Attivato bersaglio della rapamicina nei mammiferi è un potenziale bersaglio terapeutico in cancer

gastrica Attivato bersaglio della rapamicina nei mammiferi è un potenziale target terapeutico nel carcinoma gastrico
Abstract
sfondo
Il bersaglio della rapamicina nei mammiferi (mTOR) svolge un ruolo chiave nella la crescita cellulare e l'omeostasi. Lo scopo del nostro studio attuale è quello di indagare l'espressione di mTOR attivato (p-mTOR) in pazienti affetti da cancro gastrico, il loro significato prognostico e l'effetto di inibizione di RAD001 sulla crescita del tumore e per determinare se l'inibizione mirata di mTOR potrebbe essere una potenziale strategia terapeutica per il cancro gastrico.
Metodi
L'espressione di p-mTOR è stata rilevata in esemplari di 181 tumori gastrici che sono stati sottoposti a resezione radicale (R0) mediante immunoistochimica. La correlazione di espressione p-mTOR alle caratteristiche clinico-patologiche e la sopravvivenza del cancro gastrico è stato studiato. Abbiamo inoltre determinato l'effetto di inibizione di RAD001 sulla crescita del tumore utilizzando linee di cellule di cancro gastrico umano BGC823 e AGS.
Risultati
Immunocolorazione per p-mTOR è stato positivo nel 93 di 181 (51,4%) dei tumori gastrici, strettamente correlato con la linfa lo stato del nodo e lo stadio pTNM. I pazienti con p-mTOR positivi hanno mostrato significativamente più breve sopravvivenza libera da malattia (DFS) e la sopravvivenza globale tariffe (OS) rispetto a quelli con tumori p-mTOR-negativi in ​​analisi univariata, e c'era una tendenza verso una correlazione tra l'espressione p-mTOR e sopravvivenza in analisi multivariata. RAD001 marcatamente inibito la proliferazione dose-dipendente delle cellule di carcinoma gastrico umano dall'espressione down-regolazione di p70S6K, p-p70S6K, c-Myc, CyclinD1 e Bcl-2, up-regolazione dell'espressione di P53
. Conclusioni
in gastrica cancro, p-mTOR è un potenziale bersaglio terapeutico e RAD001 è stato un agente di trattamento promettente che induce arresto del ciclo cellulare e l'apoptosi da down-regolazione dell'espressione di c-myc, CyclinD1 e Bcl-2, up-regolazione dell'espressione di P53.
sfondo
il carcinoma gastrico è il quarto cancro più comune e la seconda causa di morte per cancro in tutto il mondo, di cui 1 milione di nuovi casi ogni anno in tutto il mondo [1]. Circa il 60% dei nuovi casi di cancro gastrico si verificano in Asia orientale [2], in particolare in Cina. La resezione chirurgica è il trattamento più efficace per il cancro gastrico e l'efficacia della chemioterapia rimane limitata [3]. Molti studi hanno indicato che la profondità di invasione e il numero di linfonodi metastatici sono più importanti potenti predittori di sopravvivenza per pazienti affetti da cancro gastrico [4, 5]. Ad esempio, in studi precedenti [6, 7], abbiamo trovato rapporto linfonodo positivo è un indicatore prognostico indipendente dopo la resezione D2 e ​​chemioterapia intraperitoneale può essere utile per pazienti affetti da cancro gastrico. Tuttavia, un passo fondamentale verso il miglioramento esito clinico sta nella maggiore comprensione del comportamento biologico del tumore, che può aiutare a individuare i possibili bersagli per la terapia individuale [8, 9].
Negli ultimi anni, molecolarmente approcci per il trattamento a base di cancro gastrico è stato dato grande preoccupazione. Diversi articoli hanno descritto alcuni potenziali bersagli molecolari per la terapia del cancro gastrico, come ad esempio il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) [10-13], fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) [14], recepteur d'origine Nantais (RON) [15 ].
Il bersaglio della rapamicina nei mammiferi (mTOR) è un nuovo bersaglio molecolare potenziale per la terapia antitumorale. La sua espressione è stata dimostrata in varie linee cellulari e campioni tumorali, come le neoplasie del fegato [16], il cancro al seno [17], l'adenocarcinoma del tratto biliare [18], e il cancro del collo dell'utero [19, 20]. Questi studi hanno dimostrato che l'espressione di mTOR è stata associata con una scarsa prognosi clinica. Lang et al [21]. hanno anche osservato attivazione di mTOR nel cancro gastrico umano in vitro e in vivo. Hanno indicato mTOR è spesso attivato nel carcinoma gastrico umano. Recentemente, un derivato biodisponibile per via orale della rapamicina, RAD001 (everolimus; Novartis Pharma AG), è stato sviluppato. Uno studio di fase III trattamento rivelato con everolimus prolunga la sopravvivenza libera da progressione nei pazienti con carcinoma renale metastatico che avevano progredito in altre terapie mirate [22]. RAD001 ha anche dimostrato di inibire la proliferazione di crescita delle cellule tumorali in alcuni carcinomi [23, 24]. Ma il ruolo di RAD001 in gastrica cellule di cancro non è chiaro.
Gli obiettivi di questo studio sono stati di analizzare ulteriormente le relazioni l'espressione mTOR con il valore prognosi di attivazione mTOR (p-mTOR), l'effetto del RAD001 sulla crescita e del ciclo cellulare delle cellule di cancro gastrico umano in vitro e determinare se il cancro gastrico è un buon candidato per la terapia bersaglio con inibitori di mTOR.
Metodi
pazienti studiati
Questo studio retrospettivo consisteva di 181 pazienti sottoposti a resezione radicale ( R0) per istologicamente confermata carcinoma gastrico da Cancer center di Sun Yat-sen University tra il gennaio 1997 e il dicembre 2002. Tutti i pazienti con istologicamente confermato adenocarcinoma dello stomaco aveva subito sia prossimale gastrectomia parziale, distale gastrectomia parziale o gastrectomia totale. l'approvazione etica è stato ottenuto da Sun Yat-sen University Cancer Center comitato etico di ricerca.
Quelli con adeguato materiale istologico e dati clinici completi erano eleggibili per l'inclusione. I criteri di ammissibilità incluso anche istologicamente confermato R0 resezione, che è stata definita come assenza di tumore residuo macroscopica e microscopica e il tempo di sopravvivenza postoperatoria ≥ 6 mesi. I pazienti con metastasi a distanza e il carcinoma del moncone gastrico dopo resezione per malattia benigna sono stati esclusi dallo studio. La ragione è che la sopravvivenza dei pazienti con metastasi a distanza è spesso influenzata da molti altri fattori, come la chemioterapia preoperatoria o ostruzione
Tutti i pazienti avevano follow-up dopo l'intervento chirurgico a 6 a 12 intervalli di un mese.; la data finale di follow-up è stato dicembre 2008. follow-up mediano periodo era di 50 (media: 50.66; tra 10 e 128) mesi per tutti i pazienti, e 74 mesi (media: 72.80; intervallo 27-128) per la sopravvivenza. La durata mediana del follow-up era di 40 (media: 43.71; gamma 11-125) per i pazienti che avevano tumori del p-mTOR espressione positiva, e 60,5 mesi (media: 58.01; intervallo 10-128) per espressione negativa. La sopravvivenza è stata calcolata dalla data della diagnosi fino alla data di morte o all'ultimo follow-up.
Raccolta dei campioni e Immunocolorazione per p-mTOR
Tutti i campioni tumorali sono stati ottenuti da tumori gastrici chirurgicamente asportati prima della terapia adiuvante. , blocchi di tessuto inclusi in paraffina fissati in formalina sono stati conservati a temperatura ambiente identificato da un numero di identificazione. Cinque-micron di spessore sezioni di tessuto sono stati tagliati dai blocchi di paraffina, deparaffinate in xilene e reidratate. recupero antigenico è stato elaborato con citrato di sodio. I vetrini sono stati quindi incubati in 0,3% H 2O 2 per 10 min, e bloccato in 1% di albumina di siero bovino per 60 minuti seguito da un anticorpo monoclonale di coniglio specifico per p-mTOR (fosfo-mTOR, Ser2448, 49F9; Cell Signaling Technology) a 4 ° C per una notte, e poi colorati con 3,3-diaminobenzidina. Dopo la visualizzazione di immunoreattività, le sezioni sono state contrastate con ematossilina e poi montati.
Valutazione della colorazione immunoistochimica
Le sezioni immunostained sono stati valutati e tessuti da adenocarcinomi prostatici umani serviti come controllo positivo. Secondo i criteri descritti di recente per l'espressione Valutazione mTOR, intensità di colorazione è stata determinata come 0 (assente), 1 (debole), e 2 (forte) e livelli di espressione di biomarcatori sono stati semiquantified con un punteggio di immunoistochimica (range 0-200) calcolato moltiplicando intensità di colorazione con la percentuale di cellule tumorali positive [18]. I pazienti con un punteggio di immunoistochimica ≤ 20 sono stati considerati come p-mTOR-negativi e quelli con un punteggio di > 20 come p-mTOR-positive. Tutte le diapositive sono stati valutati indipendentemente da due patologi indipendenti senza alcuna conoscenza di informazioni cliniche dei pazienti. Quando i pareri dei due valutatori erano diverse, un accordo è stato raggiunto da una attenta discussione
linee cellulari e condizioni di coltura
linee umane di cellule di cancro gastrico BGC823 e AGS (numero ATCC: CRL-1739)., Che sono scarsamente differenziati sono stati regali da Peking University School of Oncology (Pechino, Repubblica Popolare cinese.) [25]. Le linee cellulari sono state mantenute in terreno RPMI 1640 (Invitrogen) supplementato con siero 10% fetale bovino (Hyclone), penicillina (100 unità /ml) e streptomicina (100 unità /ml) a 37 ° C e 5% CO2 in un incubatore umidificato .
saggio vitalità cellulare
Per analizzare l'effetto di RAD001 in cellule di cancro gastrico umano, vitalità cellulare è stata determinata mediante saggio MTT. RAD001 è stata fornita da Novartis Pharma (Basilea, Svizzera). Per il test di vitalità, cellule logaritmicamente crescita sono state stimolate con varie dosi di RAD001 (0, 5, 10, 20 e 40 mM). Alla fine del periodo di coltura, 20 ml di colorante tetrazolio 3- (4,5-dimetiltiazolo-2-il) -2,5- difeniltetrazolio bromuro (MTT) soluzione (Sigma, USA) a 0.2 mg /ml in PBS è stato aggiunto , la densità ottica a 490 nm (OD490) è stata determinata utilizzando un lettore enzyme-linked test immunoenzimatico (ELISA). I valori medi sono stati calcolati da culture triplicato. analisi del ciclo cellulare

Le cellule sono state raccolte e fissate in etanolo al 70% durante la notte a 4 ° C. Le cellule sono state poi lavate e colorate con ioduro di propidio (PI) (Sigma) 5 mg /mL. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce, le cellule sono state analizzate mediante citometria a flusso utilizzando un Becton Dickinson FACScan. V saggio
annessina
I campioni sono stati lavati con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e con Annessina V-fluoresceina isotiocianato (FITC) e colorazione PI per la determinazione dell'esposizione fosfatidilserina sulla membrana plasmatica esterna. Dopo incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce, i campioni sono stati quantificati mediante citometria a flusso, utilizzando un Becton Dickinson FACScan.
Trascrizione inversa-PCR
RNA totale è stato estratto utilizzando il metodo TRIzol. RNA è stato inversamente trascritto usando un kit disponibile in commercio (Fermentas, Stati Uniti d'America). La miscela (25 microlitri totale) per PCR consisteva di 0,5 microlitri cDNA, 0,5 U Taq DNA polimerasi, 2,5 ml di 10 × tampone PCR, 2,5 mM dNTP miscela, e 50 pM senso e antisenso primers ciascuno. CyclinD1 e C-myc sono stati analizzati mediante seguenti primer: CyclinD1 5'GAACAGAAGTGCGAGGAGGAG3 'e invertire 5'AGGCGGTAGTAGGACAGGAAG3 innesco'; C-myc, 5 'CGAGCTGCTGGGAGGAGACAT3' e 5 'AGCCGCCCACTTTTGACA GG3' Actina:. 5'GGCACCCAGCACAATGAA 3 'e 5' TAGAAGCATTTGCGGTGG 3 '
lisato e Western blot
cellule sono state lisate in tampone di lisi e la concentrazione di proteina è stata determinata con il metodo della tintura Bradford (Bio-Rad Laboratories). Uguali quantità di estratto cellulare sono stati sottoposti a SDS-PAGE e trasferite su membrana PVDF (Bio-Rad). Analisi Western Blot sono state fatte con i vari anticorpi primari specifici. Gli anticorpi che riconoscono fosfo-p70S6K (Thr389), p70S6K, fosfo-mTOR (Ser2448), Bcl-2 e p53 erano di segnalazione cellulare analisi
. Statistica
L'end point primario dello studio era la sopravvivenza globale (OS). È stato definito come il periodo tra il momento della chirurgia e morte. La sopravvivenza libera da malattia (DFS) è stato il tempo che intercorre tra il momento dell'intervento chirurgico e la recidiva o di morte tumorale-correlati. E 'stato analizzato come end point secondario. L'associazione di espressione p-mTOR con varie caratteristiche clinicalopathologic è stato analizzato utilizzando il test chi-quadrato. la sopravvivenza cumulativa e la sopravvivenza libera da malattia sono stati stimati con il metodo di Kaplan-Meier. Il log-rank test è stato utilizzato per valutare la significatività statistica delle differenze tra le curve di sopravvivenza. Un modello di Cox proporzionale di rischio (indietro, graduale) per l'analisi multivariata è stata applicata per i fattori che hanno raggiunto un significato nell'analisi univariata. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando il software SPSS (versione 13 per Windows, SPSS, Chicago, IL). Le differenze a P < .05 Sono stati considerati statisticamente significativi
. Risultati
caratteristiche clinico-patologiche
Un totale di 181 pazienti sono stati arruolati in questo studio. L'età media era di 59 anni (range 23-83 anni). Le caratteristiche clinico-della popolazione studio sono riassunti nella Tabella 1. 129 pazienti erano maschi e 52 femmine. 77 di 181 tumori (42.5) proveniva dalla parte superiore dello stomaco, 74 di 181 pazienti (40,9%) erano dalla parte inferiore dello stomaco, ei tumori rimanenti erano dal corpo centrale e tutta dello stomaco. 118 di 181 (65,2%) le dimensioni del tumore del paziente erano > 4 cm, e 63 (34,8%) erano ≤ 4 cm. In conformità con i criteri dell'Organizzazione Mondiale della Sanità, 4 di 181 tumori (2,2%) erano ben differenziati, 55 di 181 tumori (30,4%) sono stati moderatamente differenziato, 116 erano scarsamente differenziato, e 6 erano indifferenziata. Post-operatoria fase chirurgica è stato classificato in base alla /classificazione AJCC 2002 UICC [26] .table 1 correlazione clinicopatologico di espressione p-mTOR nel carcinoma gastrico
Fattori
Tutti i pazienti
No. dei pazienti (%)
P

N
= 181 (%)
mTOR negativo
mTOR positivo

Age (y)
.256
< 60
95 (52,5)
50 (56,8)
45 (48,4)
≥60
86 (47,5)
38 (43,2)
48 (51,6)
Sex
0,926
Maschio
129 (71,3)
63 (71,6)
66 (71,0)
femminile
52 (28,7)
25 (28,4)
27 (29,0) sito ufficiale
0,053
Alto
77 (42,5)
33 (37,5)
44 (47,3)
Medio
28 ( 15.5)
10 (11.4)
18 (19,4)
inferiore
74 (40,9)
43 (48,9)
31 (33,3)
Diffuse
2 ( 1.1) Pagina 2 (2.3)
0 (0.0)
Le dimensioni del tumore
.172
≤ 4 cm
63 (34,8)
35 (40,0)
28 (30,1)
> 4 cm
118 (65,2)
53 (60,0)
65 (69,9)
tipo Borrmann
0,398
fase iniziale Pagina 7 (3.9) Pagina 6 ( 6.8)
1 (1.1)
I Pagina 4 (2.2) Pagina 2 (2.3) Pagina 2 (2.1)
II
65 (35,9)
31 ( 35.2)
34 (36,6)
III
101 (55,8)
47 (53,4)
54 (58,1)
IV Pagina 4 (2.2) Pagina 2 ( 2.3) Pagina 2 (2.1)
classificazione
.999
1 4 (2.2) Pagina 2 (2.3) Pagina 2 (2.1) 2
55 (30.4)
27 (30,7)
28 (30.1) 3
116 (64,1)
56 (63,6)
60 (64.5) 4
6 (3.3) Pagina 3 (3.4) Pagina 3 (3.3)
patologica T classificazione
.168
T1
17 (9.4)
12 (13,6)
5 (5.4)
T2
35 (19,3)
18 (20,5)
17 (18,3)
T3
119 (65,7)
55 (62,5)
stato di 64 (68,8)
10 (5.5) Pagina 3 (3.4) Pagina 7 (7.5) T4
patologica N
.008
N negativo
44 ( 24.3)
29 (33,0)
15 (16.1)
N positivo
137 (75,7)
59 (67,0)
78 (83,9)
patologica fase (pTNM)
.026
I
26 (14,4)
17 (19,3)
9 (9.7)
II
47 (26,0)
28 (31,8)
19 (20,4)
III
100 (55,2)
41 (46,5)
59 (63,4)
IV Pagina 8 (4.4) Pagina 2 (2.3)
6 (6.5)
129 dei 181 pazienti (71,2%) hanno avuto la malattia più avanzato stadio di T (PT3 + PT4), e 137 pazienti (75,7%) avevano metastasi linfonodali. Totalmente pazienti di stadio I-IV sono stati 26, 47, 100 e 8 casi, rispettivamente.
P-mTOR espressione nel carcinoma gastrico
Immunocolorazione di p-mTOR era citoplasmatica e in parte membranosa. La Figura 1 mostra esempi rappresentativi di p-mTOR immunocolorazione. La mucosa gastrica normale è negativo per p-mTOR. Dei 181 pazienti, 93 (51,4%) sono stati i tumori p-mTOR-positivi. Figura 1 Esempi di p-mTOR immunocolorazione. (A) La mucosa gastrica normale è negativo per p-mTOR (ingrandimento originale × 200). (B) La mucosa gastrica normale è negativo per p-mTOR (ingrandimento originale × 400) (C) espressione positiva di p-mTOR nel cancro gastrico (ingrandimento originale × 200). (D) l'espressione negativa di p-mTOR nel carcinoma gastrico (ingrandimento originale × 200). L'analisi di sopravvivenza

pazienti con p-mTOR carcinoma gastrico positivo ha mostrato significativamente più breve libera da malattia e la sopravvivenza globale rispetto a quelli con p- mTOR cancro gastrico negativo (DFS, il 48,9% contro il 30,1%; p = 0,006; OS, 51,1% contro 34,4%; p = 0,011; Tabella 2, Figura 2A, B). analisi univariata ha rivelato che il tempo di sopravvivenza è diminuita con una maggiore pT classificazione (DFS, p = .001; OS, P = .005), metastasi linfonodali (DFS, p < 0001; OS, P = .001) e pTNM avanzata fase (DFS, p < .001; OS, P = .001). Non c'era alcuna associazione tra DFS o OS e l'età, il sesso o tumore size.Table 2 analisi univariata di libera da malattia e la sopravvivenza globale nel cancro gastrico


libera da malattia suivival
complesso survival

Characteristic

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

Age(y)
0,343 0,583

< 60
95
1.00
1.00
≥60
86
0,834
0,573-1,214
0.898
0,611-1,320
Sex
. 662
0,950
Maschio
129
1.00
1.00
femminile
52
0.909
0,591-1,396
0,986
0,639-1,521
dimensioni del tumore
0,151 0,232

≤4 cm
63
1.00
1.00
> 4 cm
118
1.345
0,897-2,016
1.287
0,851-1,945
stadio pT
.001 .005

pT1
17
1.00
1.00
pT2
35
1.549
0.558-4.301
.401
1.535
0.553-4.264
.411
pT3
119
3.546
1.437-8.750
.006
3.237
1.310-8.001
.011
pT4
10
4.738
1.547-14.506
.006
4.068
1.289-12.836
.017
pN fase
< .0001
.001
Negativo 44
1.00
1.00
positivo
137
2.617
1,538-4,451
2.389
1.401- 4.075
pTNM fase
< .0001
.001
I
26
1.00
1.00
II
47
2.920
1.197-7.121
.018
2.860
1.173-6.973
.021
III
100
4.955
2.152-11.409
< .0001
4,455
1,930-10,281
< .0001
IV
8
7,369
2,470-21,981
< .0001
6.103
1,965-18,957
.002
p-mTOR
.008 .013

negativo
88
1.00
1.00
positivi
93
1.667
1,146-2,454
1.644
1,112-2,430
Figura 2 Kaplan-Meier stima della probabilità di sopravvivenza. I pazienti con p-mTOR positivi hanno mostrato significativamente più breve sopravvivenza globale (A) e tassi rispetto a quelli con p-mTOR espressione negativa sopravvivenza libera da malattia (B). (P = 0,011 ep = 0,006, rispettivamente)
All'analisi multivariata, metastasi linfonodali (DFS, p = .018; OS, P = .038). E lo stadio pT (DFS, p = .018; OS, P = .046) erano significativo fattore prognostico indipendente per la sopravvivenza. Inoltre, l'analisi multivariata (Tabella 3) ha anche indicato una tendenza verso una correlazione tra l'espressione p-mTOR e diminuito la sopravvivenza, ma la tendenza non ha raggiunto la significatività statistica (DFS, p = 0,059; OS, P = .070) .table 3 L'analisi multivariata di regressione di Cox di libera da malattia e la sopravvivenza globale


Nel complesso suivival
libera da malattia survival

Factors

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

p-mTOR
0,059 0,070

negativo
88
1.00
1.00
positivo
93
1.452
0,986-2,138
1.443
0,970-2,147
infiltrante profondità
0,018 0,046

pT1
17
1.00
1.00
pT2
35
1.050
0.366-3.016
0.928
1.078
0.375-3.101
0.889
pT3
119
2.251
0.867-5.845
0.096
2.146
0.823-5.595
0.118
pT4
10
2.926
0.920-9.305
0.069
2.616
2.616-8.580
0.113
Lymph lo stato del nodo
0,018 0,038

negativo
44
1.00
1.00
positivo
137
1.981
1,981-3,488
1.828
1,034-3,233
RAD001 inibisce la proliferazione e impedisce p70S6K fosforilazione
per studiare gli effetti del RAD001 sulla proliferazione delle gastrico linee cellulari tumorali umane BGC823 e AGS, abbiamo eseguito saggi di proliferazione con l'esposizione di 48 ore a RAD001. Come risultato, RAD001 genera una significativa inibizione su entrambe le linee cellulari in modo dose-dipendente. (Figura 3A). Figura 3 (A) RAD001 inibisce la proliferazione delle cellule di cancro gastrico. cellule di cancro gastrico sono state trattate con le concentrazioni indicate di RAD001 in presenza di 10% FBS per 48 h. La vitalità cellulare è stata valutata mediante test MTT. (B) La fosforilazione di p70S6K era significativamente diminuita in modo dose-dipendente sia AGS e BGC823 cellule dal trattamento con RAD001. Entrambe le linee cellulari sono state incubate con l'aumentare della dose di RAD001 per 48 ore, lisati cellulari sono stati sottoposti ad analisi Western Blot con anticorpi fosforilati p-S6K e S6K.
Esperimenti di Western Blot sono stati effettuati con RAD001 a 0, 5, 10, 20 micron per 48 h. P70S6 chinasi è un importante obiettivo a valle di mTOR e della sua fosforilazione mTOR-dipendente permette la traduzione delle proteine ​​ribosomiali. Abbiamo esaminato lo stato di fosforilazione di valle p70S6K bersaglio mediante immunoblotting. Come mostrato nella Figura 3B, abbiamo trovato che il trattamento di entrambe le linee cellulari BGC823 e AGS con RAD001 impedire significativamente la fosforilazione di p70S6K in modo dose-dipendente.
RAD001 induce arresto del ciclo cellulare G0 /G1 e apoptosi nelle cellule di cancro gastrico
per determinare se la soppressione di proliferazione cellulare sono stati a causa di G0 /arresto G1-fase o apoptosi, la distribuzione del ciclo cellulare è stato analizzato da FCM. Figura 4 ha mostrato che il trattamento delle cellule BGC823 di con RAD001 per 48 ore ha provocato un robusto arresto G1 e promosso l'apoptosi. Con l'aumentare della dose di RAD001, sempre più le cellule sono rimasti in fase G1, mentre la progressione del ciclo cellulare in fase S stava diminuendo (Figura 4A). RT-PCR analisi ha rivelato RAD001 dose-dipendente diminuito il livello di mRNA di ciclina D1 e C-myc (Figura 4B). Figura 4 RAD001 induce arresto del ciclo cellulare e apoptosi nelle cellule BGC823. (A) BGC823 cellule sono state esposte a varie concentrazioni di RAD001 per 48 h. (B) RNA sono stati estratti dalle cellule. Cyclin D1 e livello di espressione C-myc sono stati rilevati mediante RT-PCR, actina come controllo di caricamento. (C), le cellule sono state incubate per 48 ore con dosi indicate di RAD001 prima colorazione con annessina V-FITC. Vengono visualizzate le percentuali di cellule apoptotiche. (D) Le cellule sono state incubate per 48 ore con dosi indicate di RAD001. Le cellule sono state raccolte, lisati e sottoposti ad analisi Western Blot con Bcl-2 e p53 anticorpi. GAPDH è stato utilizzato come controllo di caricamento.
Saggi annessina-V hanno mostrato che RAD001 in modo significativo indotto apoptosi nelle cellule BGC823. Un aumento del tasso di apoptosi è stato analizzato mediante FCM con l'aumento della dose (Figura 4C). Western blot analisi mostrava RAD001 dose-dipendente diminuendo il livello di proteina di Bcl-2 e aumentando il livello della proteina di p53 (Figura 4D). Risultati simili sono stati osservati nelle cellule AGS (dati non riportati)
. Discussione
Il bersaglio della rapamicina nei mammiferi (mTOR) è stato scoperto nei primi anni 1990 s nello studio del meccanismo d'azione di rapamicina, che è stato originariamente trovato come agente antimicotico e fu poi riconosciuto come proprietà antitumorali [27]. Come una proteina chinasi Ser /Thr, mTOR gioca un ruolo chiave nella crescita cellulare e l'omeostasi [28]. La proteina mTOR forma un complesso con proteine ​​adattatrici, mTORC1 (mammalian target of complesso rapamicina 1) e mTORC2. L'attivazione di mTORC1 regola la crescita cellulare modulando la sintesi proteica, biogenesi dei ribosomi e l'autofagia [29]. Il percorso mTORC2 gioca un ruolo chiave di attivazione di Akt, come PDK1 (3-phosphoinositide-dipendente proteina chinasi 1) e PI3K, un altro obiettivo potenziale per i tumori in cui vi è Akt deregolamentazione [26].
Nel corso di studio, abbiamo osservato che 93 (51,4%) pazienti avevano espressione positiva di p-mTOR in 181 pazienti affetti da cancro gastrico. Coerentemente con il nostro risultato, in un altro studio inclusi 1072 pazienti, l'espressione di p-mTOR è del 46,5% [30].
Studi precedenti hanno riportato il significato prognostico di espressione p-mTOR. Herberger et al [18]. identificato p-mTOR ad essere un fattore prognostico indipendente per la morte in pazienti con adenocarcinoma del tratto biliare. Nel loro studio, la sopravvivenza globale è stata significativamente più breve nei pazienti con tumori p-mTOR-positivi rispetto ai pazienti con tumori p-mTOR-negativi (P = .004). Nel cancro gastrico, Yu et al. espressione valutata di p-mTOR in 1.072 pazienti affetti da cancro gastrico con un microarray di tessuto, dimostrando sovraespressione di p-mTOR è un fattore prognostico indipendente [30]. Tuttavia, in uno studio incluso 109 pazienti con adenocarcinoma gastrico sottoposti a gastrectomia radicale [31], Murayama et al. trovato né citoplasmatica p-mTOR né nucleare p-mTOR era fattore prognostico indipendente, anche se identificati citoplasmatica espressione p-mTOR è stata associata con la sopravvivenza più poveri e correlata con la profondità di invasione del tumore, linfonodi e stadio del tumore. Nel presente studio, abbiamo confermato che la classificazione pT e lo stato dei linfonodi sono indipendenti indicatore prognostico di outcome clinico nei pazienti con cancro gastrico da analisi multivariata. Tuttavia, poiché la maggior parte dei pazienti si presentano con malattia localmente avanzata, altri marcatori prognostici secondari, in particolare p-mTOR, può essere utile [13]. I nostri risultati mostrano chiaramente che l'espressione p-mTOR è correlata fortemente con scarsa sopravvivenza globale e libera da malattia nelle analisi univariata con una tendenza verso la concordanza di analisi multivariata.
Coerentemente con il nostro studio, diversi studi hanno anche riconosciuto gli effetti antiproliferativi della inibitori di mTOR in cellule di cancro gastrico. Ad esempio, Lang et al [21]. rapamicina identificato potrebbe inibire la crescita delle cellule del cancro gastrico sia in un modello di tumore sottocutaneo e in un modello sperimentale. I loro risultati evidenziano l'idoneità di inibitori di mTOR ad essere utilizzato in un contesto antiangiogenica per la terapia del cancro gastrico.
Tuttavia, RAD001 è un nuovo inibitore mTOR come agente anticancro. Il meccanismo su RAD001 nel cancro gastrico non è chiaro. Cejka et al. mostrava l'attività antiangiogenica di RAD001 combinata con una dose elevata di ciclofosfamide rivelato attività antitumorale sinergica contro il cancro gastrico [32]. Essi hanno anche scoperto che RAD001 diminuita proliferazione e la produzione attenuato di HIF-1α e VEGF nelle cellule di cancro gastrico in vitro [33]. Nel corso di studio, i nostri dati hanno mostrato che la terapia RAD001-attenuato fosforilazione di p70S6K e marcatamente inibito la proliferazione delle cellule di cancro gastrico attraverso l'arresto del ciclo cellulare e l'apoptosi in vitro. Abbiamo trovato RAD001 indotto la fase di arresto G0 /G1, che è stato associato con la diminuzione della ciclina D1 e C-myc. Inoltre, abbiamo mostrato per la prima volta che RAD001 come nuovo apoptosi inibitore mTOR dose-dipendente indotta in cellule di cancro gastrico tramite saggi annessina V. Questo effetto può essere dettata dal contesto cellulare e bersagli a valle compresi P53 e Bcl-2. Questi risultati potrebbero spiegare ulteriormente l'efficacia di RAD001.
Conclusione
In sintesi, abbiamo condotto la ricerca sistematica di mTOR nel carcinoma gastrico, indicando i rapporti l'espressione con il valore prognosi di attivazione mTOR (p-mTOR) in vivo, l'effetto di RAD001 e la parte di meccanismi in cellule di cancro gastrico in vitro. I nostri risultati indicano che p-mTOR servirebbe come un potenziale marcatore biologico per identificare un sottogruppo di pazienti affetti da cancro gastrico di prognosi infausta. È inoltre emerso che RAD001 era un agente promettente per il trattamento del cancro gastrico con indurre l'arresto del ciclo cellulare e l'apoptosi dall'espressione down-regolazione di c-myc, CyclinD1 e Bcl-2, up-regolazione dell'espressione di P53. Sono necessari ulteriori studi per chiarire il ruolo della attivazione di mTOR e, infine, di proporre mTOR come un obiettivo concreto per la terapia del cancro gastrico
Nota
concedere il sostegno:. Supportato da Nazionale Alta tecnologia di ricerca e sviluppo (863) Programma di Cina | Note
da-zhi Xu, Qi-rong Geng hanno contribuito ugualmente a questo lavoro
dichiarazioni
Ringraziamenti.
questo lavoro è stato sostenuto dal National High Technology ricerca e sviluppo (863) Programma di Cina. Gli autori apprezzano l'eccellente assistenza tecnica di Li-hui Wang, Fei-Meng Zheng, Zheng-zhi Zou, Yan Zhang e Zi-jie lungo.
Autori 'file inviati originali per le immagini
Qui di seguito sono i link a originale degli autori presentato file per le immagini. 'file originale per la figura 1 12885_2009_2335_MOESM2_ESM.pdf Autori 12885_2009_2335_MOESM1_ESM.pdf autori file originale per la figura 2 12885_2009_2335_MOESM3_ESM.pdf Autori file originale per la figura 3 12885_2009_2335_MOESM4_ESM.pdf Autori file originale per la figura 4 interessi in competizione
Gli autori dichiarano di avere interessi in gioco.

• L'effetto prognostico di etnia per il cancro gastrico ed esofageo: l'esperienza basato sulla popolazione in British Columbia, Canada
• L'identificazione dei fattori prognostici e indicazioni chirurgiche per il tumore gastrico metastatico