Aktivoitu nisäkkään rapamysiinin kohde on potentiaalinen terapeuttinen kohde mahasyövän

Aktivoitu nisäkkään rapamysiinin kohde on potentiaalinen terapeuttinen kohde mahasyövän
tiivistelmä
tausta
nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) on keskeinen rooli solujen kasvun ja homeostaasin. Tarkoituksena nykyisen on tutkia ilmaisua aktivoitua mTOR (p-mTOR) mahasyövän potilaille, heidän ennustetekijöitä merkitys ja eston vaikutuksesta RAD001 kasvaimen kasvuun ja onko kohdennettua mTOR voisi olla potentiaalinen terapeuttinen strategia mahasyövän. Tool menetelmät
ilmentyminen p-mTOR havaittiin yksilöillä 181 mahasyövistä joille tehtiin radikaali resektio (R0) immunohistokemiallisesti. Korrelaatio p-mTOR lauseke viittaavia tekijöitä ja selviytyminen mahasyövän tutkittiin. Olemme myös päättäneet esto vaikutus RAD001 kasvaimen kasvuun käyttämällä BGC823 ja AGS ihmisen mahasyövän solulinjoissa.
Tulokset
immuunivärjäykseen p-mTOR oli positiivinen 93 181 (51,4%) syöpien, korreloi läheisesti imusolmukkeiden solmu tila ja pTNM vaiheessa. Potilaat, joilla on p-mTOR positiivisia verrokkeja lyhyempi tautivapaan elinajan (DFS) ja kokonaiseloonjääminen (OS) hinnat kuin ne, joilla on p-mTOR-negatiivisia kasvaimia univariable analyysejä, ja siellä oli suuntaus korrelaatio p-mTOR ilmaisun ja selviytymistä monimuuttuja analyysit. RAD001 selvästi esti annoksesta riippuvaa proliferaatiota ihmisen mahalaukun syöpäsoluissa alaspäin säätäminen ilmentymä p70s6k, p-p70s6k, C-myc, CyclinD1 ja Bcl-2, up säätelevä ilmentymä P53.
Johtopäätökset
maha- syöpä, p-mTOR on potentiaalinen terapeuttinen kohde ja RAD001 oli lupaava käsittelyaine indusoimisessa solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin säätelyssä alaspäin ilmentymisen C-myc, CyclinD1 ja Bcl-2, up-säätelevät ilmentymistä p53.
taustaa
mahakarsinoo- on neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti, mukaan lukien 1 miljoonaa uutta tapausta vuosittain kaikkialla maailmassa [1]. Noin 60% uusista tapauksista mahasyöpä esiintyy Itä-Aasiasta [2], erityisesti Kiinassa. Kirurginen resektio on tehokkain hoito mahasyövän ja tehoa kemoterapian edelleen rajallista [3]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että syvyys invaasion ja metastaasien lukumäärän imusolmukkeiden ovat tärkeimpiä tehokkain ennustavia selviytymisen mahasyöpäpotilaista [4, 5]. Esimerkiksi aiemmissa tutkimuksissa [6, 7], olemme löytäneet positiivinen imusolmuke suhde on riippumaton prognostinen indikaattori jälkeen D2 resektion ja vatsaonteloon kemoterapia voi olla hyödyllistä mahasyöpäpotilaista. Kuitenkin olennainen askel kohti parantaa kliinistä tulosta piilee lisäsi ymmärrystä kasvaimen biologista käyttäytymistä, joka voi auttaa tunnistamaan mahdolliset kohteet yksittäisten terapia [8, 9].
Viime vuosina molecularly lähestymistavat käsittelyä varten mahasyöpä on annettu suuri huolenaihe. Useat artikkelit ovat kuvanneet joitakin mahdollisia kohdemolekyylit hoidon mahasyövän, kuten epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) [10-13], verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) [14], RECEPTEUR d'origine Nantais (RON) [15 ].
nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) on uusi potentiaalinen molekyylikohteena syöpähoidon. Sen ilme on osoitettu erilaisissa solulinjoissa ja kasvain näytteet, kuten maksan kasvaimet [16], rintasyövän [17], sappiteiden adenokarsinooma [18], ja kohdunkaulan syöpä [19, 20]. Nämä tutkimukset osoittivat, että mTOR ilmentyminen liittyi huono kliinistä ennustetta. Lang et ai [21]. Myös havaittu mTOR aktivoitumista ihmisen mahasyövän in vitro ja in vivo. Ne totesivat mTOR usein aktivoidaan ihmisen mahasyövän. Äskettäin suun kautta otettava johdannainen rapamysiinin, RAD001 (everolimuusi; Novartis Pharma AG), on kehitetty. Faasi III tutkimuksessa paljastui everolimuusihoidon pidentää ilman taudin etenemistä potilailla, joilla on metastaattinen munuaissolukarsinooma, joka oli edennyt muita kohdennettuja hoitomuotojen [22]. RAD001 on myös osoitettu estävän lisääntymistä kasvainsolujen kasvua joissakin karsinoomien [23, 24]. Mutta rooli RAD001 mahalaukun syövistä solu ei ole selvä.
Tutkimuksen tarkoituksena oli analysoimaan edelleen suhteiden tapauksessa mTOR lausekkeen ennusteeseen arvo aktivoitua mTOR (p-mTOR), vaikutus RAD001 kasvuun ja solusyklin ihmisen mahasyövän in vitro ja onko mahalaukun syöpä on hyvä ehdokas kohde hoidon mTOR-inhibiittorit. Tool menetelmät
potilaat tutkittiin
retrospektiivinen tutkimus käsitti 181 potilasta, joille tehtiin radikaali resektio ( R0) ja histologisesti varmennettu mahakarsinoo- Cancer Center of Sun Yat-sen University tammikuun 1997 ja joulukuun 2002 Kaikki histologisesti vahvisti adenokarsinooma mahalaukussa oli tehty joko proksimaalista osittainen gastrektomia distaalinen osittain gastrectomy tai kokonaan gastrectomy. Eettinen hyväksyntä saatiin Sun Yat-sen University Cancer Centerin tutkimuksen eettinen komitea.
Ne riittävät histologisia materiaalia ja täydelliset kliiniset tiedot olivat oikeutettuja pääsemään. Kelpoisuusvaatimuksia kuului myös histologisesti vahvisti R0 resektio, joka määriteltiin ei makroskooppiset ja mikroskooppiset jäljellä kasvain ja postoperatiivisesti elinaika ≥ 6 kuukautta. Potilaat, joilla on etäispesäkkeitä ja syöpä mahan kanto jälkeen resektio hyvänlaatuisen sairastavia potilaita ei otettu tutkimukseen. Syynä on se, että potilaiden selviytymiseen kaukaisiin etäpesäkkeitä usein vaikuttavat monet muut tekijät, kuten ennen leikkausta kemoterapiaa tai tukos.
Kaikilla potilailla oli seurannan leikkauksen jälkeen klo 6-12 kuukautta välein; viimeinen seurannan oli joulukuussa 2008. mediaani seuranta-aika oli 50 (keskiarvo: 50.66; välillä 10 128) kuukautta kaikille potilaille, ja 74 kuukautta (keskiarvo: 72,80; alue 27-128) hengissä. Keston mediaani seuranta oli 40 (keskiarvo: 43.71; alue 11-125) potilaille, joilla oli kasvaimia p-mTOR positiivinen ilme, ja 60,5 kuukautta (keskiarvo: 58,01; välillä 10 128) varten negatiivinen ilmaus. Survival laskettiin alkaen diagnoosi asti kuoleman tai Viimeisimmässä seurannassa.
Näytteenotto ja immuunivärjäykseen p-mTOR
Kaikki kasvain näytteet saatiin kirurgisesti resektoitiin mahasyövistä ennen adjuvanttihoito. Formaliini-, parafiiniin upotettujen kudosten lohkojen säilytettiin huoneenlämpötilassa tunnistetaan tunnistenumero. Viisi-pm paksun kudosleikkeiden leikattiin parafiiniblokit, parafiini ksyleenillä, ja nesteytyksestä. Antigeenisia haku käsittelyssä oli natriumsitraattia. Levyjä inkuboidaan sitten 0,3% H 2O 2 10 minuutin ajan, ja blokattiin 1% naudan seerumin albumiinia 60 min, mitä seurasi kanin monoklonaalista vasta-ainetta, joka on spesifinen p-mTOR (Phospho-mTOR, Ser2448, 49F9; Cell Signaling Technology) 4 ° C: ssa yön yli ja sitten värjättiin 3,3-diaminobentsidiiniä. Sen jälkeen, kun visualisointi immunoreaktiivisuuden, leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä ja sitten asennetaan.
Arviointi immunohistokemiallinen värjäys
immunovärjättiin osat arvioitiin ja kudosten ihmisen eturauhasen adenokarsinoomia toimi positiivisena kontrollina. Mukaan äskettäin kuvattu kriteerit luokitus mTOR ilmaisun, värjäyksen voimakkuus määritettiin 0 (poissa), 1 (heikko), ja 2 (voimakas) ja ilmaisun tasot biomarkkerit olivat semiquantified käyttää immunohistokemiallista pisteet (vaihteluväli 0-200) lasketaan kertomalla värjäyksen intensiteetti prosenttiosuus positiivisia kasvainsoluja [18]. Potilaat, joilla immunohistokemiallista pisteet ≤ 20 pidettiin p-mTOR-negatiivisia ja ne pistemäärällä > 20 p-mTOR-positiivisia. Kaikki objektilasit itsenäisesti arvioineet kaksi riippumatonta patologia ilman tietoa potilaiden kliininen tieto. Kun lausunnot kaksi arvioijien olivat erilaisia, päästiin huolellisesti keskustelua.
Solulinjat ja viljelyolosuhteet
Ihmisen mahalaukun syövän solulinjat BGC823 ja AGS (ATCC-numero: CRL-1739), jotka ovat huonosti eriytetty olivat lahjoja alkaen Pekingin yliopiston School of Oncology (Peking, PR China.) [25]. Solulinjoja ylläpidettiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone), penisilliiniä (100 yksikköä /ml) ja streptomysiiniä (100 yksikköä /ml) 37 ° C: ssa ja 5% CO 2: ssa kosteutetussa inkubaattorissa .
solunelinkykyisyysmääritys
analysoimiseksi vaikutuksen RAD001 ihmisen mahalaukun syövän solut, solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä. RAD001 saatiin Novartis Pharma (Basel, Sveitsi). Elinkelpoisuuden määritystä, logaritmisesti kasvavia soluja stimuloitiin eri annoksilla RAD001 (0, 5, 10, 20 ja 40 uM). Lopussa viljelemisen jakson 20 ui tetratsolium 3- (4,5-dimetyylitiatsoli-2-yyli) -2,5- difenyylitetratsoliumbromidin (MTT) (Sigma, USA), jossa on 0,2 mg /ml PBS: ssä, lisättiin , optinen tiheys 490 nm: ssä (OD490) määritettiin käyttäen entsyymi-immunologinen määritys (ELISA-lukijassa). Keskiarvot laskettiin kolmelle rinnakkaiselle viljelmälle.
Solusyklianalyysiä
Solut kerättiin ja kiinnitettiin 70% etanolissa yön yli 4 ° C: ssa. Sitten solut pestiin ja värjättiin propidiumjodidilla (PI) (Sigma) 5 ug /ml. 30 minuutin kuluttua huoneen lämpötilassa valolta suojattuna, solut analysoitiin virtaussytometrillä käyttäen Becton Dickinsonin FACScan.
Anneksiini V-määritys
Näytteet pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja käyttämällä anneksiini V-fluoreseiini isotiosyanaatti (FITC) ja PI-värjäyksellä olevan fosfatidyyliseriinin altistumisen ulomman solukalvon. Kun oli inkuboitu 30 minuuttia huoneen lämpötilassa valolta suojattuna, näytteet kvantifioitiin virtaussytometrialla käyttäen Becton Dickinson FACScan.
Käänteinen transkriptio-PCR
Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol menetelmällä. RNA käänteisesti kirjoitettiin puhtaaksi käyttäen kaupallista kittiä (Fermentas, USA). Seosta (25 ui yhteensä) PCR koostui 0,5 ul cDNA, 0,5 U Taq DNA-polymeraasia, 2,5 ui 10 x PCR-puskuria, 2,5 mM dNTP seosta, ja 50 pM sense ja antisense-alukkeina kussakin. CyclinD1 ja C-myc analysoitiin seuraavia alukkeita: CyclinD1 5'GAACAGAAGTGCGAGGAGGAG3 'ja reverse-aluke 5'AGGCGGTAGTAGGACAGGAAG3 "; C-myc, 5 'CGAGCTGCTGGGAGGAGACAT3' ja 5 'AGCCGCCCACTTTTGACA GG3' Actin: 5'GGCACCCAGCACAATGAA 3 'ja 5' TAGAAGCATTTGCGGTGG 3 '.
Solulysaatti ja Western blot-analyysi
Solut hajotettiin hajotuspuskuriin ja pitoisuus proteiini määritettiin Bradfordin väriaineen menetelmällä (Bio-Rad Laboratories). Yhtä suuret määrät solu-uutteen altistettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Bio-Rad). Western blot analyysit tehtiin eri erityinen ensisijainen vasta-aineita. Vasta-aineita tunnustaa fosfo-p70S6K (Thr389), p70S6K, fosfo-mTOR (Ser2448), Bcl-2 ja p53 olivat Cell Signaling.
Tilastolliset analyysit
ensisijainen päätepiste Tutkimuksemme oli kokonaiselinaika (OS). Se määriteltiin välisenä aikana leikkauksen aikana ja kuoleman. Tautivapaa elinaika (DFS) oli välinen aika leikkauksen aikana ja uusiutumisen tai kasvaimeen liittyvä kuolema. Se analysoitiin toissijaisena päätepiste. Yhdistyksen p-mTOR ilmaisun eri clinicalopathologic ominaisuuksia analysoitiin käyttäen chi-neliö testi. Kumulatiivinen selviytyminen ja taudista vapaan eloonjäämisen arvioitiin Kaplan-Meier-menetelmällä. Log-rank-testi käytettiin arvioimaan tilastollinen merkitys eroja eloonjäämiskäyrien. Coxin suhteellisen riskin malliin (taaksepäin, vaiheittainen) ja monimuuttuja analyysiä haettiin tekijöitä, jotka saavutettiin merkitys univariable analyysiin. Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS (versio 13 Windows, SPSS, Chicago, IL). Erot P < 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.
Tulokset
viittaavia tekijöitä
Kaikkiaan 181 potilasta otettiin tutkimukseen. Mediaani-ikä oli 59 vuotta (vaihteluväli 23-83 vuotta). Ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia tutkimusväestöstä on koottu taulukkoon 1. 129 potilasta oli miehiä ja 52 naisia. 77 181 kasvaimia (42,5) oli ylemmästä maha, 74 181 potilasta (40,9%) oli alaosasta mahassa, ja loput kasvaimet olivat keskeltä ja koko kehon vatsaan. 118 181 (65,2%) potilaiden kasvaimen koon olivat > 4 cm, ja 63 (34,8%) oli ≤ 4 cm. Mukaisesti Maailman terveysjärjestön kriteerien, 4 181 kasvaimet (2,2%) oli hyvin eriytetty, 55 181 kasvaimia (30,4%) oli kohtalaisen eriytetty, 116 olivat huonosti eriytetty, ja 6 olivat erilaistumaton. Leikkauksen jälkeinen kirurginen vaihe luokiteltu 2002 UICC /AJCC luokitus [26] .table 1 ennusteeseen viittaavia korrelaatio p-mTOR ilmentymistä mahasyövässä
Factors
Kaikki potilaat
No. potilaista (%)
P

N
= 181 (%)
mTOR negatiivinen
mTOR positiivinen

Ikä (y) B 0,256
< 60
95 (52,5)
50 (56,8)
45 (48,4) B ≥60
86 (47,5)
38 (43,2)
48 (51,6)
Sex
0,926
Mies
129 (71,3)
63 (71,6)
66 (71,0) B Nainen
52 (28,7)
25 (28,4)
27 (29,0) Sivuston
0,053
Ylä
77 (42,5)
33 (37,5)
44 (47,3) B Middle
28 ( 15.5)
10 (11,4)
18 (19,4) B alempi
74 (40,9)
43 (48,9)
31 (33,3) B Diffuusi
2 ( 1.1)
2 (2,3) B-0 (0,0) B Tuumorikoko
0,172
≤ 4 cm
63 (34,8)
35 (40,0)
28 (30,1) B > 4 cm
118 (65,2)
53 (60,0)
65 (69,9) B Borrmann tyyppi
0,398
Alkuvaiheen
7 (3,9)
6 ( 6.8)
1 (1,1) B I
4 (2.2) B 2 (2,3) B-2 (2,1) B II
65 (35,9)
31 ( 35.2)
34 (36,6) B III
101 (55,8)
47 (53,4)
54 (58,1) B IV
4 (2.2) B 2 ( 2.3) B 2 (2,1) B-luokittelu
0,999
1
4 (2.2) B 2 (2,3) B-2 (2,1) B-2
55 (30,4)
27 (30,7)
28 (30,1) B 3
116 (64,1)
56 (63,6)
60 (64,5)
4
6 (3,3) B-3 (3,4)
3 (3,3) B Patologinen T luokitus
0,168
T1
17 (9,4)
12 (13,6) B 5 (5,4) B-T2
35 (19,3)
18 (20,5)
17 (18,3) B T3
119 (65,7)
55 (62,5) B 64 (68,8) B T4
10 (5,5) B-3 (3,4) B-7 (7,5) B Patologinen N asema
0,008
N negatiivinen
44 ( 24.3)
29 (33,0)
15 (16,1) B N positiivinen
137 (75,7)
59 (67,0)
78 (83,9) B Patologinen vaihe (pTNM)
0,026
I
26 (14,4)
17 (19,3) B 9 (9,7) B II
47 (26,0)
28 (31,8)
19 (20,4) B III
100 (55,2) B 41 (46,5)
59 (63,4) B IV
8 (4.4) B 2 (2,3)
6 (6,5)
129 181 potilasta (71,2%) oli kehittyneempi T vaiheessa sairaus (PT3 + PT4), ja 137 potilasta (75,7%) oli imusolmuke etäpesäke. Täysin potilaiden vaiheen I-IV olivat 26, 47, 100 ja 8 tapausta, vastaavasti.
P-mTOR ilmentymistä mahasyövässä
immunoväriäys p-mTOR oli sytoplasmaattinen ja osittain membranous. Kuvio 1 esittää edustavia esimerkkejä p-mTOR immunovärjäyksellä. Normaali mahalaukun limakalvo on negatiivinen p-mTOR. Niistä 181 potilasta, 93 (51,4%) oli p-mTOR-positiivisia kasvaimia. Kuva 1 Esimerkkejä p-mTOR immunovärjäyksellä. (A) Normaali mahalaukun limakalvo on negatiivinen p-mTOR (alkuperäinen suurennos x 200). (B) normaali mahan limakalvo on negatiivinen p-mTOR (alkuperäinen suurennos x 400) (C) Positiivinen ilmentymisen p-mTOR mahasyövän (alkuperäinen suurennos x 200). (D) negatiiviset ilmentymistä p-mTOR mahasyövän (alkuperäinen suurennos x 200).
Survival analyysi
Potilaat, joilla on p-mTOR positiivinen mahasyöpä osoittivat huomattavasti lyhyempi taudista vapaan ja yleisen eloonjäämisluvut kuin ne, joilla on p- mTOR negatiivinen mahasyöpä (DFS, 48,9% versus 30,1%, p = 0,006; OS, 51,1% versus 34,4%, p = 0,011; taulukko 2; kuvio 2A, B). Univariable analyysi paljasti, että elinaika laski myös korkeamman pT luokituksen (DFS, p = 0,001; OS, P = 0,005), imusolmuke etäpesäke (DFS, p < 0,0001; OS, P = 0,001) ja kehittyneiden pTNM vaiheessa (DFS, p < 0,001; OS, P = 0,001). Ei ollut yhdistyksen välillä DFS tai OS ja iästä, sukupuolesta tai kasvain size.Table 2 Univariable analyysi taudista vapaan ja eloonjäämiseen mahasyövän


Tautivapaa suivival
Kaiken survival

Characteristic

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

Age(y)
0,343
0,583
< 60
95
1,00
1,00
≥60
86
0,834
+0,573-+1,214
0,898
,611-+1,320
Sex
. 662
0,950
Mies
129
1,00
1,00
Female
52
0,909
0,591-1,396
0,986
,639-+1,521
Tuumorin koko
0,151
0,232
≤4 cm
63
1,00
1,00
> 4 cm
118
1.345
0,897-2,016
1,287
,851-+1,945
pT vaiheessa
0,001
0,005
pT1
17
1,00
1,00
pT2
35
1.549
0.558-4.301
.401
1.535
0.553-4.264
.411
pT3
119
3.546
1.437-8.750
.006
3.237
1.310-8.001
.011
pT4
10
4.738
1.547-14.506
.006
4.068
1.289-12.836
.017
pN vaihe
< 0,0001
0,001
Negative
44
1,00
1,00
Positiivinen
137
2,617
1,538-4,451
2,389
1.401- 4,075
pTNM vaiheessa
< 0,0001
0,001
I
26
1,00
1,00
II
47
2.920
1.197-7.121
.018
2.860
1.173-6.973
.021
III
100
4.955
2.152-11.409
< 0,0001
4,455
+1,930-10,281
< 0,0001
IV
8
7,369
+2,470-21,981
< 0,0001
6.103
+1,965-18,957
0,002
p-mTOR
0,008
0,013
Negative
88
1,00
1,00
Positiivinen
93
1.667
1,146-2,454
1,644
1,112-2,430
Kuvio 2 Kaplan-Meier eloonjäämistodennäköisyys. Potilaat, joilla on p-mTOR positiivisia verrokkeja lyhyempi kokonaiselinaikaa (A) ja taudista vapaan eloonjäämisen (B) hinnat kuin p-mTOR negatiivinen ilmaus. (P = 0,011 ja p = 0,006, vastaavasti).
Monimuuttujatapauksessa analyysi, imusolmuke etäpesäke (DFS, p = 0,018; OS, P = 0,038) ja pT vaiheessa (DFS, p = 0,018; OS, P = 0,046) olivat merkittäviä itsenäisiä ennustetekijä varten elinaika. Lisäksi monimuuttuja-analyysi (taulukko 3) osoitti myös suuntaus korrelaatio p-mTOR ilmaisun ja laski selviytymistä, mutta suuntaus ei ollut tilastollisesti merkitsevä (DFS, p = 0,059; OS, P = 0,070) .table 3 Monimuuttujalähettimet cox regressioanalyy- taudista vapaan ja yleisen eloonjääneiden


Tautivapaa suivival
Kaiken survival

Factors

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

p-mTOR
0.059
0,070
Negative
88
1,00
1,00
Positiivinen
93
1,452
0,986-2,138
1.443
0,970-2,147
Infiltroivat syvyys
0,018
0,046
pT1
17
1,00
1,00
pT2
35
1.050
0.366-3.016
0.928
1.078
0.375-3.101
0.889
pT3
119
2.251
0.867-5.845
0.096
2.146
0.823-5.595
0.118
pT4
10
2.926
0.920-9.305
0.069
2.616
2.616-8.580
0.113
Lymph solmu tila
0,018
0,038
Negative
44
1,00
1,00
Positiivinen
137
1,981
1,981-3,488
1,828
1,034-3,233
RAD001 estää lisääntymistä ja ehkäisee p70S6K fosforylaatio
tutkimiseksi vaikutuksia RAD001 proliferaatioon ihmisen mahasyövän solulinjoissa BGC823 ja AGS, suoritimme proliferaatiomäärityksillä 48 tunnin altistus RAD001. Tämän seurauksena, RAD001 tuottaa merkittävää estoa molemmissa solulinjoissa annoksesta riippuvalla tavalla. (Kuvio 3A). Kuvio 3 (A) RAD001 estää proliferaatiota mahalaukun syöpäsoluja. Mahasyöpä soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla RAD001, että läsnä oli 10% FBS: ää 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä. (B) fosforylaatio p70S6K väheni huomattavasti annoksesta riippuvalla tavalla sekä AGS ja BGC823 solujen käsittely RAD001. Molemmat solulinjat inkuboitiin kasvava annos RAD001 48 tunnin ajan, solulysaatit altistettiin Western blot-analyysi, jossa fosforyloitu p-S6K ja S6K vasta-aineita.
Western blot kokeet suoritettiin RAD001 0, 5, 10, 20 uM 48 h. P70s6 kinaasi on tärkeä alavirtaan tavoite mTOR ja sen mTOR-riippuvaisen fosforylaation avulla käännös ribosomien proteiinien. Tutkimme fosforylaatiota tilan alavirran kohde p70S6K immunoblottauksella. Kuten kuviossa 3B on esitetty, olemme huomanneet, että hoito molemmissa solulinjoissa BGC823 ja AGS kanssa RAD001 merkittävästi estää fosforylaation p70s6k annoksesta riippuvalla tavalla.
RAD001 indusoi G0 /G1 solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin mahasyövän soluissa
Voit selvittää tukahduttaminen soluproliferaatioon johtuivat G0 /G1-vaiheen pysähtymisen tai apoptoosin, solusyklin jakautuminen analysoitiin FCM. Kuva 4 osoitti, että hoito BGC823 solujen kanssa RAD001 48 tuntia johti vankan G1 pidätyksen ja edistää apoptoosin. Kun yhä annoksen RAD001, enemmän ja enemmän soluja pysyivät G1-vaiheessa, kun taas solusyklin eteneminen S faasi laskussa (kuvio 4A). RT-PCR-analyysi paljasti RAD001 annosriippuvaisesti vähensi mRNA-tasolla sykliini D1 ja C-myc (kuvio 4B). Kuva 4 RAD001 indusoi solukierron pysähtymisen ja apoptoosin BGC823 soluissa. (A) BGC823 solut altistettiin eri pitoisuuksia RAD001 48 tuntia. (B) RNA uutettiin soluista. Sykliini D1 ja C-myc-ekspression taso havaittiin RT-PCR: llä, aktiini latauskontrollina. (C) soluja inkuboitiin 48 tuntia merkityillä annoksilla RAD001 ennen värjäystä anneksiini V-FITC: llä. Prosenttiosuudet apoptoottisten solujen näytetään. (D) Soluja inkuboitiin 48 tuntia merkityillä annoksilla RAD001. Solut kerättiin, hajotettiin ja suoritettiin Western blot-analyysi, jossa Bcl-2 ja p53-vasta-aineita. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina.
Anneksiini-V-määritykset osoittivat, että RAD001 merkittävästi indusoi apoptoosia BGC823 soluissa. Apoptoosin lisääntyminen korko analysoitiin FCM kasvaessa annoksen (kuva 4C). Western blot-analyysi osoitti RAD001 annosriippuvaisesti vähentää proteiinin taso Bcl-2 ja lisätä proteiinin taso p53 (kuvio 4D). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin AGS-soluissa (tietoja ei esitetty).
Keskustelu
nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) löydettiin 1990-luvun alussa s tutkittaessa vaikutusmekanismi rapamysiinin, joka on alun perin löydetty kuin antifungaalisen aineen ja myöhemmin tunnustettu syöpää ominaisuudet [27]. Koska Ser /Thr proteiinikinaasi, mTOR on keskeinen rooli solujen kasvun ja homeostaasin [28]. MTOR-proteiini muodostaa kompleksin adaptoriproteiineja, mTORC1 (nisäkkään rapamysiinin kohde monimutkaisten 1) ja mTORC2. Aktivointi mTORC1 säätelee solujen kasvua säätelemällä proteiinisynteesiä, ribosomien biogeneesiä ja autophagy [29]. MTORC2 polku on keskeinen osa aktivoimiseksi Akt, kuten PDK1 (3-fosfoinositidi-riippuvainen proteiinikinaasi 1) ja PI3K, mahdollinen lääke kohde syöpien, joissa on Akt purkamista [26].
Nykyisessä tutkimuksessa, havaitsimme, että 93 (51,4%) potilaista oli positiivinen ilmaus p-mTOR 181 mahalaukun syöpäpotilailla. Yhdenmukainen tuloksemme, toisessa tutkimuksessa, johon osallistui 1072 potilasta, ilmaus p-mTOR on 46,5% [30].
Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet ennustetekijöiden merkitystä p-mTOR ilme. Herberger et ai [18]. tunnistettu p-mTOR olevan itsenäistä ennustetekijä kuolemalle potilailla, joilla on sappiteiden adenokarsinooma. Heidän tutkimuksessaan kokonaiselossaoloaika oli huomattavasti lyhyempi, jos potilaalla on p-mTOR-kasvaimissa verrattuna potilailla, joilla on p-mTOR-syöpäkasvain (P = 0,004). Mahasyövän, Yu et ai. arvioidaan ekspressio p-mTOR in 1072 mahasyöpäpotilaista käyttäen kudosta microarray, jotka osoittavat yli-ilmentyminen p-mTOR oli itsenäinen ennustetekijä [30]. Kuitenkin tutkimuksessa mukana 109 potilasta, joilla mahalaukun adenokarsinooman joille tehtiin radikaali gastrectomy [31], Murayama et ai. löydetty ole sytoplasminen p-mTOR eikä ydin- p-mTOR oli riippumaton ennustetekijä, vaikka ne tunnistettiin sytoplasminen p-mTOR ilmentyminen oli yhteydessä heikompaan selviytymisen ja korreloi syvyys kasvaimen invaasio, imusolmukkeiden ja kasvaimen vaiheessa. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme vahvistaneet, että pT luokittelu ja imusolmuke tila ovat riippumattomia prognostisia indikaattori kliinistä tulosta mahalaukun syöpäpotilaiden monimuuttuja analyysit. Kuitenkin, koska useimmat potilaista on paikallisesti edennyt sairaus, muu toissijainen ennustetekijöitä markkereita, erityisesti p-mTOR, voi olla hyötyä [13]. Tuloksemme osoittavat selvästi, että p-mTOR ilmentyminen korreloi voimakkaasti ottaen heikkoa ja taudista vapaan eloonjäämisen univariable analyysien kanssa suuntaus kohti korrelaatio Monimuuttuja analyysien.
Yhdenmukainen nykyisen tutkimuksen, useat tutkimukset ovat myös todenneet olevan antiproliferatiivisia vaikutuksia mTOR-inhibiittorit mahalaukun syöpäsoluja. Esimerkiksi Lang et ai [21]. tunnistettu rapamysiini voi estää mahalaukun syöpäsolujen kasvua sekä ihonalaisen kasvaimen malli ja kokeellisessa mallissa. Niiden tulokset korostavat sopivuutta mTOR-inhibiittorit voidaan käyttää antiangiogeenisen yhteydessä terapiaan mahasyövän.
Kuitenkin RAD001 on uusi mTOR inhibiittorin syöpälääke. Mekanismi noin RAD001 mahasyövän ei ole selvä. Cejka et ai. osoitti antiangiogeeninen aktiivisuus RAD001 yhdistettynä suuren annoksen syklofosfamidia paljasti synergististä antituumoriaktiivisuus mahasyövän [32]. He ovat myös havainneet, että RAD001 vähentynyt proliferaatio ja heikennettyä tuotantoa HIF-1α sekä VEGF mahasyövän soluissa in vitro [33]. Nykyisessä tutkimuksessa, meidän tiedot osoittivat, että RAD001-terapia heikennetty fosforylaatioon p70S6K ja merkittävästi inhiboivat mahasyövän soluihin solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin in vitro. Löysimme RAD001 indusoi G0 /G1 vaiheessa pidätyksen, joka liittyy pienentynyt sykliini D1 ja C-myc. Lisäksi osoitimme, että ensimmäistä kertaa, että RAD001 uutena mTOR-estäjä annosriippuvaisesti aiheuttaman apoptoosin mahasyövän soluissa anneksiini V määrityksissä. Tämä vaikutus voidaan sanelee Matkapuhelinyhteydessä ja loppupään tavoitteita lukien P53 ja Bcl-2. Nämä havainnot saattavat selittää tarkemmin tehoa RAD001.
Päätelmä
Yhteenvetona, teimme systemaattinen tutkimus mTOR mahasyövän, osoittaa suhteet ilmaisu ennusteeseen arvo aktivoitua mTOR (p-mTOR) in vivo, vaikutusta RAD001 ja osa mekanismien mahasyövän soluissa in vitro. Meidän havainnot osoittivat, että p-mTOR toimisi mahdollisena biologinen markkeri tunnistaa alaryhmään mahasyövän potilaiden huonoon ennusteeseen. Se osoitti myös, että RAD001 oli lupaava aine hoidettaessa mahalaukun syövän indusoivien solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin säätelyssä alaspäin ilmentymisen C-myc, CyclinD1 ja Bcl-2, up-säätelevät ilmentymistä P53. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään roolin aktivoitumisen mTOR ja lopulta ehdottamaan mTOR kuin konkreettinen tavoite mahalaukun syövän hoidossa.
Huomautus
Grant Support: tukemana National High Technology tutkimus ja kehitys (863) ohjelma Kiina
Notes
Da-zhi Xu Qi-Rong Geng vaikuttanut yhtä tähän työhön.
julistukset
Kiitokset
työtä tukivat National High Technology tutkimus ja kehitys (863) ohjelma Kiina. Kirjoittajat arvostavat erinomaista teknistä apua Li-hui Wang, Fei-Meng Zheng, Zheng Zhi Zou, Yan Zhang ja Zi Jie Long.
Kirjoittajien alkuperäinen toimitti asiakirjat kuville
Alla linkit tekijöiden alkuperäinen toimitti asiakirjat kuville. 12885_2009_2335_MOESM1_ESM.pdf Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 1 12885_2009_2335_MOESM2_ESM.pdf Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 2 12885_2009_2335_MOESM3_ESM.pdf Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 3 12885_2009_2335_MOESM4_ESM.pdf Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 4 Kilpailevat edut
Kirjoittajat ilmoittavat, että ne ei ole kilpailevia intressejä.

• Prognostisia vaikutus etnisyyden mahalaukun ja ruokatorven syöpä: väestön perustuva kokemus British Columbia, Canada
• Ennustavien tekijöiden identifiointia ja kirurgiset merkintöjen mahalaukun metastasoivaa cancer