Activado mamíferos objetivo de rapamicina es una posible diana terapéutica en el cáncer gástrico

Activado mamíferos objetivo de rapamicina es una posible diana terapéutica en el cáncer gástrico
Resumen Antecedentes
Francia El objetivo de la rapamicina en mamíferos (mTOR) desempeña un papel clave en el crecimiento celular y la homeostasis. El objetivo de nuestro estudio es investigar la expresión de mTOR activado (p-mTOR) en pacientes con cáncer gástrico, su importancia pronóstica y el efecto de la inhibición de RAD001 en el crecimiento del tumor y determinar si la inhibición selectiva de la mTOR podría ser una estrategia terapéutica potencial para el cáncer gástrico.
Métodos
se detectó la expresión de p-mTOR en muestras de 181 cánceres gástricos que fueron sometidos a resección radical (R0) por inmunohistoquímica. Se estudió la correlación de la expresión de p-mTOR a las características clínico-patológicas y la supervivencia del cáncer gástrico. También se determinó el efecto de inhibición de RAD001 sobre el crecimiento tumoral usando líneas celulares de cáncer gástrico humano BGC823 y AGS.
Resultados
inmunotinción para p-mTOR fue positiva en 93 de 181 (51,4%) cánceres gástricos, estrechamente correlacionada con la linfa estado de los ganglios y la etapa pTNM. Los pacientes con p-mTOR positivos mostraron significativamente menor supervivencia libre de enfermedad (DFS) y la supervivencia global (OS) que aquellos con tumores p-mTOR-negativos en los análisis univariable, y hubo una tendencia hacia una correlación entre la expresión de p-mTOR y supervivencia en el análisis multivariable. RAD001 la proliferación dependiente de la dosis marcadamente inhibida de células de carcinoma gástrico humano por reducción de la expresión de p70s6k, p-p70s6k, C-myc, CyclinD1 y Bcl-2, hasta la regulación de la expresión de p53.
Conclusiones Hoteles en gástrica cáncer, p-mTOR es una diana terapéutica potencial y RAD001 era un agente de tratamiento prometedor, con la inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis mediante la expresión de c-myc regula hacia abajo, CyclinD1 y Bcl-2, hasta la regulación de la expresión de p53.
antecedentes
carcinoma gástrico es el cuarto cáncer más común y la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo, incluyendo 1 millón de nuevos casos por año en todo el mundo [1]. Alrededor del 60% de los nuevos casos de cáncer gástrico se presentan en el este de Asia [2], especialmente en China. La resección quirúrgica es el tratamiento más eficaz para el cáncer gástrico y la eficacia de la quimioterapia sigue siendo limitada [3]. Muchos estudios han indicado que la profundidad de la invasión y el número de ganglios linfáticos metastásicos son los predictores potentes más importantes de la supervivencia para los pacientes con cáncer gástrico [4, 5]. Por ejemplo, en estudios previos [6, 7] relación de ganglios linfáticos positivos, se ha encontrado es un indicador pronóstico independiente después de la resección D2 y quimioterapia intraperitoneal puede ser beneficioso para pacientes con cáncer gástrico. Sin embargo, un paso fundamental para mejorar el resultado clínico radica en el mayor conocimiento del comportamiento biológico del tumor, lo que puede ayudar a identificar los posibles objetivos para la terapia individual [8, 9].
En los últimos años, molecularmente enfoques para el tratamiento basado en cáncer gástrico se ha dado una gran preocupación. Varios artículos han descrito algunas dianas moleculares potenciales para la terapia en el cáncer gástrico, tal como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) [10-13], factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [14], recepteur d'origine nantais (RON) [15 ]. Francia El objetivo de la rapamicina en mamíferos (mTOR) es una nueva diana molecular potencial para la terapia contra el cáncer. Su expresión se ha demostrado en diversas líneas celulares y muestras de tumor, tales como tumores de hígado [16], cáncer de mama [17], tracto biliar adenocarcinoma [18], y el cáncer cervical [19, 20]. Estos estudios mostraron que la expresión mTOR se asoció con un mal pronóstico clínico. Lang et al [21]. también han observado la activación de mTOR en el cáncer gástrico humano in vitro e in vivo. Indicaron mTOR se activa con frecuencia en el cáncer gástrico humano. Recientemente, un derivado biodisponible por vía oral de rapamicina, RAD001 (everolimus; Novartis Pharma AG), se ha desarrollado. Una fase de tratamiento reveló III de ensayo con everolimus prolonga la supervivencia libre de progresión en pacientes con carcinoma de células renales metastásico que habían progresado en otras terapias dirigidas [22]. RAD001 También se ha demostrado que inhibe la proliferación de crecimiento de células tumorales en algunos carcinomas [23, 24]. Pero el papel de RAD001 en células de cáncer gástrico no es claro.
Los objetivos de este estudio fueron analizar más a fondo las relaciones de la expresión de mTOR con el valor pronóstico de la mTOR activado (p-mTOR), el efecto de RAD001 en el crecimiento y el ciclo celular de las células de cáncer gástrico humano in vitro y determinar si el cáncer gástrico es un buen candidato para la terapia de destino con inhibidores de mTOR.
Métodos pacientes estudiados

Este estudio retrospectivo consistió en 181 pacientes que fueron sometidos a resección radical ( R0) para la confirmación histológica de carcinoma gástrico desde el Centro de cáncer de la Universidad Sun Yat-sen, entre enero de 1997 y diciembre de 2002. Todos los pacientes con diagnóstico histológico de adenocarcinoma del estómago se había sometido ya sea gastrectomía parcial proximal, gastrectomía parcial distal o gastrectomía total. La aprobación ética se obtuvo de Sun Yat-sen Universidad del Centro del Cáncer comité de ética de investigación.
Aquellos con los datos clínicos completos material histológico adecuado y fueron elegibles para su inclusión. Los criterios de elegibilidad también incluyó histológicamente confirmado resección R0, que se define como la ausencia de tumor residual macroscópica y microscópica y el tiempo de supervivencia postoperatoria ≥ 6 meses. Los pacientes con metástasis a distancia y carcinoma de muñón gástrico después de la resección para la enfermedad benigna fueron excluidos del estudio. La razón es que la supervivencia de los pacientes con metástasis a distancia a menudo se ve afectada por muchos otros factores, como la quimioterapia preoperatoria o la obstrucción MyBestPlay Todos los pacientes tuvieron un seguimiento después de la cirugía entre los 6 y 12 meses de intervalo.; la fecha final del seguimiento fue de diciembre de 2008. La mediana de seguimiento período fue de 50 (media: 50,66; intervalo de 10 a 128) meses para todos los pacientes, y 74 meses (media: 72,80; 27 Intervalo a 128) para la supervivencia. La duración media del seguimiento fue de 40 (media: 43,71; tamaño de 11 a la 125) para los pacientes que tenían tumores de expresión de p-mTOR positivo, y 60,5 meses (media: 58.01; intervalo de 10 a 128) para la expresión negativa. La supervivencia se calculó a partir de la fecha del diagnóstico hasta la fecha de la muerte o el último seguimiento.
Toma de la muestra y la inmunotinción para p-mTOR
Todas las muestras tumorales fueron obtenidas de cáncer gástrico resecado quirúrgicamente antes de la terapia adyuvante. , bloques de parafina de tejido fijados con formol se almacenaron a temperatura ambiente identificado por un número de identificación. Cinco micras de espesor secciones de tejidos fueron cortadas de los bloques de parafina, deparaffinized en xileno, y rehidratada. recuperación antigénica se procesó con citrato de sodio. Los portaobjetos se incubaron a continuación en 0,3% H 2O 2 durante 10 min, y se bloquearon en 1% de albúmina de suero bovino durante 60 min seguido de un anticuerpo monoclonal de conejo específico para p-mTOR (fosfo-mTOR, Ser2448, 49F9; Cell Signaling Technology) a 4 ° C durante la noche, y luego se tiñeron con 3,3-diaminobencidina. Después de la visualización de la inmunorreactividad, las secciones se contratiñeron con hematoxilina y después se monta.
Evaluación de la tinción inmunohistoquímica
Se evaluaron las secciones inmunoteñidas y tejidos de adenocarcinomas de próstata humanos sirvieron como control positivo. De acuerdo con los criterios descritos recientemente para la expresión calificación mTOR, intensidad de la tinción se determinó como 0 (ausente), 1 (débil) y 2 (fuerte) y los niveles de expresión de los biomarcadores fueron semiquantified usando una puntuación de inmunohistoquímica (rango, 0-200) calcula multiplicando la intensidad de tinción con el porcentaje de células tumorales positivas [18]. Los pacientes con una puntuación inmunohistoquímica de ≤ 20 fueron considerados como p-mTOR-negativos y los que tienen una puntuación de > 20 como p-mTOR-positivo. Todas las diapositivas se evaluaron de forma independiente por dos patólogos independientes sin ningún conocimiento de la información clínica de los pacientes. Cuando las opiniones de los dos evaluadores fueron diferentes, se alcanzó un acuerdo por discusión cuidadosa Líneas celulares y condiciones de cultivo

líneas celulares de cáncer gástrico Humanos BGC823 y AGS (Número ATCC: CRL-1739). Que son pobremente diferenciado fueron regalos de la Escuela de la Universidad de Pekín de Oncología (Beijing, República Popular de china.) [25]. Las líneas celulares se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Hyclone), penicilina (100 unidades /ml) y estreptomicina (100 unidades /ml) a 37 ° C y 5% CO2 en un incubador humidificado .
ensayo de viabilidad celular
Para analizar el efecto de RAD001 en células de cáncer gástrico humano, la viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT. RAD001 fue proporcionada por Novartis Pharma (Basilea, Suiza). Para el ensayo de viabilidad, las células en crecimiento logarítmico fueron estimuladas con diferentes dosis de RAD001 (0, 5, 10, 20 y 40 mM). Al final del periodo de cultivo, (-dimetiltiazol-2-il 4,5) -2,5- difeniltetrazolio (MTT) solución (Sigma, EE.UU.) a 0,2 mg se añadieron 20 l de colorante de tetrazolio 3- /ml en PBS , la densidad óptica a 490 nm (OD490) se determinó mediante el uso de un lector de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Los valores medios se calcularon a partir de cultivos por triplicado. Se recogieron y se fijaron en etanol al 70% durante la noche a 4 ° C de análisis del ciclo de la célula

Cells. Después, las células se lavaron y se tiñeron con yoduro de propidio (PI) (Sigma) 5 mg /ml. Después de 30 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz, se analizaron las células mediante citometría de flujo utilizando un FACScan de Becton Dickinson. V
ensayo de anexina
Las muestras se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y el uso de Anexina V-fluoresceína isotiocianato (FITC) y PI tinción para la determinación de la exposición de fosfatidilserina en la membrana plasmática externa. Después de incubación durante 30 min a temperatura ambiente protegido de la luz, las muestras se cuantificaron por citometría de flujo, utilizando un Becton Dickinson FACScan.
PCR con transcripción inversa
RNA total se extrajo mediante el método TRIzol. RNA se hizo una transcripción inversa utilizando un kit disponible comercialmente (Fermentas, EE.UU.). La mezcla (25 l total) para la PCR consistió en 0,5 l de ADNc, 0,5 U de ADN Taq polimerasa, 2,5 l de 10 x tampón de PCR, dNTP 2,5 mM mezcla, y 50 pM de sentido y antisentido cebadores cada uno. CyclinD1 y C-myc se analizaron mediante cebadores siguientes: CyclinD1 5'GAACAGAAGTGCGAGGAGGAG3 'y revertir 5'AGGCGGTAGTAGGACAGGAAG3 imprimación'; C-myc, 5 'CGAGCTGCTGGGAGGAGACAT3' y 5 Actina 'AGCCGCCCACTTTTGACA GG3':. 5'GGCACCCAGCACAATGAA 3 'y 5' TAGAAGCATTTGCGGTGG 3 'lisado celular
y análisis de transferencia Western
Las células se lisaron en tampón de lisis y la concentración de de proteína se determinó por el método de colorante de Bradford (Bio-Rad Laboratories). Cantidades iguales de extracto de células se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF (Bio-Rad). Western blot análisis se realizaron con diversos anticuerpos primarios específicos. Anticuerpos que reconocen fosfo-p70S6K (Thr389), p70S6K, fosfo-mTOR (Ser2448), Bcl-2 y p53 eran de Señalización Celular analiza.
Estadístico Francia El criterio de valoración principal del estudio fue la supervivencia global (SG). Se define como el período entre el momento de la cirugía y la muerte. la supervivencia libre de enfermedad (DFS) fue el tiempo que transcurre entre el momento de la cirugía y la recaída o muerte relacionada con el tumor. Se analizó como punto final secundario. La asociación de la expresión de p-mTOR con varias características clinicalopathologic se analizó mediante la prueba de chi-cuadrado. La supervivencia acumulada y la supervivencia libre de enfermedad se estimaron por el método de Kaplan-Meier. Se utilizó la prueba de log-rank para evaluar la significación estadística de las diferencias entre las curvas de supervivencia. Un modelo de riesgo proporcional de Cox (hacia atrás, pasos) para el análisis multivariable se aplicó por factores que alcanzó una significación estadística en el análisis univariable. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS (versión 13 para Windows, SPSS, Chicago, IL). Las diferencias en P < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Características clínico
Un total de 181 pacientes fueron incluidos en este estudio. La mediana de edad fue de 59 años (rango, 23-83 años). Las características clínico-patológicas de la población del estudio se resumen en la Tabla 1. 129 pacientes eran hombres y 52 mujeres. 77 de 181 tumores (42,5) eran de la parte superior del estómago, 74 de 181 pacientes (40,9%) eran de la parte inferior del estómago y los tumores restantes eran de la parte media del cuerpo y la totalidad del estómago. 118 de 181 (65,2%) el tamaño del tumor de los pacientes eran > 4 cm, y 63 (34,8%) eran ≤ 4 cm. De acuerdo con criterios de la Organización Mundial de la Salud, 4 de 181 tumores (2,2%) eran bien diferenciados, 55 de 181 tumores (30,4%) fueron moderadamente diferenciados, 116 fueron pobremente diferenciado, y 6 fueron indiferenciada. fase postquirúrgica se clasificó de acuerdo a la 2002 de la UICC /AJCC clasificación [26] .Tabla 1 correlación clínico-patológico de la expresión de p-mTOR en el cáncer gástrico
Factores
Todos los pacientes
No. de los pacientes (%)
P
N

= 181 (%) guía empresas mTOR negativo
mTOR positivo

Edad (a)
.256 Hotel < 60
95 (52,5)
50 (56,8)
45 (48,4)
≥60
86 (47,5)
38 (43,2)
48 (51,6)
Sexo Masculino
.926

129 (71,3)
63 (71,6)
66 (71,0)
Mujer
52 (28,7)
25 (28,4)
27 (29,0) sitio
.053
superior
77 (42,5)
33 (37,5)
44 (47,3)
centro
28 ( 15.5)
10 (11,4)
18 (19,4)
menor
74 (40,9)
43 (48,9)
31 (33,3)
difuso página 2 ( 1.1): perfil 2 (2.3)
0 (0.0)
El tamaño del tumor
.172
≤ 4 cm
63 (34,8)
35 (40,0) 28
(30.1) Hotel > 4 cm
118 (65,2)
53 (60,0)
65 (69,9)
tipo Borrmann
.398
etapa temprana página 7 (3.9) página 6 ( 6.8): perfil 1 (1.1)
I
4 (2.2) página 2 (2.3) página 2 (2.1)
II
65 (35,9)
31 ( 35.2)
34 (36,6)
III
101 (55,8)
47 (53,4)
54 (58,1)
IV
4 (2.2) página 2 ( 2.3) página 2 (2.1)
clasificación
.999
1 página 4 (2.2) página 2 (2.3) página 2 (2.1)
2 55 (30.4)
27 (30,7)
28 (30,1) página 3
116 (64,1)
56 (63,6)
60 (64,5)
4 de 6 (3.3) página 3 (3.4) Estrellas: 3 de clasificación (3.3)
patológica T
.168
T1
17 (9,4): perfil 12 (13,6)
5 (5.4)
T2
35 (19,3)
18 (20,5)
17 (18,3)
T3
119 (65,7): perfil 55 (62,5)
estado 64 (68,8)
T4
10 (5.5) página 3 (3.4) página 7 (7.5)
N patológico
.008
N negativo
44 ( 24.3)
29 (33,0)
15 (16,1) N
etapa positiva
137 (75,7)
59 (67,0)
78 (83,9)
patológica (pTNM)
.026
I
26 (14,4)
17 (19,3) página 9 (9.7)
II
47 (26,0)
28 (31,8)
19 (20,4)
III
100 (55,2)
41 (46,5)
59 (63,4)
IV página 8 (4.4) página 2 (2.3)
6 (6,5): perfil 129 de 181 pacientes (71,2%) tenían enfermedad más avanzada etapa T (PT3 + PT4), y 137 pacientes (75,7%) tenían metástasis en los ganglios linfáticos. Totalmente de pacientes en estadio I-IV fueron 26, 47, 100 y 8 casos, respectivamente.
Expresión de p-mTOR en el cáncer gástrico
inmunotinción de p-mTOR fue citoplasmática y en parte membranosa. La figura 1 muestra ejemplos representativos de inmunotinción p-mTOR. La mucosa gástrica normal es negativo para p-mTOR. De los 181 pacientes, 93 (51,4%) eran tumores p-mTOR-positivos. Figura 1 Ejemplos de inmunotinción p-mTOR. (A) La mucosa gástrica normal es negativo para p-mTOR (aumento original x 200). (B) La mucosa gástrica normal es negativo para p-mTOR (aumento original x 400) (C) expresión positiva de p-mTOR en el cáncer gástrico (aumento original x 200). (D) negativo de la expresión de p-mTOR en el cáncer gástrico (aumento original × 200). El análisis de supervivencia

Los pacientes con p-mTOR cáncer gástrico positivo mostró significativamente más corta tasas de supervivencia global y libre de enfermedad que aquellos con p- cáncer gástrico mTOR negativo (DFS, el 48,9% frente al 30,1%; p = 0,006; OS, el 51,1% frente al 34,4%; p = 0,011, Tabla 2, Figura 2A, B). El análisis univariable reveló que el tiempo de supervivencia también disminuyó con la más alta clasificación pT (DFS, p = 0,001; OS, P = .005), metástasis de ganglios linfáticos (DFS, p < 0,0001; OS, P = 0,001) y pTNM avanzada etapa (DFS, p < 0,001; OS, P = .001). No hubo asociación entre la SG o la SSE y la edad, el sexo o tumor size.Table 2 Análisis univariable de libre de enfermedad y la supervivencia global en el cáncer gástrico


libre de enfermedad suivival
general survival

Characteristic

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

Age(y)
.343 .583
Hotel < 60
95
1.00 1.00

≥60
86
0.834
0,573-1,214 0,611-1,320
0,898
Sexo seguro
. 662
.950
Hombre
129
1.00 1.00

Mujer
52
0.909
0,591-1,396 0,639-1,521
0,986
El tamaño del tumor

.151 .232

≤4 cm
63
1.00 1.00
Hotel > 4 cm
118
1.345
0,897-2,016 0,851-1,945
1.287

estadio pT
, 001, 005

pT1
17
1.00 1.00

pT2
35
1.549
0.558-4.301
.401
1.535
0.553-4.264
.411
pT3
119
3.546
1.437-8.750
.006
3.237
1.310-8.001
.011
pT4
10
4.738
1.547-14.506
.006
4.068
1.289-12.836
.017
pN fase Hotel < , 0001, 001

Negativo
44
1.00 1.00

positiva
137
2.617
1,538-4,451
2.389
1.401- 4.075
pTNM fase Hotel < , 0001, 001

I
26
1.00 1.00

II
47
2.920
1.197-7.121
.018
2.860
1.173-6.973
.021
III
100
4.955
2.152-11.409
< 0001
4.455
1,930 a 10,281 Hotel < 0001
IV página 8
7.369
2,470 a 21,981 Hotel < 0001
6.103
1,965 a 18,957
.002
p-mTOR
.008 .013

Negativo
88
1.00 1.00

positivas
93
1.667
1,146-2,454 1,112-2,430
1.644

Figura 2 de Kaplan-Meier estimaciones de la probabilidad de supervivencia. Los pacientes con p-mTOR positivo mostraron una supervivencia significativamente más corto en general (A) y las tasas que aquellas con expresión negativa p-mTOR supervivencia (B) libre de la enfermedad. (P = 0,011 yp = 0,006, respectivamente): perfil En el análisis multivariable, la metástasis de los ganglios linfáticos (DFS, p = 0,018; OS, P = .038). Y el estadio pT (DFS, p = 0,018; SG, P = .046) fueron significativas factor pronóstico independiente para el tiempo de supervivencia. Además, el análisis multivariable (tabla 3) también indicó una tendencia hacia una correlación entre la expresión de p-mTOR y la disminución de la supervivencia, pero la tendencia no alcanzó significación estadística (DFS, p = 0,059; OS, P = .070) .Tabla 3 El análisis de regresión de Cox multivariable de supervivencia libre de enfermedad y en general


suivival
libre de enfermedad survival

Factors

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

p-mTOR
0,059 0,070

Negativo
88
1.00 1.00

positiva
93
1.452
0,986-2,138 0,970-2,147
1.443

infiltrante profundidad
0,018 0,046

pT1
17
1.00 1.00

pT2
35
1.050
0.366-3.016
0.928
1.078
0.375-3.101
0.889
pT3
119
2.251
0.867-5.845
0.096
2.146
0.823-5.595
0.118
pT4
10
2.926
0.920-9.305
0.069
2.616
2.616-8.580
0.113
Lymph estado de los ganglios
0,018 0,038

Negativo
44
1.00 1.00

positiva
137
1.981
1,981-3,488
1.828
1,034-3,233
RAD001 inhibe la proliferación e impide la fosforilación p70S6K
para investigar los efectos de RAD001 sobre la proliferación de líneas celulares de cáncer gástrico humano BGC823 y AGS, se realizaron ensayos de proliferación con la exposición de 48 horas para RAD001. Como resultado, RAD001 genera una inhibición significativa en las dos líneas celulares en una manera dependiente de la dosis. (Figura 3A). Figura 3 (A) RAD001 inhibe la proliferación de células de cáncer gástrico. células de cáncer gástrico se trataron con las concentraciones indicadas de RAD001 en presencia de 10% de FBS durante 48 h. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTT. (B) La fosforilación de p70S6K se redujo significativamente de una manera dependiente de la dosis en ambos AGS y BGC823 células mediante el tratamiento con RAD001. Ambas líneas celulares se incubaron con el aumento de dosis de RAD001 durante 48 horas, los lisados ​​celulares se sometieron a análisis de transferencia Western con anticuerpos p-S6K y S6K fosforilados.
Experimentos de Western blot se realizaron con RAD001 a 0, 5, 10, 20 M por 48 h. P70S6 quinasa es un objetivo importante de aguas abajo mTOR y su fosforilación dependiente de mTOR permite la traducción de las proteínas ribosomales. Se examinó el estado de fosforilación de p70s6k objetivo abajo por inmunotransferencia. Como se muestra en la Figura 3B, se encontró que el tratamiento de las dos líneas celulares BGC823 y AGS con RAD001 prevenir significativamente la fosforilación de p70S6K de una manera dependiente de la dosis.
RAD001 induce la detención del ciclo celular G0 /G1 y la apoptosis en células de cáncer gástrico
para determinar si la supresión de la proliferación celular se debieron a G0 /detención o apoptosis en fase G1, la distribución del ciclo celular se analizó mediante FCM. La Figura 4 muestra que el tratamiento de células de BGC823 con RAD001 durante 48 horas resultó en una detención en G1 robusto y promueve apoptosis. Con el aumento de la dosis de RAD001, más y más células se mantuvieron en fase G1, mientras que la progresión del ciclo celular en la fase S fue disminuyendo (Figura 4A). RT-PCR análisis reveló RAD001 dependiente de la dosis se redujo el nivel de mRNA de la ciclina D1 y C-myc (Figura 4B). Figura 4 RAD001 induce la detención del ciclo celular y la apoptosis en células BGC823. BGC823 células (A) se expusieron a diversas concentraciones de RAD001 por 48 h. (B) de ARN se extrajo de las células. Ciclina D1 y el nivel de expresión de c-myc fueron detectados por RT-PCR, la actina como control de carga. Se incubaron las células (C) durante 48 horas con dosis indicadas de RAD001 antes de la tinción con anexina V-FITC. Se muestran los porcentajes de células apoptóticas. (D) Las células se incubaron durante 48 horas con dosis indicadas de RAD001. Las células se recogieron, se lisaron y se sometieron a análisis de transferencia Western con anticuerpos Bcl-2 y p53. GAPDH se utilizó como control de carga.
Ensayos de Anexina-V mostraron que RAD001 indujo significativamente la apoptosis en células BGC823. Un aumento en la tasa de apoptosis se analizó mediante FCM con el aumento de la dosis (Figura 4C). El análisis de transferencia Western mostró RAD001 dependiente de la dosis disminuyendo el nivel de proteína de Bcl-2 y el aumento del nivel de proteína de p53 (Figura 4D). Se observaron resultados similares en células AGS (datos no mostrados).
Discusión Francia El objetivo mamífero de la rapamicina (mTOR) se descubrió en la década de 1990 s en el estudio del mecanismo de acción de la rapamicina, que se encontró originalmente como una agente antifúngico y más tarde fue reconocido como propiedades contra el cáncer [27]. Como una proteína quinasa Ser /Thr, mTOR desempeña un papel clave en el crecimiento celular y la homeostasis [28]. La proteína mTOR forma un complejo con proteínas adaptadoras, mTORC1 (objetivo mamífero de la rapamicina complejo 1) y mTORC2. La activación de mTORC1 regula el crecimiento celular mediante la modulación de la síntesis de proteínas, la biogénesis de ribosomas y la autofagia [29]. La vía mTORC2 juega una parte clave de la activación de Akt, al igual que la PDK1 (3-fosfoinositida dependiente de la proteína quinasa 1) y PI3K, una diana terapéutica potencial de cánceres en los que existe la desregulación Akt [26].
En el estudio actual, se observó que 93 (51,4%) pacientes tuvieron expresión positiva de p-mTOR en 181 pacientes con cáncer gástrico. De acuerdo con nuestro resultado, en otro estudio que incluyó 1072 pacientes, la expresión de p-mTOR es 46,5% [30].
Estudios previos han informado de la importancia pronóstica de la expresión de p-mTOR. Herberger et al [18]. identificado p-mTOR a ser un factor pronóstico independiente de mortalidad en pacientes con adenocarcinoma del tracto biliar. En su estudio, la supervivencia global fue significativamente menor en los pacientes con tumores de p-mTOR-positivas en comparación con los pacientes con tumores de p-mTOR-negativos (P = .004). En el cáncer gástrico, Yu et al. expresión evaluada de p-mTOR en 1.072 pacientes con cáncer gástrico usando un microarray de tejido, lo que demuestra la sobreexpresión de p-mTOR es un factor pronóstico independiente [30]. Sin embargo, en un estudio incluyó 109 pacientes con adenocarcinomas gástricos que fueron sometidos a una gastrectomía radical [31], Murayama y col. encontrado ni citoplásmica p-mTOR ni nuclear p-mTOR fue factor pronóstico independiente, aunque se identificaron expresión de P-mTOR citoplásmica se asoció con una peor supervivencia y correlacionada con la profundidad de la invasión del tumor, los ganglios linfáticos y el estadio tumoral. En el presente estudio, se confirmó que la clasificación pT y el estado de los ganglios linfáticos son indicador pronóstico independiente de los resultados clínicos en pacientes con cáncer gástrico mediante análisis multivariable. Sin embargo, porque la mayoría de los pacientes se presentan con enfermedad localmente avanzada, otros marcadores de pronóstico secundarios, particularmente p-mTOR, puede ser de utilidad [13]. Nuestros resultados muestran claramente que la expresión de P-mTOR se correlaciona fuertemente con pobre supervivencia global y libre de enfermedad en los análisis univariable con una tendencia hacia una correlación en el análisis multivariable.
De acuerdo con nuestro estudio actual, varios estudios también han reconocido los efectos antiproliferativos de inhibidores de mTOR en células de cáncer gástrico. Por ejemplo, Lang et al [21]. rapamicina identificado podría inhibir el crecimiento de células de cáncer gástrico, tanto en un modelo de tumor subcutáneo y en un modelo experimental. Sus resultados ponen de manifiesto la conveniencia de los inhibidores de mTOR para ser utilizado en un contexto antiangiogénico para el tratamiento del cáncer gástrico.
Sin embargo, RAD001 es un nuevo inhibidor de mTOR como agente contra el cáncer. El mecanismo sobre RAD001 en el cáncer gástrico no es claro. Cejka et al. mostró la actividad antiangiogénica de RAD001 en combinación con una alta dosis de ciclofosfamida reveló actividad antitumoral sinérgica contra el cáncer gástrico [32]. También han encontrado que RAD001 disminución de la proliferación y la producción atenuada de HIF-1α, así como VEGF en células de cáncer gástrico in vitro [33]. En el estudio actual, nuestros datos muestran que la terapia RAD001-atenuada fosforilación de p70S6K y marcadamente inhibida la proliferación de células de cáncer gástrico a través de la detención del ciclo celular y la apoptosis in vitro. Encontramos RAD001 inducida por la detención en la fase G0 /G1, que se asoció con una disminución de ciclina D1 y C-myc. Por otra parte, hemos demostrado por primera vez que RAD001 como un nuevo inhibidor de mTOR apoptosis dependiente de la dosis inducida en células de cáncer gástrico mediante ensayos de anexina V. Este efecto puede ser dictada por el contexto celular y objetivos de abajo incluyendo p53 y Bcl-2. Estos hallazgos podrían explicar mejor la eficacia de RAD001.
Conclusión
En resumen, hemos llevado a cabo la investigación sistemática de mTOR en el cáncer gástrico, lo que indica las relaciones de la expresión con el valor pronóstico de la mTOR activado (p-mTOR) in vivo, el efecto de RAD001 y la parte de los mecanismos en células de cáncer gástrico in vitro. Nuestros resultados indicaron que p-mTOR serviría como un marcador biológico potencial de identificar un subgrupo de pacientes con cáncer gástrico de mal pronóstico. También mostró que RAD001 era un agente prometedor para el tratamiento del cáncer gástrico con la inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis por la expresión de regulación hacia abajo de C-myc, CyclinD1 y Bcl-2, hasta la regulación de la expresión de P53. Se requieren más estudios para dilucidar el papel de la activación de mTOR y, finalmente, proponer mTOR como una meta concreta para la terapia del cáncer gástrico
Nota
subsidio de apoyo:. Con el apoyo de Nacional de Investigación y Desarrollo de Alta Tecnología (863) Programa de china
Notas sobre Da-Zhi Xu, Qi-rong Geng contribuyeron igualmente a este trabajo.
Declaraciones
Agradecimientos
este trabajo fue apoyado por el Programa de (863) Nacional de Investigación y Desarrollo de alta Tecnología China. Los autores agradecen la excelente asistencia técnica de Li-Hui Wang, Fei-Meng Zheng, Zheng Zhi-Zou, Zhang Yan y Jie Zi-larga.
Autores 'archivos originales presentados para las imágenes
A continuación se presentan los vínculos con la original de los autores presentó archivos de imágenes. 'archivo original para la figura 1 12885_2009_2335_MOESM2_ESM.pdf autores 12885_2009_2335_MOESM1_ESM.pdf Autores archivo original de la figura 2 12885_2009_2335_MOESM3_ESM.pdf autores archivo original de la figura 3 12885_2009_2335_MOESM4_ESM.pdf autores archivo original de la figura 4 Conflicto de intereses
Los autores declaran que tienen intereses en competencia.

• El efecto pronóstico de la etnicidad para el cáncer gástrico y esofágico: la experiencia basada en la población en la Columbia Británica, Canada
• La identificación de factores pronósticos y las indicaciones quirúrgicas para la identificación metastásico cancer