cible mammalienne de la rapamycine Activé est une cible thérapeutique potentielle dans cancer

gastrique Activé cible mammalienne de la rapamycine est une cible thérapeutique potentielle dans le cancer gastrique
Résumé de l'arrière-plan
La cible mammalienne de la rapamycine (mTOR) joue un rôle clé dans la la croissance et de l'homéostasie cellulaire. Le but de notre étude est d'étudier l'expression de mTOR activé (p-mTOR) chez les patients atteints de cancer gastrique, leur signification pronostique et l'effet de l'inhibition de RAD001 sur la croissance de la tumeur et de déterminer si l'inhibition ciblée de mTOR pourrait être une stratégie thérapeutique potentielle pour le cancer gastrique.
Méthodes
L'expression de p-mTOR a été détectée dans des échantillons de 181 cancers gastriques qui ont subi une résection radicale (R0) par immunohistochimie. La corrélation de p-mTOR expression aux caractéristiques clinicopathologiques et la survie du cancer gastrique a été étudié. Nous avons également déterminé l'effet de l'inhibition de RAD001 sur la croissance de la tumeur en utilisant des lignées humaines gastriques BGC823 et AGS cellules cancéreuses.
Résultats de immunocoloration pour le p-mTOR a été positive dans 93 des 181 (51,4%) des cancers gastriques, étroitement corrélée à la lymphe état des nœuds et le stade pTNM. Les patients atteints de p-mTOR positifs ont montré la survie significativement plus courte sans maladie (DFS) et la survie globale (OS) des taux que ceux avec des tumeurs p-mTOR-négatives dans les analyses univariées, et il y avait une tendance vers une corrélation entre l'expression p-mTOR et la survie dans les analyses multivariées. RAD001 nettement inhibé la prolifération dépendante de la dose de cellules de carcinome gastrique humain par l'expression de la régulation à la baisse de la p70S6K, le p-p70S6K, c-myc, CyclinD1 et Bcl-2, régulant à la hausse l'expression de la P53.
Conclusions gastrique
cancer, p-mTOR est une cible thérapeutique potentielle et RAD001 était un agent de traitement prometteur avec induisant l'arrestation et l'apoptose du cycle cellulaire par régulation expression de C-myc, CyclinD1 et Bcl-2, up-régulation de l'expression de P53.
carcinome gastrique de fond est le quatrième cancer le plus fréquent et la deuxième cause de décès liés au cancer dans le monde, dont 1 million de nouveaux cas par an dans le monde [1]. Environ 60% des nouveaux cas de cancer de l'estomac se produisent dans l'est de l'Asie [2], en particulier en Chine. La résection chirurgicale est le traitement le plus efficace pour le cancer gastrique et l'efficacité de la chimiothérapie reste limitée [3]. De nombreuses études ont montré que la profondeur de l'invasion et le nombre de ganglions métastatiques sont les prédicteurs puissants les plus importants de la survie pour les patients atteints de cancer gastrique [4, 5]. Par exemple, dans des études antérieures [6, 7] le rapport des ganglions lymphatiques, nous avons trouvé positif est un indicateur pronostique indépendant D2 après résection et la chimiothérapie intrapéritonéale peut être bénéfique pour les patients atteints de cancer gastrique. Cependant, une étape fondamentale vers l'amélioration des résultats cliniques réside dans la compréhension du comportement biologique de la tumeur, ce qui peut aider à identifier les cibles possibles pour la thérapie individuelle [8, 9].
Au cours des dernières années, moléculairement approches pour le traitement à base de cancer de l'estomac a été donné une grande préoccupation. Plusieurs articles ont décrit des cibles moléculaires potentielles pour une thérapie du cancer gastrique, tel que le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) [13/10], le facteur vasculaire de croissance endothéliale (VEGF) [14], recepteur d'origine nantais (RON) [15 ].
La cible mammalienne de la rapamycine (mTOR) est une nouvelle cible moléculaire potentielle pour la thérapie anticancéreuse. Son expression a été démontrée dans diverses lignées cellulaires et des échantillons de tumeur, tels que les néoplasmes du foie [16], le cancer du sein [17], un adénocarcinome des voies biliaires [18] et le cancer du col [19, 20]. Ces études ont montré que l'expression de mTOR a été associée à un mauvais pronostic clinique. Lang et al [21]. ont également observé une activation de mTOR dans le cancer gastrique humain in vitro et in vivo. Ils ont indiqué mTOR est souvent activée dans le cancer gastrique humain. Récemment, un dérivé biodisponible par voie orale de la rapamycine, RAD001 (everolimus, Novartis Pharma AG), a été développé. Un essai de phase III traitement révélé avec l'évérolimus prolonge la survie sans progression chez les patients atteints de carcinome rénal métastatique qui avaient progressé sur d'autres thérapies ciblées [22]. RAD001 a également été démontré pour inhiber la prolifération de la croissance des cellules tumorales dans certains cancers [23, 24]. Mais le rôle de RAD001 dans la cellule des cancers gastriques est pas claire.
Les objectifs de cette étude étaient d'analyser davantage les relations de l'expression de mTOR avec la valeur de pronostic de activé mTOR (p-mTOR), l'effet de RAD001 sur la croissance Méthodes de et cycle cellulaire des cellules cancéreuses gastriques humaines in vitro et de déterminer si le cancer gastrique est un bon candidat pour la thérapie cible avec des inhibiteurs de mTOR.
patients étudiés
Cette étude rétrospective est composée de 181 patients ayant subi une résection radicale ( R0) pour histologiquement confirmé carcinome gastrique de Cancer Center de l'Université Sun Yat-sen entre Janvier 1997 et Décembre 2002. Tous les patients avec histologiquement confirmé l'adénocarcinome de l'estomac avait subi soit une gastrectomie partielle proximale, gastrectomie partielle distale ou gastrectomie totale. L'approbation éthique a été obtenu à partir de comité d'éthique de la recherche Sun Yat-sen University Cancer Center.
Ceux avec du matériel histologique adéquat et des données cliniques complètes ont été admissibles à l'inscription. Les critères d'admissibilité inclus également histologiquement confirmé résection R0, qui a été définie comme aucune tumeur résiduelle macroscopique et microscopique et postopératoire temps de survie ≥ 6 mois. Les patients atteints de métastases à distance et le carcinome du moignon gastrique après résection pour une maladie bénigne ont été exclus de l'étude. La raison en est que la survie des patients atteints de métastases à distance est souvent affectée par de nombreux autres facteurs, comme la chimiothérapie ou une obstruction préopératoire
Tous les patients avaient suivi après la chirurgie de 6 à 12 mois d'intervalle. la date limite de suivi a été Décembre 2008. Median période de suivi était de 50 (moyenne: 50,66; intervalle de 10 à 128) mois pour tous les patients, et 74 mois (moyenne: 72,80; gamme 27-128) pour la survie. La durée médiane de suivi était de 40 (moyenne: 43,71; entre 11 et 125) pour les patients qui ont eu des tumeurs d'expression positive p-mTOR, et 60,5 mois (moyenne: 58.01; gamme 10-128) pour l'expression négative. La survie a été calculée à partir de la date du diagnostic jusqu'à la date du décès ou le dernier suivi.
Prélèvement d'échantillons et immunocoloration pour le p-mTOR
Tous les échantillons de tumeurs ont été obtenus à partir de cancers gastriques réséqués chirurgicalement avant traitement adjuvant. , des blocs de tissus en paraffine fixées au formol ont été stockés à température ambiante identifié par un numéro d'identification. coupes de tissus cinq um d'épaisseur ont été découpées à partir des blocs de paraffine, déparaffinées dans du xylene et réhydratées. la récupération antigénique a été traitée avec du citrate de sodium. Les lames ont ensuite été incubées dans 0,3% de H 2 O 2 pendant 10 minutes et bloquées dans 1% d'albumine de sérum bovin pendant 60 minutes, suivi d'un anticorps monoclonal de lapin spécifique pour le p-mTOR (Phospho-mTOR Ser2448, 49F9; Cell Signaling Technology) à 4 ° C pendant une nuit, puis colorées avec 3,3-diaminobenzidine. Après la visualisation de immunoréactivité, les sections ont été colorées avec de l'hématoxyline puis montés.
Évaluation de coloration immunohistochimique
Les sections immunocolorées ont été évalués et les tissus des adénocarcinomes de la prostate humains ont servi de contrôle positif. Selon les critères récemment décrits pour l'expression cote de mTOR, intensité de la coloration a été déterminée comme 0 (absent), 1 (faible), et 2 (forte) et les niveaux des biomarqueurs d'expression ont été semiquantified en utilisant un score de immunohistochimie (gamme, 0-200) calculé en multipliant l'intensité de la coloration avec le pourcentage de cellules tumorales positives [18]. Les patients ayant un score de immunohistochimie ≤ 20 ont été considérés comme p-mTOR négatif et ceux avec un score de > 20, comme p-mTOR positif. Toutes les lames ont été évalués indépendamment par deux pathologistes indépendants sans aucune connaissance de l'information clinique des patients. Lorsque les opinions des deux évaluateurs étaient différents, un accord a été conclu par une discussion approfondie
lignées cellulaires et conditions de culture
humaines lignées cellulaires de cancer gastrique BGC823 et AGS (numéro ATCC: CRL-1739). Qui sont peu différenciés étaient des cadeaux de l'école de Pékin Université d'oncologie (Beijing, Chine.) [25]. Les lignées cellulaires ont été maintenues dans du milieu RPMI 1640 (Invitrogen) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (Hyclone), de la pénicilline (100 unités /ml) et de la streptomycine (100 unités /ml) à 37 ° C et 5% de CO2 dans un incubateur humidifié .
test de viabilité cellulaire
Pour analyser l'effet de RAD001 sur les cellules cancéreuses gastriques humaines, la viabilité cellulaire a été déterminée par un test MTT. RAD001 a été fourni par Novartis Pharma (Bâle, Suisse). Pour le dosage de la viabilité des cellules en croissance logarithmique ont été stimulées avec différentes doses de RAD001 (0, 5, 10, 20 et 40 uM). A la fin de la période de culture, 20 pl de colorant au tétrazolium le 3- (4,5-diméthylthiazole-2-yl) -2,5- bromure de diphényltétrazolium (MTT) (Sigma, États-Unis) à une solution de 0,2 mg /ml a été ajouté dans du PBS la densité optique à 490 nm (DO490) a été déterminée en utilisant un dosage immuno-enzymatique (ELISA) lecteur. Les valeurs moyennes ont été calculées à partir de cultures en triple exemplaire. Les cellules
analyse du cycle cellulaire ont été recueillies et fixées dans 70% d'éthanol pendant une nuit à 4 ° C. Les cellules ont ensuite été lavées et colorées avec de l'iodure de propidium (PI) (Sigma) à 5 pg /ml. Après 30 min à température ambiante à l'abri de la lumière, les cellules ont été analysées par cytométrie en flux en utilisant un FACScan Becton Dickinson. V
dosage de l'annexine
Les échantillons ont été lavés avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et en utilisant l'annexine V-fluorescéine isothiocyanate (FITC) et PI coloration pour la détermination de l'exposition à la phosphatidylsérine sur la membrane plasmatique externe. Après incubation pendant 30 min à température ambiante à l'abri de la lumière, les échantillons ont été quantifiés par cytométrie en flux, en utilisant un FACScan Becton Dickinson.
Inverse de l'ARN total à la transcription-PCR a été extrait en utilisant la méthode Trizol. L'ARN a été transcrit en inverse en utilisant un kit disponible dans le commerce (Fermentas, USA). Le mélange (25 pi au total) pour la PCR est composée de 0,5 ADNc ul, 0,5 U d'ADN Taq polymérase, 2,5 pi de tampon 10 x PCR, 2,5 mM mélange dNTP, et 50 sens pM et antisens amorces chacun. CyclinD1 et C-myc ont été analysés par les amorces suivantes: CyclinD1 5'GAACAGAAGTGCGAGGAGGAG3 'et inverse 5'AGGCGGTAGTAGGACAGGAAG3 amorce'; C-myc, 5 'CGAGCTGCTGGGAGGAGACAT3' et 5 Actin AGCCGCCCACTTTTGACA GG3 '. 5'GGCACCCAGCACAATGAA 3' et 5 'TAGAAGCATTTGCGGTGG 3'
lysat cellulaire et l'analyse par transfert de Western
Les cellules ont été lysées dans un tampon de lyse et la concentration de protéine a été déterminée par la méthode de colorant de Bradford (Bio-Rad Laboratories). Des quantités égales d'extraits cellulaires ont été soumis à SDS-PAGE et transférées sur une membrane PVDF (Bio-Rad). analyses Western blot ont été réalisées avec différents anticorps primaires spécifiques. Anticorps reconnaissant phospho-p70S6K (Thr389), p70S6K, phospho-mTOR (Ser2448), Bcl-2 et p53 étaient de Cell Signaling analyse de. Statistique
Le point final primaire de notre étude était la survie globale (OS). Il a été défini comme la période entre le moment de la chirurgie et la mort. La survie sans maladie (DFS) est le temps entre le moment de la chirurgie et de rechute ou de décès liée à la tumeur. Il a été analysé comme un point final secondaire. L'association d'expression p-mTOR avec diverses caractéristiques clinicalopathologic a été analysée en utilisant le test du chi carré. la survie cumulative et la survie sans maladie ont été estimées par la méthode de Kaplan-Meier. Le test du log-rank a été utilisé pour évaluer la signification statistique des différences entre les courbes de survie. Un modèle de Cox proportionnelle des risques (en arrière, pas à pas) pour l'analyse multivariée a été appliquée pour les facteurs qui ont atteint une signification dans l'analyse univariée. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel SPSS (version 13 pour Windows, SPSS, Chicago, IL). Différences de P < .05 Ont été considérées comme statistiquement significatives.
Caractéristiques clinicopathologiques de résultats
Un total de 181 patients ont été inclus dans cette étude. L'âge médian était de 59 ans (plage, 23-83 ans). Les caractéristiques clinicopathologiques de la population de l'étude sont résumés dans le tableau 1. 129 patients étaient des hommes et 52 femmes. 77 181 tumeurs (42,5) provenaient de l'estomac supérieur, 74 181 patients (40,9%) étaient de la partie inférieure de l'estomac, et les tumeurs restantes provenaient du corps intermédiaire et l'ensemble de l'estomac. 118 181 (65,2%) de la taille de la tumeur des patients étaient > 4 cm, et 63 (34,8%) étaient ≤ 4 cm. Conformément aux critères de l'Organisation mondiale de la Santé, 4 181 tumeurs (2,2%) étaient bien différenciés, 55 181 tumeurs (30,4%) ont été modérément différenciées, 116 étaient peu différenciés, et 6 étaient indifférenciée. étape chirurgicale post-opératoire a été classé en fonction de la /classification AJCC 2002 UICC [26] .Tableau 1 de corrélation clinicopathologique d'expression p-mTOR dans le cancer gastrique
Facteurs
Tous les patients
No. des patients (%)
P

N
= 181 (%)
mTOR négative
mTOR positif

âge (y)
.256
< 60
95 (52,5)
50 (56,8)
45 (48,4)
≥60
86 (47,5)
38 (43,2)
48 (51,6)
Sex
0,926 Masculin
129 (71,3)
63 (71,6)
66 (71,0)
Femme
52 (28,7)
25 (28,4)
27 (29,0) site officiel
.053
Upper
77 (42,5)
33 (37,5)
44 (47,3)
Moyen
28 ( 15.5)
10 (11.4)
18 (19,4)
inférieure
74 (40,9)
43 (48,9)
31 (33,3)
diffuse
2 ( 1.1)
2 (2.3)
0 (0,0)
Tumor taille
.172
≤ 4 cm
63 (34,8)
35 (40,0) 28
(30.1)
> 4 cm
118 (65,2)
53 (60,0)
65 (69,9)
Type Borrmann
0,398
stade précoce
7 (3,9)
6 ( 6.8)
1 (1.1)
I
4 (2.2)
2 (2.3)
2 (2.1)
II
65 (35,9)
31 ( 35.2)
34 (36,6)
III
101 (55,8)
47 (53,4)
54 (58,1)
IV
4 (2.2)
2 ( 2.3)
2 (2.1)
classement
.999 1
4 (2.2)
2 (2.3)
2 (2.1) 2
55 (30,4)
27 (30,7)
28 (30,1) 3
116 (64,1)
56 (63,6)
60 (64,5) 4
6 (3.3)
3 (3.4)
3 (3.3)
anatomopathologique T classement
.168
T1
17 (9.4)
12 (13,6)
5 (5.4)
T2
35 (19,3)
18 (20,5)
17 (18.3)
T3
119 (65,7)
55 (62,5)
statut 64 (68,8)
T4
10 (5.5)
3 (3.4)
7 (7.5)
anatomopathologique N
.008
N négatif
44 ( 24.3)
29 (33,0)
15 (16.1)
N stade positif
137 (75,7)
59 (67,0)
78 (83,9)
pathologique (pTNM)
.026
I
26 (14.4)
17 (19,3)
9 (9.7)
II
47 (26,0)
28 (31,8)
19 (20,4)
III
100 (55,2)
41 (46,5)
59 (63,4)
IV
8 (4.4)
2 (2.3)
6 (6.5)
129 181 patients (71,2%) avaient une maladie de stade T plus avancé (PT3 + PT4), et 137 patients (75,7%) avaient des métastases ganglionnaires. Totally patients de la phase I-IV étaient 26, 47, 100 et 8 cas, respectivement.
P-mTOR expression dans le cancer gastrique
Immunomarquage de p-mTOR était cytoplasmique et en partie membraneuse. La figure 1 montre des exemples représentatifs de p-mTOR immunocoloration. La muqueuse gastrique normale est négatif pour le p-mTOR. Sur les 181 patients, 93 (51,4%) étaient des tumeurs p-mTOR positifs. Figure 1 Exemples de p-mTOR immunocoloration. (A) La muqueuse gastrique normale est négatif pour le p-mTOR (de grossissement x 200). (B) La muqueuse gastrique normale est négatif pour le p-mTOR (de grossissement × 400) (C) expression positive de p-mTOR dans le cancer gastrique (grossissement x 200). (D) d'expression négative de p-mTOR dans le cancer gastrique (grossissement x 200). L'analyse de survie

patients avec p-mTOR cancer gastrique positif a montré significativement plus court sans maladie et la survie globale que ceux avec p- cancer gastrique mTOR négatif (DFS, 48,9% versus 30,1%; p = 0,006; OS, 51,1% versus 34,4%; p = 0,011; tableau 2; Figure 2A, B). analyse univariée a révélé que le temps de survie a également diminué avec une meilleure classification pT (DFS, p = .001; OS, P = .005), métastase ganglionnaire (DFS, p < 0,0001; OS, P = .001) et pTNM avancée étape (DFS, p < .001; OS, P = .001). Il n'y avait pas d'association entre DFS ou OS et l'âge, le sexe ou la tumeur size.Table 2 Analyse univariée des sans maladie et la survie globale dans le cancer gastrique


sans maladie suivival
global survival

Characteristic

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

Age(y)
0,343
0,583
< 60
95
1.00
1.00
≥60
86
0,834
0,573 à 1,214
0,898
0,611 à 1,320
Sex
. 129
1.00
1.00
Femme de 662
0,950
Homme
52
0,909
0,591 à 1,396
0,986
0,639 à 1,521
taille de la tumeur
.151 .232

≤4 cm
63
1,00
1,00
> 4 cm
118
1.345
0,897 à 2,016
1.287
0,851 à 1,945
stade de pT
.001 .005

pT1
17
1,00
1,00
pT2
35
1.549
0.558-4.301
.401
1.535
0.553-4.264
.411
pT3
119
3.546
1.437-8.750
.006
3.237
1.310-8.001
.011
pT4
10
4.738
1.547-14.506
.006
4.068
1.289-12.836
.017
pN stade
< .0001
.001
Négatif 44
1,00
1,00
positif
137
2.617
1,538 à 4,451
2.389
1.401- 4.075
pTNM stade
< .0001
.001
I
26
1,00
1,00
II
47
2.920
1.197-7.121
.018
2.860
1.173-6.973
.021
III
100
4.955
2.152-11.409
< .0001
4.455
1,930 à 10,281
< .0001
IV 8
7.369
2,470 à 21,981
< .0001
6.103
1,965 à 18,957
.002 .008

.013
Négatif de
p-mTOR 88
1,00
1,00
93
1.667
1,146 à 2,454
1.644
1,112 à 2,430
Figure 2 estimations de Kaplan-Meier de la probabilité de survie positives de. Les patients atteints de p-mTOR positifs ont montré la survie globale significativement plus courte (A) et les taux que ceux avec p-mTOR expression négative sans maladie survie (B). (P = 0,011 et p = 0,006, respectivement)
En analyse multivariée, métastase ganglionnaire (DFS, p = 0,018; OS, P = 0,038). Et le stade pT (DFS, p = 0,018; OS, P = 0,046) étaient facteur pronostique indépendant important pour le temps de survie. En outre, l'analyse multivariée (tableau 3) a également indiqué une tendance vers une corrélation entre l'expression p-mTOR et une diminution de la survie, mais la tendance n'a pas atteint la signification statistique (DFS, p = 0,059; OS, P = 0,070) .Table 3 multivariable analyse de régression cox de survies sans maladie et l'ensemble


suivival
sans maladie globale survival

Factors

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

p-mTOR
0,059
0,070
Négatif
88
1,00
1,00
Positive
93
1.452
0,986 à 2,138
1.443
0,970 à 2,147
infiltrant profondeur
0,018
0,046
pT1
17
1,00
1,00
pT2
35
1.050
0.366-3.016
0.928
1.078
0.375-3.101
0.889
pT3
119
2.251
0.867-5.845
0.096
2.146
0.823-5.595
0.118
pT4
10
2.926
0.920-9.305
0.069
2.616
2.616-8.580
0.113
Lymph état du noeud
0,018
0,038
Négatif
44
1,00
1,00
positif
137
1.981
1,981 à 3,488
1.828
1,034 à 3,233
RAD001 inhibe la prolifération et empêche la phosphorylation p70S6K
pour étudier les effets de RAD001 sur la prolifération de lignées cellulaires de cancer gastriques humaines BGC823 et AGS, nous avons effectué des tests de prolifération avec une exposition de 48 heures à RAD001. Par conséquent, RAD001 génère une inhibition significative sur les deux lignées cellulaires d'une manière dépendante de la dose. (Figure 3A). La figure 3 (A) RAD001 inhibe la prolifération des cellules cancéreuses gastriques. les cellules de cancer de l'estomac ont été traitées avec les concentrations indiquées de RAD001 en présence de 10% de FBS pendant 48 h. La viabilité cellulaire a été évaluée par un test MTT. (B) La phosphorylation de p70S6K est significativement diminuée d'une manière dépendante de la dose dans les deux cellules AGS et BGC823 par le traitement avec RAD001. Les deux lignées cellulaires ont été incubées avec l'augmentation de la dose de RAD001 pendant 48 h, des lysats cellulaires ont été soumis à une analyse Western Blot avec des anticorps p-S6K et S6K phosphorylés.
Expériences de Western blot ont été réalisées avec RAD001 à 0, 5, 10, 20 pM pendant 48 h. P70S6 kinase est une cible en aval importante de mTOR et sa phosphorylation de mTOR dépendante permet la traduction des protéines ribosomiques. Nous avons examiné l'état de phosphorylation de l'aval p70S6K cible par immunoblot. Comme on le voit sur la figure 3B, on a trouvé que le traitement des deux lignées cellulaires BGC823 et AGS avec RAD001 empêche significativement la phosphorylation de p70S6K d'une manière dose-dépendante.
RAD001 induit un arrêt du cycle cellulaire G0 /G1 et de l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques
pour déterminer si la suppression de la prolifération cellulaire était due à G0 /G1 arrêt ou de l'apoptose phase, la distribution du cycle cellulaire a été analysée par FCM. La figure 4 montre que le traitement des BGC823 cellules avec RAD001 pendant 48 heures a entraîné une arrestation G1 robuste et promu l'apoptose. Avec l'augmentation de la dose de RAD001, des cellules de plus en plus sont restés dans la phase G1, tandis que la progression du cycle cellulaire en phase S a diminué (figure 4A). La RT-PCR a révélé l'analyse RAD001 dose-dépendante une diminution du niveau de la cycline D1 et C-myc (figure 4B) de l'ARNm. La figure 4 RAD001 induit un arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose dans les cellules BGC823. (A) BGC823 cellules ont été exposées à différentes concentrations de RAD001 pendant 48 h. (B) l'ARN ont été extraits à partir des cellules. La cycline D1 et le niveau d'expression de C-myc ont été détectés par RT-PCR, l'actine comme témoin de chargement. (C) Les cellules ont été incubées pendant 48 heures avec des doses indiquées de RAD001 avant coloration avec de l'annexine V-FITC. Les pourcentages de cellules apoptotiques sont affichées. (D) Les cellules ont été incubées pendant 48 heures avec des doses indiquées de RAD001. Les cellules ont été collectées, lysées et soumises à une analyse par transfert de Western avec la protéine Bcl-2 et p53 anticorps. GAPDH a été utilisé comme témoin de chargement.
Essais annexine-V montrent que RAD001 induit de manière significative l'apoptose dans les cellules BGC823. Une augmentation du taux d'apoptose a été analysée par FCM avec l'augmentation de la dose (figure 4C). L'analyse Western blot a montré la diminution RAD001 dose-dépendante du niveau de protéine Bcl-2 et en augmentant le niveau de la protéine p53 (figure 4D). Des résultats similaires ont été observés dans les cellules AGS (données non présentées) Rapport The cible mammalienne de la rapamycine (mTOR) de. a été découverte au début des années 1990 s dans l'étude du mécanisme d'action de la rapamycine, qui a été trouvée à l'origine en tant que agent antifongique et a ensuite été reconnu comme propriétés anticancéreuses [27]. Comme une protéine kinase Ser /Thr, mTOR joue un rôle clé dans la croissance cellulaire et de l'homéostasie [28]. La protéine mTOR forme un complexe avec des protéines adaptatrices, mTORC1 (cible mammalienne de la rapamycine du complexe 1) et mTORC2. L'activation de mTORC1 régule la croissance cellulaire par la modulation de la synthèse de protéine, la biogenèse des ribosomes et autophagy [29]. La voie de mTORC2 joue un rôle clé d'activation Akt, comme PDK1 (protéine 3-phosphoinositide-dépendante kinase 1) et PI3K, une cible thérapeutique potentielle pour les cancers dans lesquels il y a déréglementation Akt [26].
Dans l'étude actuelle, nous avons constaté que 93 (51,4%) patients avaient une expression positive de p-mTOR dans 181 patients atteints de cancer gastrique. Conformément à notre résultat, dans une autre étude, y compris 1072 patients, l'expression de p-mTOR est de 46,5% [30].
Des études antérieures ont rapporté la signification pronostique d'expression p-mTOR. Herberger et al [18]. identifié p-mTOR pour être un facteur pronostique indépendant de décès chez les patients atteints d'un adénocarcinome des voies biliaires. Dans leur étude, la survie globale était significativement plus courte chez les patients atteints de tumeurs p-mTOR positif par rapport aux patients atteints de tumeurs p-mTOR négatif (P = 0,004). Dans le cancer gastrique, Yu et al. expression évaluée de p-mTOR dans 1.072 patients atteints de cancer gastrique en utilisant un microréseau tissulaire, ce qui démontre la surexpression de p-mTOR était un facteur pronostique indépendant [30]. Cependant, dans une étude inclus 109 patients atteints d'adénocarcinomes gastriques qui ont subi une gastrectomie radicale [31], Murayama et al. trouvé ni cytoplasmique p-mTOR, ni nucléaire p-mTOR était facteur pronostique indépendant, mais ils ont identifié cytoplasmique expression p-mTOR a été associée à une survie plus pauvres et en corrélation avec la profondeur de l'invasion tumorale, les ganglions lymphatiques et le stade de la tumeur. Dans la présente étude, nous avons confirmé que la classification pT et le statut ganglionnaire sont indicateur pronostique indépendant de résultats cliniques chez les patients atteints de cancer gastrique par des analyses multivariées. Cependant, parce que la plupart des patients présentent une maladie localement avancée, d'autres marqueurs pronostiques secondaires, en particulier p-mTOR, peuvent être utiles [13]. Nos résultats montrent clairement que l'expression p-mTOR est fortement corrélée avec la survie globale et sans maladie des pauvres dans les analyses univariées avec une tendance à la corrélation dans les analyses multivariées.
Conformément à notre étude actuelle, plusieurs études ont également reconnu les effets anti-prolifératifs de les inhibiteurs de mTOR dans les cellules de cancer gastrique. Par exemple, Lang et al [21]. rapamycine identifié peut inhiber la croissance gastrique des cellules cancéreuses à la fois dans un modèle de tumeur sous-cutanée et dans un modèle expérimental. Leurs résultats mettent en évidence l'aptitude des inhibiteurs de mTOR à être utilisé dans un contexte anti-angiogénique pour le traitement du cancer gastrique.
Cependant, RAD001 est un nouvel inhibiteur de mTOR comme agent anti-cancéreux. Le mécanisme à propos de RAD001 dans le cancer gastrique est pas clair. Cejka et al. a montré l'activité antiangiogénique de RAD001 combinée à une forte dose de cyclophosphamide a révélé une activité antitumorale synergique contre le cancer gastrique [32]. Ils ont également constaté que RAD001 diminution de la prolifération et de la production atténuée de HIF-1α ainsi que le VEGF dans les cellules de cancer gastrique in vitro [33]. Dans l'étude actuelle, nos données montrent que RAD001 thérapie atténué la phosphorylation de p70S6K et nettement inhibé la prolifération des cellules cancéreuses gastriques par arrêt du cycle cellulaire et de l'apoptose in vitro. Nous avons trouvé RAD001 induit la phase arrestation G0 /G1, qui a été associée à une diminution de la cycline D1 et C-myc. Par ailleurs, nous avons montré pour la première fois que RAD001 comme un nouvel inhibiteur mTOR l'apoptose dépendante de la dose induite dans les cellules de cancer de l'estomac par des essais Annexine V. Cet effet peut être dictée par le contexte cellulaire et les cibles en aval, y compris p53 et Bcl-2. Ces résultats pourraient expliquer davantage l'efficacité de RAD001.
Conclusion
En résumé, nous avons effectué des recherches systématiques de mTOR dans le cancer gastrique, ce qui indique les relations avec l'expression de la valeur de pronostic de mTOR activé (p-mTOR) in vivo, l'effet de RAD001 et la partie du mécanisme dans les cellules de cancer gastrique in vitro. Nos résultats indiquent que le p-mTOR servirait de marqueur biologique potentiel d'identifier un sous-groupe de patients atteints de cancer gastrique de mauvais pronostic. Elle a également montré que RAD001 est un agent prometteur pour le traitement du cancer de l'estomac avec l'induction de l'apoptose et un arrêt du cycle cellulaire par l'expression de la régulation négative de c-myc, CyclinD1 et Bcl-2, régulant à la hausse l'expression de la P53. D'autres études sont nécessaires pour élucider le rôle de l'activation de mTOR et, éventuellement, de proposer mTOR comme un objectif concret pour le traitement du cancer gastrique
Remarque
Grant Support:. Soutenu par la recherche nationale de haute technologie et le développement (863) Programme de Chine de notes
Da-zhi Xu, Qi-rong Geng ont contribué également à ce travail
Déclarations Remerciements.
ce travail a été soutenu par (863) Programme de recherche et de développement de haute technologie nationale Chine. Les auteurs apprécient l'excellente assistance technique Li-hui Wang, Fei-meng Zheng, Zheng-zhi Zou, Yan Zhang Zi-jie longue.
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Les auteurs déclarent qu'ils avoir aucun conflit d'intérêts.

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