) foram moderadamente diferenciados, 116 eram pouco diferenciado, e 6 foram indiferenciada. estágio cirúrgico pós-operatório foi classificado de acordo com a classificação 2002 da UICC /AJCC [26] .table 1 correlação Correlação de expressão p-mTOR no câncer gástrico
Fatores
Todos os pacientes
No. dos pacientes (%)
P

N
= 181 (%)
mTOR negativo
mTOR positiva

Idade (y)
0,256 Art < 60
95 (52,5)
50 (56,8)
45 (48,4)
≥60
86 (47,5)
38 (43,2)
48 (51,6)
Sex
129 (71,3) .926
Masculino
63 (71,6)
66 (71,0)
Feminino
52 (28,7)
25 (28,4)
27 (29,0)
site
0,053
superior
77 (42,5)
33 (37,5)
44 (47,3)
meio
28 ( 15,5)
10 (11,4)
18 (19,4)
inferior
74 (40,9)
43 (48,9)
31 (33,3)
difusa Página 2 ( 1.1) Página 2 (2.3)
0 (0,0)
Tumor tamanho
.172
≤ 4 cm
63 (34,8)
35 (40,0)
28 (30,1) Art > 4 cm
118 (65,2)
53 (60,0)
65 (69,9)
tipo Borrmann
0,398
fase inicial
7 (3,9)
6 ( 6.8)
1 (1.1)
I
4 (2.2) Página 2 (2.3) Página 2 (2.1)
II
65 (35,9)
31 ( 35,2)
34 (36,6)
III
101 (55,8)
47 (53,4)
54 (58,1)
IV
4 (2.2) Página 2 ( 2.3) Página 2 (2.1)
classificação
0,999
1 | 4 (2.2) Página 2 (2.3) Página 2 (2.1) Página 2
55 (30,4)
27 (30,7)
28 (30,1) Sims 3
116 (64,1)
56 (63,6)
60 (64,5) 4
6 (3.3) Sims 3 (3.4)
3 classificação (3.3)
Patológica T
0,168
T1
17 (9,4)
12 (13,6)
5 (5.4)
T2
35 (19,3)
18 (20,5)
17 (18,3)
T3
119 (65,7)
55 (62,5)
Status 64 (68,8)
T4
10 (5.5) Sims 3 (3.4)
7 (7,5)
Patológica N
0,008
N negativo
44 ( 24.3)
29 (33,0)
15 (16,1)
N etapa positiva
137 (75,7)
59 (67,0)
78 (83,9)
Patológica (pTNM)
0,026
I
26 (14,4)
17 (19,3)
9 (9,7)
II
47 (26,0)
28 (31,8)
19 (20,4)
III
100 (55,2)
41 (46,5)
59 (63,4)
IV
8 (4.4) Página 2 (2.3)
6 (6,5)
129 de 181 pacientes (71,2%) tinham doença em estágio mais avançado T (PT3 + PT4) e 137 pacientes (75,7%) tiveram metástase ganglionar. Totalmente pacientes de fase I-IV foram 26, 47, 100 e 8 casos, respectivamente.
Expressão p-mTOR no câncer gástrico
imunocoloração de p-mTOR foi citoplasmática e em parte membranoso. A Figura 1 mostra exemplos representativos de imunocoloração p-mTOR. A mucosa gástrica normal é negativa para P-mTOR. Dos 181 pacientes, 93 (51,4%) eram tumores P-mTOR-positivos. Figura 1 Exemplos de imunocoloração p-mTOR. (A) A mucosa gástrica normal é negativa para P-mTOR (ampliação original x 200). (B) A mucosa gástrica normal é negativa para P-mTOR (ampliação original × 400) (C) A expressão positiva de p-mTOR em cancro gástrico (ampliação original x 200). (D) a expressão negativa de p-mTOR no câncer gástrico (aumento original x 200).
Análise de sobrevida
pacientes com p-mTOR câncer gástrico positivo mostraram significativamente menor taxas de sobrevida global livre de doença e do que aqueles com p- cancro gástrico mTOR negativo (DFS, 48,9% versus 30,1%; p = 0,006; SO, 51,1% versus 34,4%; p = 0,011; Tabela 2; Figura 2A, B). análise univariada revelou que o tempo de sobrevivência também diminuiu com maior classificação pT (DFS, p = 0,001; OS, P = 0,005), metástases em linfonodos (DFS, p < 0,0001; OS, P = 0,001) e pTNM avançada fase (DFS, p < 0,001; OS, P = 0,001). Não houve associação entre o DFS ou OS e idade, sexo ou tumor size.Table 2 Análise univariada de-livre de doença e sobrevida global de câncer gástrico


livre de doença suivival
geral survival

Characteristic

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

Age(y)
0,343
0,583 Art < 60
95
1,00
1,00
≥60
86
0,834
0,573-1,214
0,898
0,611-1,320 Sexo seguro
. 662
0,950
Masculino
129
1,00
1,00
Feminino
52
0,909
0,591-1,396
0,986
0,639-1,521 tamanho
Tumor
0,151
0,232
≤4 cm
63
1,00
1,00 Art > 4 cm
118
1.345
0,897-2,016
1.287
0,851-1,945
fase pT
.001 .005

pT1
17
1,00
1,00
pT2
35
1.549
0.558-4.301
.401
1.535
0.553-4.264
.411
pT3
119
3.546
1.437-8.750
.006
3.237
1.310-8.001
.011
pT4
10
4.738
1.547-14.506
.006
4.068
1.289-12.836
.017
pN estágio Art < 0001
0,001
negativo
44
1,00
1,00
positiva
137
2.617
1,538-4,451
2.389
1.401- 4,075
pTNM estágio Art < 0001
0,001
I
26
1,00
1,00
II
47
2.920
1.197-7.121
.018
2.860
1.173-6.973
.021
III
100
4.955
2.152-11.409
< 0001
4,455
1,930-10,281 Art < 0001
IV
8
7,369
2,470-21,981 Art < 0001
6.103
1,965-18,957
0,002
p-mTOR
0,008
0,013
negativo
88
1,00
1,00
positivos
93
1.667
1,146-2,454
1.644
1,112-2,430
Figura 2 estimativas de Kaplan-Meier da probabilidade de sobrevivência. Os pacientes com p-mTOR positiva mostrou significativamente menor sobrevida global (A) e as taxas do que aqueles com expressão p-mTOR negativo sobrevida livre de doença (B). (P = 0,011 e p = 0,006, respectivamente)
Na análise multivariada, metástase ganglionar (DFS, p = 0,018; OS, P = 0,038). E estágio pT (DFS, p = 0,018; OS, P = 0,046) foram fator prognóstico independente significativo para o tempo de sobrevivência. Além disso, a análise multivariada (Tabela 3) indicaram também uma tendência para uma correlação entre a expressão p-mTOR e diminuiu a sobrevivência, mas a tendência não atingiu significância estatística (DFS, p = 0,059; OS, P = 0,070) .table 3 A análise de regressão de Cox multivariada de livre de doença e global sobrevivências


No geral suivival
livre de doença survival

Factors

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

p-mTOR
0,059
0,070
negativo
88
1,00
1,00
positiva
93
1.452
0,986-2,138
1.443
0,970-2,147
Infiltrando profundidade de 0,018
0,046
pT1
17
1,00
1,00
pT2
35
1.050
0.366-3.016
0.928
1.078
0.375-3.101
0.889
pT3
119
2.251
0.867-5.845
0.096
2.146
0.823-5.595
0.118
pT4
10
2.926
0.920-9.305
0.069
2.616
2.616-8.580
0.113
Lymph status do nó
0,018
0,038
negativo
44
1,00
1,00
positiva
137
1.981
1,981-3,488
1.828
1,034-3,233
RAD001 inibe a proliferação e impede p70S6K fosforilação
para investigar os efeitos de RAD001 sobre a proliferação de linhas celulares de cancro gástrico humano BGC823 e AGS, foram realizados ensaios de proliferação com a exposição de 48 horas ao RAD001. Como resultado, RAD001 gera uma inibição significativa em ambas as linhas celulares de um modo dependente da dose. (Figura 3A). A Figura 3 (A) RAD001 inibe a proliferação de células de cancro gástrico. células de cancro gástrico foram tratados com as concentrações indicadas de RAD001, na presença de 10% de FBS durante 48 h. A viabilidade celular foi avaliada por um ensaio MTT. (B) A fosforilação de p70S6K diminuiu significativamente de uma maneira dependente da dose em ambas as AGS e BGC823 células pelo tratamento com RAD001. Ambas as linhas celulares foram incubadas com o aumento da dose de RAD001 durante 48 horas, os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de Western blot com anticorpos P-S6K e S6K fosforilados.
Experiências de Western blot foram realizadas com RAD001 em 0, 5, 10, 20 uM durante 48 h. P70S6 quinase é um importante alvo a jusante do mTOR e sua fosforilação dependente da mTOR permite a tradução de proteínas ribossomais. Foi examinado o estado de fosforilação de p70S6K alvo a jusante por immunoblotting. Tal como mostrado na Figura 3B, observou-se que o tratamento de ambas as linhas celulares BGC823 e AGS com RAD001 impedir significativamente a fosforilação de p70S6K de uma forma dependente da dose.
RAD001 induz a paragem do ciclo celular G0 /G1 e apoptose em células de cancro gástrico
para determinar se a supressão da proliferação celular foram devido a paragem G0 /G1-fase ou apoptose, a distribuição do ciclo celular foi analisada por CCF. A Figura 4 mostrou que o tratamento de células de BGC823 com RAD001 durante 48 horas resultou numa paragem em G1 robusta e promoveu a apoptose. Com o aumento da dose de RAD001, mais e mais células permaneciam em fase G1-, enquanto a progressão do ciclo de células em fase S foi decrescente (Figura 4A). RT-PCR A análise revelou RAD001 dependente da dose diminuiu o nível de mRNA de ciclina D1 e C-myc (Figura 4B). Figura 4 RAD001 induz a paragem do ciclo celular e a apoptose em células BGC823. BGC823 células (A) foram expostas a várias concentrações de RAD001 durante 48 h. (B) ARN foram extraídos a partir de células. A ciclina D1 e nível de expressão de C-myc foram detectadas por RT-PCR, de actina como um controlo de carga. células (C) foram incubadas durante 48 horas com as doses indicadas de RAD001 antes de coloração com anexina V-FITC. As percentagens de células apoptóticas são apresentadas. (D) As células foram incubadas durante 48 horas com as doses indicadas de RAD001. As células foram recolhidas, lisadas e sujeitas a análise de Western blot com anticorpos Bcl-2 e p53. GAPDH foi usada como um controlo de carga.
Ensaios de Anexina-V mostraram que RAD001 induziu significativamente a apoptose em células BGC823. Um aumento na taxa de apoptose foi analisada por FCM com o aumento da dose (Figura 4C). A análise de transferência de Western mostrou RAD001 dependente da dose, diminuindo o nível de proteína Bcl-2 e o aumento do nível de proteína de p53 (Figura 4D). Resultados semelhantes foram observados em células de AGS (dados não mostrados).
Discussão of the mammalian target of rapamycin (mTOR) foi descoberto no início de 1990 s no estudo do mecanismo de acção de rapamicina, que foi originalmente encontrada como um agente antifúngico e mais tarde foi reconhecido como propriedades anticancerígenas [27]. Como uma proteína cinase de Ser /Thr, mTOR desempenha um papel chave no crescimento celular e na homeostase [28]. A proteína mTOR forma um complexo com as proteínas adaptadoras, mTORC1 (mammalian target of rapamycin complexo 1) e mTORC2. A activação de mTORC1 regula o crescimento celular pela modulação da síntese de proteínas, biogénese ribossoma e autofagia [29]. A via mTORC2 desempenha um papel-chave de ativação de Akt, como PDK1 (proteína quinase 3-fosfoinositídeo dependente 1) e PI3K, um alvo da droga potencial de cancros em que há desregulação Akt [26].
No estudo atual, observou-se que 93 (51,4%) pacientes apresentaram expressão positiva de p-mTOR em 181 pacientes com câncer gástrico. Consistente com nosso resultado, em outro estudo, incluindo 1072 pacientes, a expressão de p-mTOR é 46,5% [30].
Estudos anteriores relataram o significado prognóstico de expressão p-mTOR. Herberger et al [18]. identificado p-mTOR ser um fator prognóstico independente para óbito em pacientes com adenocarcinoma do trato biliar. Em seu estudo, a sobrevida global foi significativamente menor em pacientes com tumores-p-mTOR positiva, em comparação com pacientes com tumores-p-mTOR negativo (p = 0,004). No cancro gástrico, Yu et al. expressão avaliada de p-mTOR em 1.072 pacientes com câncer gástrico utilizando um tissue microarray, demonstrando a sobre-expressão de p-mTOR foi um fator prognóstico independente [30]. No entanto, em um estudo incluiu 109 pacientes com adenocarcinoma gástrico submetidos a gastrectomia radical [31], Murayama et al. encontrado nem citoplasmática de p-mTOR nem nuclear p-mTOR foi o factor de prognóstico independente, embora eles identificaram a expressão citoplasmática de p-mTOR foi associada a menor sobrevivência e correlacionada com a profundidade de invasão tumoral, nódulos linfáticos e fase do tumor. No presente estudo, confirmamos que a classificação pT eo status dos linfonodos são indicador de prognóstico independente do resultado clínico em pacientes com câncer gástrico por análises multivariadas. No entanto, porque a maioria dos pacientes apresentam doença localmente avançada, outros marcadores prognósticos secundárias, particularmente p-mTOR, pode ser de uso [13]. Nossos resultados mostram claramente que a expressão p-mTOR é correlacionada fortemente com a sobrevida global e livre de doença pobres em análises univariáveis ​​com uma tendência de correlação na análise multivariada.
Consistente com nosso estudo atual, vários estudos também têm reconhecido os efeitos antiproliferativos de inibidores de mTOR em células de câncer gástrico. Por exemplo, Lang et al [21]. rapamicina identificou poderia inibir o crescimento de células de cancro gástrico num modelo de tumor tanto subcutânea e num modelo experimental. Os resultados mostram a aptidão dos inibidores de mTOR para ser utilizado num contexto anti-angiogénico para a terapia do cancro gástrico.
No entanto, RAD001 é um novo inibidor de mTOR como agente anticancerígeno. O mecanismo sobre RAD001 no câncer gástrico não é clara. Cejka et ai. mostrou a actividade anti-angiogénico de RAD001 combinada com uma alta dose de ciclofosfamida revelou actividade antitumor sinérgicos contra o cancro gástrico [32]. Eles descobriram também que RAD001 diminuição da proliferação e produção atenuada de HIF-1α, bem como o VEGF em células de cancro gástrico in vitro [33]. No estudo actual, os nossos dados mostraram que a terapia RAD001-atenuado fosforilação de p70S6K e inibiu marcadamente a proliferação de células de cancro gástrico pela paragem do ciclo celular e apoptose in vitro. Encontramos RAD001 induzida a prisão fase G0 /G1, que foi associado com diminuição da ciclina D1 e C-myc. Além disso, mostrámos pela primeira vez que um novo RAD001 como apoptose induzida por inibidor de mTOR dependente da dose, em células de cancro gástrico por ensaios de anexina V. Este efeito pode ser ditada pelo contexto celular e alvos a jusante incluindo p53 e BCL-2. Estas descobertas podem explicar melhor a eficácia de RAD001.
Conclusão
Em resumo, nós realizou uma pesquisa sistemática para mTOR no câncer gástrico, indicando as relações a expressão com o valor prognóstico da activado mTOR (p-mTOR) in vivo, o efeito de RAD001 e a parte de mecanismos em células de cancro gástrico in vitro. Nossos resultados indicaram que p-mTOR serviria como um potencial marcador biológico para identificar um subgrupo de pacientes com câncer gástrico de mau prognóstico. Também mostrou que RAD001 era um agente promissor para o tratamento de cancro gástrico com indução de paragem do ciclo celular e a apoptose por expressão-regulação para baixo de C-myc, CyclinD1 e Bcl-2,-se-regulação da expressão de P53. Mais estudos são necessários para elucidar o papel da ativação de mTOR e, eventualmente, propor mTOR como um objectivo concreto para a terapia de câncer gástrico
blocos concessão de apoio:. Apoiado pela National Research Alta Tecnologia e Desenvolvimento (863) Programa de China
Notas de da-zhi Xu, Qi-rong Geng contribuíram igualmente para este trabalho.
Declarações
Agradecimentos
este trabalho foi financiado pelo National Research alta Tecnologia e Desenvolvimento (863) Programa de China. Os autores apreciam a excelente assistência técnica de Li-hui Wang, Fei-Meng Zheng, Zheng Zhi-Zou, Yan Zhang e Zi-jie Longo.
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Os autores declaram que têm interesses conflitantes.

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