Активированный мишень рапамицина у млекопитающих является потенциальной терапевтической мишенью в желудочном cancer

Активированный мишень рапамицина у млекопитающих является потенциальной терапевтической мишенью при раке желудка
Аннотация
Справочная информация
мишени рапамицина у млекопитающих (МРМ) играет ключевую роль в клеточный рост и гомеостаз. Целью нашего исследования является изучение экспрессии активированного МРМ (п-МРМ) в больных раком желудка, их прогностическое значение и подавление эффекта RAD001 на рост опухоли и определить, является ли целевой ингибирование МРМ может быть потенциальной терапевтической стратегией для рака желудка.
Методы
экспрессия р-МРМ был обнаружен в образцах 181 рака желудка, перенесших радикальную резекцию (R0) с помощью иммуногистохимии. Исследована корреляция экспрессии р-MTOR к клиникопатологическими особенностей и выживания рака желудка. Мы также определили ингибирующий эффект RAD001 на рост опухоли с использованием BGC823 и AGS желудка клеточных линий рака человека.

Результаты иммуногистохимическое р-МРМ был положительным в 93 из 181 (51,4%) рака желудка, тесно коррелирует с лимфой состояние узла и pTNM стадии. У больных с р-МРМ положительным показали значительно меньшую выживаемость без признаков заболевания (DFS) и общей выживаемости (ОВ) ставки, чем те, с п-МРМ-негативных опухолей в univariable анализов, а также была отмечена тенденция к корреляции между выражением р-МРМ и выживание в многофакторных анализов. RAD001 заметно тормозится дозозависимо пролиферацию клеток желудочных карциномы человека посредством понижающего регулирования экспрессии p70S6K, п-p70S6K, C-Myc, CyclinD1 и Bcl-2, повышающей регуляции экспрессии Р53.
Выводы
в желудочном рак, п-МРМ является потенциальной терапевтической мишенью и RAD001 был многообещающим лечение с агентом индукции остановку клеточного цикла и апоптоз путем понижающего регуляции экспрессии C-Myc, CyclinD1 и Bcl-2, повышающей регуляции экспрессии р53.
фон
рак желудка является четвертым наиболее распространенным видом рака и второй ведущей причиной рака, связанных смерти во всем мире, в том числе 1 млн новых случаев в год в течение всего [1] мире. Около 60% новых случаев рака желудка происходит в Восточной Азии [2], особенно в Китае. Хирургическая резекция является наиболее эффективным средством для лечения рака желудка и эффективность химиотерапии остается ограниченным [3]. Многие исследования показали, что глубина вторжения и количество метастатических лимфатических узлов являются наиболее важными мощными предикторами выживаемости для больных раком желудка [4, 5]. Например, в предыдущих работах [6, 7], мы обнаружили, коэффициент положительный лимфоузел является независимым прогностическим показателем после резекции D2 и внутрибрюшинного химиотерапии может быть полезным для больных раком желудка. Тем не менее, фундаментальный шаг в направлении улучшения клинического результата заключается в более глубокому пониманию биологического поведения опухоли, которая может помочь идентифицировать возможные цели для индивидуальной терапии [8, 9].
В последние годы на молекулярном уровне на основе подходов к лечению в рак желудка было дано большое беспокойство. Несколько статей описали некоторые потенциальные молекулярные мишени для терапии при раке желудка, таких как рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) [10-13], сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) [14], recepteur d'Origine Nantais (RON) [15 ].
мишень рапамицина млекопитающих (МРМ) представляет собой новый потенциал молекулярной мишенью для противораковой терапии. Его выражение было продемонстрировано в различных клеточных линиях и опухолевых образцов, таких как новообразованиями печени [16], рак молочной железы [17], аденокарциномы желчных путей [18], а также рак шейки матки [19, 20]. Эти исследования показали, что экспрессия MTOR была связана с плохим клиническим прогнозом. Lang и др [21]. также наблюдали активацию MTOR при раке желудка человека в пробирке и в естественных условиях. Они указали MTOR часто активируется при раке желудка человека. В последнее время, в устной форме биодоступной производное рапамицина, RAD001 (эверолимус, Novartis Pharma AG), была разработана. Фаза III испытание показало, лечение с помощью эверолимусом увеличивает выживаемость без прогрессирования заболевания у пациентов с метастатическим почечно-клеточным раком, которые прогрессировали на других целевых терапии [22]. RAD001 также было показано, ингибирует пролиферацию роста опухолевых клеток в некоторых карцином [23, 24]. Но роль RAD001 в клетке рака желудка не ясно.
Целями данного исследования были для дальнейшего анализа отношений выражение MTOR со значением прогноза активированного МРМ (п-МРМ), влияние RAD001 на рост и клеточный цикл клеток рака желудка человека в пробирке и определяют рак желудка, является ли хорошим кандидатом для целевой терапии ингибиторами MTOR.
Методы
Пациенты изучали
Это ретроспективное исследование состояло из 181 пациентов, перенесших радикальную резекцию ( R0) для гистологически подтвержденного рака желудка от онкологического центра Сунь Ят-сена университета в период с января 1997 г. по декабрь 2002 г. Все пациенты с гистологически подтвержденным аденокарциномы желудка подверглись либо проксимального частичной резекции желудка, дистальный частичный гастрэктомию или тотальной гастрэктомии. Этическое одобрение было получено от Сунь Ят-сеном университет центра рака комитета по этике.
Те, с адекватной гистологического материала и полный клинических данных соответствовали критериям включения. Критерии приемлемости, также включены гистологически подтвержденный R0 резекция, которое было определено как отсутствие макроскопического и микроскопического остаточной опухоли и послеоперационной выживаемости ≥ 6 месяцев. У больных с отдаленными метастазами и карциномой культи желудка после резекции при доброкачественных заболеваний, были исключены из исследования. Причина заключается в том, что выживаемость больных с отдаленными метастазами часто зависит от многих других факторов, таких как предоперационной химиотерапии или обструкции
Все пациенты имели наблюдения после операции на 6 до 12 месяцев с интервалом. окончательная дата наблюдения была декабря 2008 Медиана периода наблюдения составила 50 (среднее значение: 50,66; диапазон от 10 до 128) месяцев для всех пациентов, и 74 месяцев (средний: 72.80, диапазон от 27 до 128) для выживания. Средняя продолжительность наблюдения составила 40 (среднее значение: 43,71; диапазон от 11 до 125) для пациентов, у которых опухоли положительного выражения р-МРМ и 60,5 месяцев (средний: 58.01, диапазон от 10 до 128) для отрицательного выражения. Выживание рассчитывали с момента постановки диагноза до даты смерти или последнего наблюдения.
Сбора образцов и иммуногистохимическое р-МРМ
Все образцы опухоли были получены из хирургической резекции рака желудка перед тем адъювантной терапии. Фиксированных формалином, парафином тканевых блоков хранили при комнатной температуре, идентифицированной идентификационным номером. Пять мкм толщиной срезы ткани вырезали из парафиновых блоков, депарафинировали в ксилоле, и регидратации. Антигенной поиска обрабатывали цитрат натрия. Затем предметные стекла инкубировали в 0,3% Н <суб> 2O <суб> 2 в течение 10 мин, и блокировали в 1% бычьего сывороточного альбумина в течение 60 мин с последующим кроличьего моноклонального антитела, специфичного для р-МРМ (фосфо-МРМ, Ser2448, 49F9, Cell Signaling Technology), при 4 ° с в течение ночи, а затем окрашивали 3,3-диаминобензидино. После визуализации иммунореактивности срезы контрастно гематоксилином и затем монтируется.
Оценка иммуногистохимическим окрашиванием
В иммуноокрашиванию участки были оценены и тканей от аденокарциномы простаты человека служила в качестве положительного контроля. Согласно недавно описанных критериев для выражения рейтинга MTOR, интенсивность окрашивания была определена как 0 (отсутствует), 1 (слабый) и 2 (сильный) и уровни экспрессии биомаркеров были semiquantified используя счет иммуногистохимии (диапазон, 0-200) рассчитывается путем умножения интенсивности окрашивания процент положительных опухолевых клеток [18]. Пациенты с иммуногистохимии счетом ≤ 20 рассматривались как п-МРМ-отрицательных и тех, кто со счетом > 20 как п-МРМ-положительным. Все слайды были оценены независимо друг от друга двумя независимыми патологоанатомами без каких-либо знаний о клинической информации пациентов. Когда мнения двух экспертов по оценке были разные, соглашение было достигнуто путем тщательного обсуждения
Клеточные линии и условия культивирования
желудка человека раковых клеток линии BGC823 и AGS (АТСС номер: CRL-1739). Которые слабо дифференцированы были подарки из Пекинского университета школы онкологии (Пекин, Китай PR.) [25]. Клеточные линии поддерживали в среде RPMI 1640 (Invitrogen), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone), пенициллином (100 ед /мл) и стрептомицином (100 ед /мл) при 37 ° С и ​​5% CO2 в увлажненном инкубаторе .
жизнеспособность клеток анализ
Для анализа влияния на RAD001 клеток рака желудка человека, жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ. RAD001 была предоставлена ​​Novartis Pharma (Базель, Швейцария). Для анализа жизнеспособности, логарифмически растущие клетки стимулировали различными дозами RAD001 (0, 5, 10, 20 и 40 мкМ). В конце периода культивирования, 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ) раствор (Sigma, США) в количестве 0,2 мг /добавляли 20 мкл тетразолия красителя мл в PBS , оптическая плотность при 490 нм (OD490) определяли с помощью считывающего устройства твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Средние величины рассчитывали из трех культур.
Анализе клеточного цикла после
Клетки собирали и фиксировали в 70% этаноле в течение ночи при температуре 4 ° С. Затем клетки промывали и окрашивали пропидийиодидом (PI) (Sigma) 5 мкг /мл. Через 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света, клетки были проанализированы с помощью проточной цитометрии с использованием Becton Dickinson FACScan.
Аннексина V анализ
Образцы промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), и с использованием аннексина V-флуоресцеин изотиоцианат (FITC) и PI окрашивания для определения воздействия фосфатидилсерина на наружной плазматической мембране. После инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света, образцы были количественно определены с помощью проточной цитометрии, используя Becton Dickinson FACScan.
Обратную транскрипцию-PCR
Суммарную РНК экстрагировали с использованием метода TRIzol. РНК с использованием в противоположном направлении Transcripted коммерчески доступного набора (Fermentas, США). Смесь (25 мкл всего) для ПЦР состояла из 0,5 мкл кДНК, 0,5 U Taq ДНК-полимеразы, 2,5 мкл 10 × ПЦР буфера, 2,5 мМ дНТФ смеси и 50 чувств пМ и антисмыслового праймеров каждый. CyclinD1 и C-Myc анализировали с помощью следующих праймеров: CyclinD1 5'GAACAGAAGTGCGAGGAGGAG3 'и обратный праймер 5'AGGCGGTAGTAGGACAGGAAG3'; С-Мус, 5 'CGAGCTGCTGGGAGGAGACAT3' и 5 актин 'AGCCGCCCACTTTTGACA GG3':. 5'GGCACCCAGCACAATGAA 3 'и 5' TAGAAGCATTTGCGGTGG 3 '
Клеточный лизат и Вестерн-блот-анализ
клетки лизируют в буфере для лизиса, и концентрация белка определяли методом красителя Брэдфорда (Bio-Rad Laboratories). Равные количества клеточного экстракта, подвергали SDS-PAGE и переносили на PVDF мембрану (Bio-Rad). Западные анализы блот были сделаны с различными специфическими первичными антителами. Антитела, распознающие фосфо-p70S6K (Thr389), p70S6K, фосфо-МРМ (Ser2448), Bcl-2 и p53 были из Cell Signaling.
Статистический анализ
Первичной конечной точкой нашего исследования была общая выживаемость (OS). Он был определен как период между временем операции и смерти. Безрецидивная выживаемость (БРВ) было время между временем хирургии и рецидива или смерти опухолей, связанных с. Он был проанализирован в качестве вторичного конечной точки. Ассоциация экспрессии р-МРМ с различными clinicalopathologic функциями анализировали с использованием критерия хи-квадрат. Накопительное выживаемость и выживаемость без признаков заболевания оценивались по методу Каплана-Мейера. Лог-ранговый критерий был использован для оценки статистической значимости различий между кривыми выживаемости. была применена модель Кокса пропорционального риска (назад, ступенчато) для многовариантного анализа для факторов, которые достигли значения в univariable анализа. Статистический анализ был проведен с использованием программного обеспечения SPSS (версия 13 для Windows; SPSS, Чикаго, Иллинойс). Различия в P < .05 Считались статистически значимыми.

Результаты клиникопатологическими особенности
В общей сложности 181 пациентов были включены в данное исследование. Средний возраст составил 59 лет (диапазон, 23-83 лет). В клиникопатологическими характеристики исследуемой популяции представлены в таблице 1. 129 пациентов были мужчины и 52 женщины. 77 из 181 опухолей (42,5) были из верхнего желудка, 74 из 181 пациентов (40,9%) были из нижней части живота, а остальные опухоли были из среднего и всего тела желудка. 118 из 181 (65,2%) размера опухоли пациентов были > 4 см, и 63 (34,8%) были ≤ 4 см. В соответствии с критериями Всемирной организации здравоохранения, 4 181 опухолей (2,2%) были хорошо дифференцированы, 55 из 181 опухолей (30,4%) были умеренно дифференцированные, 116 были слабо дифференцированы, и 6 были недифференцированные. Послеоперационный хирургический этап был классифицирован в соответствии с 2002 UICC /AJCC классификации [26] .table 1 клиникопатологическими корреляции экспрессии р-MTOR в раке желудка
Факторы

Все пациенты

No. пациентов (%)

P


<й>
N
= 181 (%)

MTOR отрицательный

MTOR положительный

<й>
Возраст (у)
0,256
&л; 60
95 (52,5) 50
(56,8)
45 (48,4)
≥60
86 (47,5) 38
(43,2)
48 (51,6) <бр> Секс
.926
Мужчина
129 (71,3)
63 (71,6) 66
(71,0)
Женский
52 (28,7) 25
(28,4)
27 (29,0)
сайт
0,053
Верхняя
77 (42,5) 33
(37.5)
44 (47,3)
Средний
28 ( 15,5)
10 (11,4)
18 (19,4)
нижняя
74 (40,9) 43
(48,9)
31 (33,3)
Диффузный
2 ( 1.1)
2 (2.3)
0 (0.0)
размер опухоли
.172
≤ 4 см
63 (34,8) 35
(40,0) 28
(30,1)
> 4 см
118 (65,2)
53 (60,0)
65 (69,9)
тип Бормана
0,398
Ранняя стадия
7 (3,9) 6
( 6.8)
1 (1.1)
I
4 (2.2) страница 2 (2.3)
2 (2.1)
II
65 (35,9) 31
( 35,2)
34 (36.6)
III
101 (55,8)
47 (53,4)
54 (58,1)
IV
4 (2.2) страница 2 ( 2.3)
2 (2.1)
градация
0,999
1
4 (2.2)
2 (2.3)
2 (2.1) страница 2 55 (30,4) 27
(30,7)
28 (30,1) страница 3 из 116 (64,1)
56 (63,6) 60
(64,5) 4
6 (3.3)
3 (3.4)
3 (3.3)
патологической T классификации
0,168
T1
17 (9.4)
12 (13,6)
5 (5.4)
T2
35 (19,3) 18
(20.5)
17 (18.3)
T3
119 (65,7)
55 (62,5)
64 (68,8)
T4
10 (5.5)
3 (3.4)
7 (7.5)
Патологические N статус
0,008
N отрицательное
44 ( 24,3)
29 (33,0) 15
(16.1)
N положительный
137 (75,7)
59 (67,0) 78 (
83,9)
Патологическая стадия (pTNM)
0,026
I
26 (14,4)
17 (19,3)
9 (9.7)
II
47 (26,0) 28
(31,8) <бр> 19 (20,4)
III
100 (55,2)
41 (46,5) 59 (
63,4)
IV
8 (4.4)
2 (2.3) <бр> 6 (6,5) 129
181 пациентов (71,2%) имели более поздних стадиях заболевания Т стадии (PT3 + pT4) и 137 пациентов (75,7%) имели метастазов в лимфатических узлах. Totally пациентов стадии I-IV были 26, 47, 100 и 8 случаев соответственно.
Выражение р-МРМ при раке желудка
Иммуноокрашивание р-МРМ был цитоплазматический и частично перепончатые. На рисунке 1 показаны характерные примеры п-MTOR иммунным окрашиванием. Нормальная слизистая оболочка желудка является отрицательным для р-МРМ. Из 181 пациентов, 93 (51,4%) были р-МРМ-положительных опухолей. Рисунок 1 Примеры п-MTOR иммунным окрашиванием. (А) Нормальная слизистая оболочка желудка является отрицательным для р-МРМ (исходное увеличение х200). (B) Нормальная слизистая оболочка желудка является отрицательным для р-МРМ (исходное увеличение × 400) (C) Положительный выражение р-МРМ при раке желудка (исходное увеличение × 200). (D) Отрицательное выражение р-МРМ при раке желудка (исходное увеличение × 200).
Анализ выживаемости
больных с р-MTOR положительным раком желудка показало значительно короче, без признаков заболевания и общей выживаемости, чем те, с p- MTOR негативный рак желудка (ДФС, 48,9% против 30,1%; р = 0,006; OS, 51,1% против 34,4%; р = 0,011; таблица 2, рисунок 2А, Б). Univariable анализ показал, что продолжительность жизни также снизилась с более высокой пТл классификации (ДФС, р = 0,001; OS, P = .005), метастазов в лимфатических узлах (ДФС, р &ЛТ; 0,0001; OS, P = .001) и передовых pTNM этап (ДФС, р &л; +0,001; OS, P = .001). Там не было никакой связи между DFS или OS и возраста, пола или опухоли size.Table 2 Univariable анализ без признаков заболевания и общей выживаемости при раке желудка
<й>
<й>
Безрецидивная suivival

Общий survival

Characteristic

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

Age(y)
0,343
0,583
&л; 60
95
1.00
1.00
≥60
86
0,834
0.573-1.214
0,898
0.611-1.320 Любительские секс
. 662
.950
Male
129
1.00
1.00
Женский
52
0,909
0.591-1.396
0,986
0.639-1.521
размер опухоли
0,151
0,232
≤4 см
63
1,00
1,00
>
4 см
118
1,345
0.897-2.016
1,287
0.851-1.945
пТл стадии .001
.005
pT1
17
1,00
1,00
pT2
35
1.549
0.558-4.301
.401
1.535
0.553-4.264
.411
pT3
119
3.546
1.437-8.750
.006
3.237
1.310-8.001
.011
pT4
10
4.738
1.547-14.506
.006
4.068
1.289-12.836
.017
pN этап
&л; 0,0001
.001
Отрицательная
44
1.00
1.00
Положительный
137
2,617
1.538-4.451
2,389
1.401- 4,075
pTNM этап
&л; 0,0001
.001
I
26
1.00
1.00
II
47
2.920
1.197-7.121
.018
2.860
1.173-6.973
.021
III
100
4.955
2.152-11.409
< 0,0001
4,455
1.930-10.281
&л; 0,0001
IV
8
7,369
2.470-21.981
&ЛТ; 0,0001
6,103
1.965-18.957
0,002
P-MTOR
0,008
0,013
Негативный
88
1.00
1.00
позитиве
93
1,667
1.146-2.454
1,644
1.112-2.430
Рисунок 2 оценки Каплана-Мейера вероятности выживания. У больных с р-МРМ положительным показали значительно меньшую общую выживаемость (A) и болезни выживаемость без (B) ставки, чем те, с отрицательным выражением р-МРМ. (Р = 0,011 и р = 0,006 соответственно)
В многофакторном анализе, метастазов в лимфатических узлах (ДФС, р = 0,018; OS, P = 0,038). И рТ стадия (ДФС, р = 0,018; OS, P = 0,046) были значимыми независимым прогностическим фактором выживаемости. Кроме того, многофакторного анализа (таблица 3) также показали тенденцию к корреляции между выражением р-МРМ и снижение выживаемости, но эта тенденция не достигала статистической значимости (ДФС, p = .059; OS, P = .070) .table 3 Multivariable Cox регрессионный анализ без признаков заболевания и общей пережитков
<й>
<й> <Ьг> Безрецидивная suivival

Общий survival

Factors

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

p-mTOR
0,059
0,070
Негативный
88
1.00
1.00
Позитивный
93
1,452
0.986-2.138
1,443
0.970-2.147
Проникнув глубина
0,018
0,046
pT1
17
1.00
1.00
pT2
35
1.050
0.366-3.016
0.928
1.078
0.375-3.101
0.889
pT3
119
2.251
0.867-5.845
0.096
2.146
0.823-5.595
0.118
pT4
10
2.926
0.920-9.305
0.069
2.616
2.616-8.580
0.113
Lymph состояние узла
0,018
0,038
Отрицательная
44
1.00
1.00
Позитивный
137
1,981
1.981-3.488
1,828 <бр> 1.034-3.233
RAD001 ингибирует пролиферацию и предотвращает p70S6K фосфорилирования
Для изучения влияния RAD001 на пролиферацию раковых клеток желудка человека линии BGC823 и AGS, мы провели анализ на пролиферацию с 48-часовой экспозиции к RAD001. В результате, RAD001 генерирует значительное торможение на обеих клеточных линий в зависимости от дозы образом. (Рисунок 3А). Рисунок 3 (А) RAD001 ингибирует пролиферацию клеток рака желудка. Клетки рака желудка обрабатывали указанными концентрациями RAD001 в присутствии 10% FBS в течение 48 часов. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ-теста. (B), что фосфорилирование p70S6K было значительно снижено в зависимости от дозы, в обоих AGS и BGC823 клетках путем обработки RAD001. Обе клеточные линии были инкубированы с увеличением дозы RAD001 в течение 48 ч, клеточные лизаты подвергали Вестерн-блот-анализа с фосфорилированным р-S6K и S6K антител.
Западные эксперименты блоттинга были выполнены с RAD001 на 0, 5, 10, 20 мкМ в течение 48 ч. P70S6 киназы является важным нижестоящей мишенью МРМ и его МРМ-зависимого фосфорилирования позволяет трансляцию рибосомных белков. Мы исследовали статус фосфорилирования ниже по потоку целевой p70S6K с помощью иммуноблоттинга. Как показано на фигуре 3В, мы обнаружили, что обработка обеих клеточных линий BGC823 и AGS с RAD001 значительно предотвращают фосфорилирование p70S6K в зависимости от дозы образом.
RAD001 индуцирует арест G0 /G1 клеточного цикла и апоптоза в клетках рака желудка <бр> для того, чтобы определить, является ли подавление пролиферации клеток обусловлены G0 /G1-фазе ареста или апоптоза, распределение клеточного цикла анализировали с помощью ТСМ. На рисунке 4 показано, что лечение BGC823 клеток с RAD001 в течение 48 часов приводило к прочном G1 аресту и способствовало апоптозу. С увеличением дозы RAD001, все больше и больше клетки оставались в G1-фазе, в то время как прогрессию клеточного цикла в фазе S уменьшалась (фиг.4А). ОТ-ПЦР анализ показал RAD001 дозозависимо снижал уровень мРНК циклина D1 и с-Мус (рис 4б). Рисунок 4 RAD001 индуцирует остановку клеточного цикла и апоптоз в клетках BGC823. (A) BGC823 клетки подвергали воздействию различных концентраций RAD001 в течение 48 ч. (Б) РНК экстрагировали из клеток. Циклин D1 и уровень экспрессии С-Мус были обнаружены с помощью ОТ-ПЦР, актина в качестве управления загрузкой. (С) Клетки инкубировали в течение 48 часов с использованием указанной дозы RAD001 перед тем окрашиванием аннексина V-FITC. Отображаются процент апоптотических клеток. (D) Клетки инкубировали в течение 48 часов с указанными дозами RAD001. Клетки собирали, лизировали и подвергали Вестерн-блот-анализа с Bcl-2 и p53 антителами. GAPDH, был использован в качестве нагрузочного контроля.
Аннексина-V анализы показали, что RAD001 значительно индуцированный апоптоз в клетках BGC823. Увеличение скорости апоптоза анализировали с помощью FCM с увеличением дозы (фиг.4С). Вестерн-блот-анализ показал, RAD001 дозозависимо снижает уровень белка Bcl-2 и повышение уровня белка р53 (рис 4D). Аналогичные результаты наблюдались в AGS клетках (данные не показаны).
Обсуждение
Мишень рапамицина у млекопитающих (МРМ) был обнаружен в начале 1990-х годов в изучении механизма действия рапамицина, который первоначально был обнаружен как противогрибковое средство, а затем был признан в качестве противораковых свойств [27]. В качестве протеинкиназы Ser /Thr, МРМ играет ключевую роль в клеточном росте и гомеостаза [28]. Белок MTOR образует комплекс с адаптером белков, mTORC1 (мишени рапамицина у млекопитающих комплекса 1) и mTORC2. Активация mTORC1 регулирует рост клеток путем модуляции синтеза белка, биогенеза рибосом и аутофагии [29]. MTORC2 путь играет ключевую роль в активации Akt, как PDK1 (3-фосфоинозитидного-зависимой протеинкиназы 1) и PI3K, потенциальная мишень лекарственного средства для лечения рака, в котором есть Akt дерегулирование [26].
В текущем исследовании, мы наблюдали, что 93 (51,4%) пациентов имели положительную экспрессию р-МРМ в 181 больных раком желудка. В соответствии с нашим результатом, в другом исследовании, в том числе 1072 пациентов, экспрессия р-МРМ составляет 46,5% [30].
Предыдущие исследования сообщили о прогностической значимости экспрессии р-МРМ. Хербергер и др [18]. определены п-MTOR быть независимым прогностическим фактором смерти у больных с билиарной аденокарциномы тракта. В своем исследовании, общая выживаемость была значительно короче у пациентов с р-МРМ-позитивных опухолей по сравнению с пациентами с п-МРМ-отрицательных опухолей (р = 0,004). При раке желудка, Ю. и др. оценивали экспрессию р-МРМ в 1072 больных раком желудка с использованием микрочипов ткани, демонстрируя оверэкспрессия р-МРМ был независимым прогностическим фактором [30]. Тем не менее, в исследование были включены 109 больных с желудочной аденокарциномы, перенесших радикальную гастрэктомию [31], Мураяма и др. найдено ни цитоплазматический п-МРМ, ни ядерная п-МРМ был независимым прогностическим фактором, хотя они идентифицировали цитоплазматической экспрессии р-МРМ была связана с низкой выживаемостью и коррелирует с глубиной инвазии опухоли, лимфатических узлов и стадии опухоли. В настоящем исследовании мы подтвердили, что классификация рТ и состояние лимфатических узлов являются независимыми прогностическим индикатором клинического исхода у больных раком желудка с помощью многофакторных анализов. Однако, поскольку большинство пациентов присутствующих с местно-распространенным заболеванием, других вторичных прогностических маркеров, в частности, п-МРМ, могут быть использованы [13]. Наши результаты ясно показывают, что выражение р-MTOR сильно коррелирует с плохим общим и безрецидивной выживаемости в univariable анализе с тенденцией к корреляции в многофакторных анализов.
В соответствии с нашим текущим исследования, некоторые исследования также признали антипролиферативное действие ингибиторы МРМ в желудочном раковых клеток. Например, Ланг и др [21]. идентифицированный рапамицин может ингибировать желудочный рост раковых клеток как в модели подкожной опухоли и в экспериментальной модели. Их результаты указывают на пригодность ингибиторов МРМ для использования в антиангиогенного контексте для терапии рака желудка.
Однако RAD001 новый ингибитор МРМ в качестве противоракового агента. Механизм о RAD001 при раке желудка не ясна. Cejka и др. показал антиангиогенного активность RAD001 в сочетании с высокой дозой циклофосфамида показали синергетическое противоопухолевую активность против рака желудка [32]. Они также установили, что RAD001 уменьшилось пролиферацию и ослабленный выработку HIF-1, а также VEGF в клетках рака желудка в пробирке [33]. В текущем исследовании, наши данные показали, что RAD001-терапия ослабляются фосфорилирования p70S6K и заметно ингибирует пролиферацию клеток рака желудка путем остановки клеточного цикла и апоптоза в пробирке. Мы нашли RAD001 индуцируется фаза арест G0 /G1, который был связан со снижением циклин D1 и C-Myc. Более того, мы показали в первый раз, что RAD001 в качестве нового ингибитора MTOR дозозависимо индуцированного апоптоза в раковых клетках желудка с помощью аннексина V анализов. Этот эффект может быть продиктован сотовой связи и вниз по течению целей, включая P53 и Bcl-2. Эти результаты могут дополнительно объяснить эффективность RAD001.
Заключение
В целом, мы провели исследование, чтобы систематическую МРМ при раке желудка, показывающие соотношение выражение со значением прогноза активированного МРМ (п-МРМ) в естественных условиях, эффект RAD001 и часть механизмов клеток рака желудка в пробирке. Наши результаты показали, что п-МРМ будет служить в качестве потенциального биологического маркера, чтобы определить подгруппу больных раком желудка с плохим прогнозом. Он также показал, что RAD001 был многообещающим агентом для лечения рака желудка с индуцировать остановку клеточного цикла и апоптоза путем снижения регуляции экспрессии с-Мус, CyclinD1 и Bcl-2, повышающей регуляции экспрессии P53. Необходимы дальнейшие исследования для выяснения роли активации МРМ и в конечном итоге предложить MTOR в качестве конкретной цели для терапии рака желудка
Примечание
Грант поддержка:. При поддержке Национального Высокие технологии Исследования и разработки (863) Программа Китай
Notes
Da-чжи Сюй, Ци-Ронг Гэн внесли одинаковый вклад в эту работу.
декларациях
Выражение признательности
Эта работа была поддержана (863) программа Национального высоких технологий исследований и разработок Китай. Авторы ценят отличную техническую помощь Ли-хуэй Ван Фэй-мэн Чжэн Чжэн-чжи Зу Ян Чжан и Zi-цзе Лонг.
Авторы 'оригинальные файлы, представленные для изображений изображения Ниже приведены ссылки на оригинальный авторов представлены файлы для изображений. 'Исходный файл для фигурного 1 12885_2009_2335_MOESM2_ESM.pdf Авторского 12885_2009_2335_MOESM1_ESM.pdf авторов исходного файла для фигурного 2 12885_2009_2335_MOESM3_ESM.pdf Авторского исходного файла для фигурного 3 12885_2009_2335_MOESM4_ESM.pdf Авторского оригинальный файл на рисунке 4 Конкурирующие интересы
Авторы заявляют, что они нет конкурирующих интересов.

• Прогностический эффект от их этнической принадлежности для желудка и рака пищевода: опыт населения на основе…
• Выявление прогностических факторов и хирургических показаний к метастатическим раком желудка