Aktivované cicavčie cieľ rapamycínu je potenciálnym terapeutickým cieľom v karcinómu žalúdka

Aktivované cicavčie cieľ rapamycínu je potenciálnym terapeutickým cieľom v karcinómu žalúdka
Abstract
pozadí
cicavčie cieľ rapamycínu (mTOR) hrá kľúčovú úlohu v bunkovom raste a homeostázy. Cieľom našej štúdie je zistiť expresiu aktivovaného mTOR (p-mTOR) u pacientov s karcinómom žalúdka, ich prognostický význam a inhibičný účinok RAD001 na rast nádoru a určiť, či cielené inhibícia mTOR by mohla byť potenciálny terapeutická stratégia rakoviny žalúdka.
Metódy
bol zistený expresie p-mTOR s exemplármi 181 karcinómov žalúdka, ktorí podstúpili radikálnu resekcia (R0) imunohistochemicky. Korelácia p-mTOR prejavu patologickým funkcií a prežitie karcinómu žalúdka bol študovaný. Zistili sme tiež inhibičný účinok na rast nádoru RAD001 pomocou BGC823 a AGS rakovina žalúdka u bunkových línií.
Výsledky
imunologické značenie na prítomnosť p-mTOR bol pozitívny vo 93 181 (51,4%), karcinómov žalúdka, v úzkej korelácii s lymfy stav uzla a pTNM fázy. Pacienti s p-mTOR pozitívne preukázala výrazne kratšie prežívanie bez známok ochorenia (DFS) a celkové prežívanie sadzby (OS) ako tí s p-mTOR-negatívnymi nádormi v univariable analýz, a tam bol trend smerom k koreláciu medzi p-mTOR prejavu a prežitie v premenných analýz. RAD001 výrazne inhiboval v závislosti na dávke proliferáciu ľudských buniek karcinómu žalúdka tým, down-reguláciu expresie p70S6K, p-p70S6K, C-myc, CyclinD1 a Bcl-2, up-reguláciu expresie p53.
Závery
v žalúdočnej rakovina, p-mTOR je potenciálnym terapeutickým cieľom a RAD001 bol sľubným prísada pre spracovanie kovu s indukciu zastavenia bunkového cyklu a apoptózu down-reguláciu expresie c-myc, CyclinD1 a Bcl-2, up-reguláciu expresie p53.
pozadia
karcinómu žalúdka je štvrtou najčastejšou rakovinou a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na nádorové ochorenie na celom svete, vrátane 1 milióna nových prípadov ročne po celom svete [1]. Približne 60% nových prípadov rakoviny žalúdka sa vyskytujú vo východnej Ázii [2], a to najmä v Číne. Chirurgická resekcia je najúčinnejšia liečba rakoviny žalúdka a účinnosť chemoterapie zostáva obmedzené [3]. Mnohé štúdie ukázali, že hĺbka invázie a počet metastatických lymfatických uzlín sú najdôležitejšie silné prediktory prežitia u pacientov s rakovinou žalúdka [4, 5]. Napríklad, v predchádzajúcich štúdiách [6, 7], bolo zistené, pomer pozitívnych lymfatických uzlín je nezávislým prognostickým indikátorom po resekcii D2 a intraperitoneálna chemoterapiu môže byť prospešné u pacientov s rakovinou žalúdka. Avšak základným krokom k zlepšeniu klinického výsledku spočíva v lepšiemu pochopeniu nádoru biologické správanie, ktoré môžu pomôcť identifikovať možné ciele pre individuálne terapie [8, 9].
V posledných rokoch, molekulárno založené prístupy na liečenie v rakovina žalúdka bola venovaná veľké obavy. Niekoľko článkov popísali niektoré potenciálne molekulárne ciele pre terapiu karcinómu žalúdka, ako je receptor epidermálneho rastového faktora (EGFR) [10-13], vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF), [14], recepteur d'origine Nantais (RON) [15 ].
cicavčie cieľ rapamycín (mTOR) je nový potenciálny molekulárnej cieľ pre protinádorovú liečbu. Jeho expresia bola preukázaná v rôznych nádorových bunkových línií a vzorkách, akými sú pečeňové nádory [16], rakoviny prsníka [17], adenokarcinómu žlčových ciest [18], a cervikálneho karcinómu, [19, 20]. Tieto štúdie ukázali, že mTOR expresia bola spojená so zlou klinickou prognózou. Lang et al [21]. takisto pozorovali aktiváciu mTOR do ľudského karcinómu žalúdka in vitro a in vivo. Uviedli mTOR je často aktivovaný v ľudskej rakovine žalúdka. V poslednej dobe, perorálne biologicky dostupný derivát rapamycínu, RAD001 (everolimus; Novartis Pharma AG), bol vyvinutý. Skúšobná fáza III ukázal, liečba everolimom predlžuje prežívanie bez progresie u pacientov s metastatickým karcinómom obličiek, že došlo k progresii na iné cielenej liečby [22]. RAD001 bolo tiež preukázané, že inhibuje proliferáciu rastu nádorových buniek v niektorých karcinómov [23, 24]. Ale role RAD001 v žalúdočnej rakoviny bunke, nie je jasné.
Ciele tejto štúdie boli ďalej analyzovať vzťahov na mTOR výraz s hodnotou prognózy aktivovaného mTOR (p-mTOR), vplyv na rast RAD001 pre bunkový cyklus ľudských buniek karcinómu žalúdka in vitro a určiť, či rakovina žalúdka je dobrým kandidátom pre cieľovú terapiu s inhibítormi mTOR.
Metódy
sledovaných pacientov
Táto retrospektívnej štúdie sa skladala zo 181 pacientov, ktorí podstúpili radikálnu resekcii ( R0) pre histologicky potvrdený karcinóm žalúdka z Cancer Center Sun Yat-sen University v období od januára 1997 do decembra 2002. Všetci pacienti s histologicky potvrdený adenokarcinóm žalúdka prekonal buď blízky čiastočnú gastrektómii, distálnej čiastočnú gastrektómii alebo totálnej gastrektómii. Etický súhlas bol získaný od Sun Yat-sen University Cancer Center výskumu etickou komisiou.
Tí s dostatočnou histologického materiálu a úplných klinických údajov, ktoré boli oprávnené na začlenenie. Kritériá oprávnenosti tiež zahrnuté histologicky potvrdené R0 resekciu, ktorá bola definovaná ako žiadne makroskopické a mikroskopické reziduálneho tumoru a pooperačné doba prežitia ≥ 6 mesiacov. Pacienti so vzdialenými metastázami a karcinómom žalúdka pahýľa po resekcii benígne ochorenie boli zo štúdie vylúčení. Dôvodom je, že prežitie pacientov s vzdialených metastáz je často ovplyvnená mnohými ďalšími faktormi, ako je predoperačná chemoterapia alebo obštrukcia
Všetci pacienti mali nadväzujúci po operácii na 6 až 12 mesačných intervaloch .; konečný dátum sledovanie bola decembra 2008. Medián doba sledovania bola 50 (priemer: 50,66; rozsah 10-128) mesiacov pre všetkých pacientov, a 74 mesiacov (priemer: 72,80, rozpätie 27 - 128) pre prežitie. Medián dĺžky sledovania bolo 40 (priemer: 43,71; rozsah 11-125) u pacientov, ktorí mali nádory p-mTOR pozitívne výraz a 60.5 mesiacov (na mysli: 58,01, rozpätie 10 - 128) pre negatívne vyjadrenie. Prežívanie bolo počítané od dátumu stanovenia diagnózy do dátumu úmrtia alebo poslednej kontroly.
Odber a imunologické pre p-mTOR
všetkých nádorových vzoriek boli získané z chirurgicky po resekcii žalúdka rakoviny pred adjuvantnej terapie. Formalínom fixované, parafínové bloky boli skladované pri izbovej teplote označený identifikačným číslom. Päť-um hrubé rezy boli narezané z parafínových blokov, zbavené parafínu v xylénu, a rehydratovaný. Antigénne vyhľadávania bola spracovaná s citrátom sodným. Sklíčka potom boli inkubované v 0,3% H 2O 2 po dobu 10 minút a blokované v 1% hovädzieho sérového albumínu po dobu 60 minút a následne králičie monoklonálne protilátky špecifické pre p-mTOR (fosfo-mTOR, Ser2448, 49F9, Cell Signaling Technology) pri 4 ° C cez noc, a potom farbené 3,3-Diaminobenzidine. Po vizualizáciu imunoreaktivity, rezy boli kontrastne hematoxylínom a potom namontovať.
Vyhodnotenie Imunohistochemické farbenie
imunologicky Rezy boli vyhodnotené a tkaniva z ľudského adenokarcinómu prostaty slúžil ako pozitívna kontrola. Podľa nedávno popísaných kritérií pre hodnotenie expresie mTOR, farbenie intenzita bola stanovená ako 0 (neprítomný), 1 (slabý), a 2 (silný) a expresných hladín biomarkerov boli semiquantified imunohistochemickým skóre (od 0 do 200) vypočítané vynásobením intenzity farbenie s percentom pozitívnych nádorových buniek [18]. Pacienti s imunohistochemické skóre 20 alebo boli považované za p-mTOR-negatívne a tie, ktoré sa skóre > 20 ako p-mTOR-pozitívne. Všetky snímky boli hodnotené nezávisle na sebe dvoma nezávislými patológov bez znalosti klinických informácií pacientov. Keď sa názory oboch hodnotiteľov boli odlišné, sa dosiahla dohoda o dôkladnom rozhovore
Bunkové línie a kultivačné podmienky
rakovina žalúdka u ľudí bunkových línií BGC823 a AGS (ATCC číslo: CRL-1739)., Ktoré sú zle diferencované boli darčeky z Peking University School of Oncology (Peking, Čína PR.) [25]. Bunkové línie boli udržiavané v médiu RPMI 1640 (Invitrogen) doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom (Hyclone), penicilínom (100 jednotiek /ml) a streptomycínom (100 jednotiek /ml) pri 37 ° C a 5% CO2 vo vlhkom inkubátore .
životaschopnosť buniek test
Pre analýzu účinku RAD001 na ľudských buniek karcinómu žalúdka, životaschopnosť buniek sa stanovila testom MTT. RAD001 bola poskytnutá Novartis Pharma (Bazilej, Švajčiarsko). Pre test životaschopnosti, logaritmicky rastúce bunky boli stimulované s rôznymi dávkami RAD001 (0, 5, 10, 20 a 40 uM). Na konci kultivačného obdobia, 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromidu (MTT) roztoku (Sigma, USA) pri 0,2 mg /bolo pridané 20 ul tetrazoliového farbivá ml v PBS , optická hustota pri 490 nm (OD490) bola stanovená pomocou enzyme-linked ImmunoSorbent assay (ELISA) čitateľa. Priemerné hodnoty boli vypočítané z trojmo kultúr. Analýza bunkového cyklu
Bunky boli zhromaždené a fixované v 70% etanolu sa cez noc pri 4 ° C. Bunky boli potom premyté a farbené propidiumjodidom (PI) (Sigma), 5 ug /ml. Po 30 minútach pri teplote miestnosti chránenej pred svetlom, bunky boli analyzované pomocou prietokovej cytometrie s použitím Becton Dickinson FACScan.
Annexin V teste
Vzorky boli premyté fyziologickým roztokom pufrovaným fosfáty (PBS), a za použitia annexinu V-fluoresceín izotiokyanát (FITC) a PI farbenie pre určenie expozície fosfatidylserínu na vonkajšiu plazmatické membrány. Po inkubácii počas 30 minút pri teplote miestnosti, chránené pred svetlom, vzorky boli kvantifikované prietokovou cytometriou za použitia Becton Dickinson FACScan.
Reverzný transkripcie-PCR s
Celková RNA bola extrahovaná metódy TRIzolu. RNA bola reverzne transcripted s použitím komerčne dostupného kitu (Fermentas, USA). Táto zmes (25 ul celkovo) pre PCR sa skladala z 0,5 ul cDNA, 0,5 U Taq DNA polymerázy, 2,5 ul 10 x PCR pufra, 2,5 mM dNTP zmesi, a 50 pM sense a antisencie primérov každý. CyclinD1 a C-myc boli analyzované nasledujúcimi primery: CyclinD1 5'GAACAGAAGTGCGAGGAGGAG3 'a reverzné primer 5'AGGCGGTAGTAGGACAGGAAG3'; C-myc, 5 'CGAGCTGCTGGGAGGAGACAT3' a 5 'AGCCGCCCACTTTTGACA GG3' aktínu :. 5'GGCACCCAGCACAATGAA 3 'a 5' TAGAAGCATTTGCGGTGG 3 '
bunkového lyzátu a Western blot analýza
Bunky boli lyžovanie v lyzačním pufri a koncentrácia proteín bol stanovený metódou Bradford farbivá (Bio-Rad Laboratories). Rovnaké množstvo bunkového extraktu boli podrobené SDS-PAGE a prenesené na PVDF membránu (Bio-Rad). Western blot analýzy boli vykonané s rôznymi špecifickými primárnymi protilátkami. Protilátky rozpoznávajúci fosfo-p70S6K (Thr389), p70S6K, fosfo-mTOR (Ser2448), BCL-2 a p53 boli z bunkovej signalizácie.
Štatistických analýz
Primárnym cieľom našej štúdie bolo celkové prežívanie (OS). Bola definovaná ako doba medzi čase operácie a smrti. Prežívanie bez príznakov ochorenia (DFS) bol čas medzi okamihom chirurgického zákroku a recidívy alebo úmrtí súvisiacich s nádorom. Analyzovalo ako sekundárny koncový bod. Združenie p-mTOR expresie s rôznymi funkciami clinicalopathologic bola analyzovaná s použitím testu chí-kvadrát. Kumulatívne prežitie a prežitie bez ochorenia boli odhadnuté metódou Kaplan-Meier. Log-rank test bol použitý pre vyhodnotenie štatistickej významnosti rozdielov medzi krivkami prežitia. Cox proporcionálny model riziká (vzad, po krokoch) pre viac premenných analýzu bola použitá v závislosti na faktoroch, ktoré dosiahli význam v univariable analýze. Štatistická analýza bola vykonaná pomocou softwaru SPSS (verzia 13 pre Windows; SPSS, Chicago, IL). Rozdiely v P < 0,05 boli považované za štatisticky významné.
Výsledky
patologickým funkcie
celkovo 181 pacientov bolo zaradených do tejto štúdie. Stredný vek bol 59 rokov (rozmedzie 23-83 rokov). Že patologickým charakteristiky populácie štúdie sú zhrnuté v tabuľke 1. 129 pacientov boli muži a 52 žena. 77 z 181 nádorov (42,5), boli z horného brucha, 74 zo 181 pacientov (40,9%) bolo zo spodnej časti brucha, a zostávajúce nádory boli zo strednej a celého tela žalúdka. 118 zo 181 (65,2%) veľkosti nádoru pacienta boli > 4 cm a 63 (34,8%) boli nižšie ako 4 cm. V súlade s kritériami Svetovej zdravotníckej organizácie, z toho 4 181 nádorov (2,2%) boli dobre diferencovaný, 55 181 nádorov (30,4%) boli mierne diferencované, 116 bolo zle diferencovaný a 6 boli nediferencovanej. Pooperačné chirurgická fáza bola klasifikovaná podľa UICC 2002 /AJCC klasifikácie [26] .Table 1 patologickým korelácie p-mTOR expresie v karcinómu žalúdka
Factors
Všetci pacienti
No. pacientov (%)
P

N
= 181 (%)
mTOR negatívny
mTOR pozitívne

Age (y)
0,256 Hotel < 60
95 (52,5)
50 (56,8)
45 (48,4)
≥60
86 (47,5)
38 (43,2)
48 (51,6)
Sex
.926
Muž
129 (71,3)
63 (71,6)
66 (71,0)
Žena
52 (28,7)
25 (28,4)
27 (29,0)
stránok
0,053
Horní
77 (42,5)
33 (37,5)
44 (47,3)
Middle
28 ( 15.5)
10 (11,4)
18 (19,4)
nižšia
74 (40,9)
43 (48,9)
31 (33,3)
Difúzna
2 ( 1.1)
2 (2.3) NETHRY.cz 0 (0.0)
Tumor veľkosť
.172
≤ 4 cm
63 (34,8)
35 (40,0)
28 (30.1) Hotel > 4 cm
118 (65,2)
53 (60,0)
65 (69,9)
typ Borrmann
0,398
ranej štádium
7 (3,9)
6 ( 6.8)
1 (1.1)
Aj
4 (2.2)
2 (2.3)
2 (2.1)
II
65 (35,9)
31 ( 35.2)
34 (36,6)
III
101 (55,8)
47 (53,4)
54 (58,1)
IV
4 (2.2)
2. ( 2.3)
2 (2.1)
triedenie
0,999
1
4 (2,2)
2 (2.3)
2 (2.1)
2
55 (30,4)
27 (30,7)
28 (30,1) Sims 3
116 (64,1)
56 (63,6)
60 (64,5)
4
6 (3,3) Sims 3 (3,4) Sims 3 (3,3)
patologických T klasifikácii
0,168
T1
17 (9,4)
12 (13,6)
5 (5,4)
T2
35 (19,3)
18 (20,5)
17 (18,3)
T3
119 (65,7)
55 (62,5)
stav 64 (68,8)
10 (5,5) Sims 3 (3,4)
7 (7,5) T4
patologické N
0,008
N negatívne
44 ( 24.3)
29 (33,0)
15 (16,1)
N pozitívny
137 (75,7)
59 (67,0)
78 (83,9)
patologické stadium (pTNM)
0,026
Aj
26 (14,4)
17 (19,3)
9 (9.7)
II
47 (26,0)
28 (31,8)
19 (20,4)
III
100 (55,2)
41 (46,5)
59 (63,4)
IV
8 (4.4)
2 (2.3)
6 (6,5)
129 zo 181 pacientov (71,2%) malo pokročilejšie T štádiu ochorenia (PT3 + PT4) a 137 pacientov (75,7%) malo lymfatických uzlín. Celkom pacienti fázy I-IV boli 26, 47, 100 a 8 prípadov, v danom poradí.
P-mTOR expresie v karcinómu žalúdka
imunologické p-mTOR bola cytoplazmatická a čiastočne membranózna. Obrázok 1 ukazuje reprezentatívne príklady p-mTOR immunostaining. Normálny žalúdočnej sliznice je negatívny na prítomnosť p-mTOR. 181 pacientov, 93 (51,4%) boli p-mTOR-pozitívne nádory. Obrázok 1 Príklady p-mTOR immunostaining. (A) Normálna žalúdočnej sliznice je negatívny na prítomnosť p-mTOR (pôvodné zväčšenie x 200). (B) Normálny žalúdočnej sliznice je negatívny na prítomnosť p-mTOR (pôvodné zväčšenie x 400), (C) Pozitívny expresie p-mTOR u karcinómu žalúdka (pôvodné zväčšenie x 200). (D) negatívna expresie p-mTOR u karcinómu žalúdka (pôvodné zväčšenie x 200).
Analýza prežitie
pacientov s p-mTOR pozitívnym karcinómom žalúdka ukázal podstatne kratšiu dobu bez príznakov ochorenia a celkové prežívanie ako pacienti s p- mTOR negatívne rakovina žalúdka (DFS, 48,9% vs 30,1%; p = 0,006, OS, 51,1% vs 34,4%; p = 0,011, tabuľka 2, obrázok 2A, B). Univariable analýza ukázala, že doba prežitia sa znížil aj s vyšším pT klasifikácii (DFS, p = 0,001; OS, P = 0,005), lymfatických uzlín (DFS, p < 0,0001, OS, P = 0,001) a pokročilé pTNM etapa (DFS, p < 0,001; OS, P = 0,001). Nebol zistený žiadny vzťah medzi DFS a OS a vek, pohlavie alebo nádor size.Table 2 Univariable analýza bez príznakov ochorenia a celkové prežívanie pri rakovine žalúdka


bez príznakov ochorenia suivival
Celkovo survival

Characteristic

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

Age(y)
0,343 0,583
Hotel < 60
95
1,00
1,00
≥60
86
0,834
0,573-1,214
0,898
0.611-1.320
Sex
. 662
.950
Male
129
1,00
1,00
Žena
52
0,909
0,591-1,396
0,986
0,639-1,521
veľkosť nádoru
0,151 0,232
≤4 cm
63
1,00
1,00 Hotel > 4 cm
118
1,345
0,897-2,016
1,287
0,851-1,945
pT fáze
0,001 0,005
PT1
17
1,00 1,00
pT2
35
1.549
0.558-4.301
.401
1.535
0.553-4.264
.411
pT3
119
3.546
1.437-8.750
.006
3.237
1.310-8.001
.011
pT4
10
4.738
1.547-14.506
.006
4.068
1.289-12.836
.017
pN etapa Hotel < 0,0001
0,001
Negatívne
44
1,00
1,00
Pozitívne
137
2,617
1,538-4,451
2,389
1.401- 4,075
pTNM etapa Hotel < 0,0001
0,001
Aj
26
1,00
1.00
II
47
2.920
1.197-7.121
.018
2.860
1.173-6.973
.021
III
100
4.955
2.152-11.409
< 0,0001
4,455
1,930-10,281 Hotel < 0,0001
IV
8
7,369
2,470-21,981 Hotel < 0,0001
6,103
1,965-18,957
0,002
P-mTOR
0,008 0,013
Negatívne
88
1.00
1,00
pozitívny
93
1,667
1,146-2,454
1,644
1,112-2,430
obrázku 2 Kaplan-Meierovej odhady pravdepodobnosti prežitia. Pacienti s p-mTOR pozitívne ukázali výrazne kratší celkové prežívanie (A) a prežívanie bez ochorenia (B) sadzby ako tie, ktoré sa p-mTOR negatívneho vyjadrenia. (P = 0,011 a p = 0,006, príslušne)
V multivariable analýze lymfatických uzlín (DFS, p = 0,018; OS, P = 0,038). A pT etapa (DFS, p = 0,018; OS, P = 0,046) boli významné nezávislý prognostický faktor pre dobu prežitie. Okrem toho, multivariabilní analýza (tabuľka 3) tiež uvedené trend na koreláciu medzi expresiou p-mTOR a zníženie prežitia, ale tento trend nedosiahol štatistickej významnosti (DFS, p = .059; OS, p = .070) .Table 3 Multivariable Cox regresná analýza bez príznakov ochorenia a celkové prežili


prosté choroby suivival
Celkovo survival

Factors

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

p-mTOR
0,059 0,070
Negatívne
88
1,00
1,00
Pozitívne
93
1,452
0,986-2,138
1,443
0,970-2,147
Infiltrovať hĺbky
0,018 0,046
PT1
17
1,00
1,00
pT2
35
1.050
0.366-3.016
0.928
1.078
0.375-3.101
0.889
pT3
119
2.251
0.867-5.845
0.096
2.146
0.823-5.595
0.118
pT4
10
2.926
0.920-9.305
0.069
2.616
2.616-8.580
0.113
Lymph Stav uzol
0,018 0,038
Negatívne
44
1,00
1,00
Pozitívne
137
1,981
1,981-3,488
1,828
1,034 - 3,233
RAD001 inhibuje proliferáciu a zabraňuje p70S6K fosforylácie
Ak chcete skúmať účinky RAD001 na šírenie rakovina žalúdka u ľudí bunkových líniách BGC823 a AGS, sme vykonali testy proliferácie s 48-hodinovej expozícii RAD001. V dôsledku toho, RAD001 vytvára významnú inhibíciu na oboch bunkových línií v spôsobom závislým od dávky. (Obrázok 3A). Obrázok 3 (A) RAD001 inhibuje proliferáciu buniek karcinómu žalúdka. Žalúdočné rakovinové bunky boli ošetrené uvedenými koncentráciami RAD001 v prítomnosti 10% FBS po dobu 48 hodín. Životaschopnosť buniek bola hodnotená testom MTT. (B) Fosforilácia p70S6K bola významne znížená spôsobom závislým od dávky v oboch AGS a BGC823 buniek ošetrením RAD001. Obe bunkové línie boli inkubované so zvyšujúcou sa dávkou RAD001 po dobu 48 hodín, fragmenty buniek boli podrobené analýze western blot s protilátkami fosforylovaných p-S6K a S6K.
Western blot pokusy boli vykonané s RAD001 v 0, 5, 10, 20 uM po dobu 48 hodín. P70S6K kináza je dôležitým downstream cieľ mTOR a jej mTOR-dependentný fosforylácie umožňuje transláciu ribozomálnych proteínov. Skúmali sme stav fosforylácie cieľového prúdu p70S6K imuno-blottingom. Ako je znázornené na obrázku 3B, sme zistili, že ošetrenie oboch bunkových línií BGC823 a AGS s RAD001 významne zabrániť fosforylácii p70S6K v spôsobom závislým od dávky.
RAD001 indukuje zástavu a apoptózu G0 /G1 bunkového cyklu v rakovinových bunkách žalúdku
Ak chcete zistiť, či potlačenie v bunkovej proliferácii boli spôsobené G0 /G1 fáze zatknutia alebo apoptózy, distribúcia bunkového cyklu bol analyzovaný FCM. Obrázok 4 ukazuje, že liečba BGC823 buniek s RAD001 po dobu 48 hodín za následok robustný G1 zástave a podporovať apoptózu. So zvyšujúcou sa dávkou RAD001, stále viac a viac buniek zostali v G1 fáze, pri progresii bunkového cyklu do S fázy klesá (obrázok 4A). RT-PCR analýza odhalila, RAD001 v závislosti od dávky sa znížila úroveň mRNA cyklin D1 a c-myc (Obrázok 4B). Obrázok 4 RAD001 indukuje zástavu bunkového cyklu a apoptózu v bunkách BGC823. (A) BGC823 bunky boli vystavené rôznym koncentráciám RAD001 po dobu 48 hodín. (B) RNA boli extrahované z buniek. Cyklin D1 a C-myc hladina expresie bola detekovaná pomocou RT-PCR, aktínu ako kontrola nanášania. (C) boli bunky inkubované po dobu 48 hodín pri uvedených dávkach na RAD001 pred farbením pomocou annexin V-FITC. Zobrazí sa percento apoptotických buniek. (D) Bunky boli inkubované po dobu 48 hodín pri uvedených dávkach na RAD001. Bunky boli zhromaždené, lyžovanie a vystavené analýze westernovým prenosom s Bcl-2 a p53 protilátky. GAPDH bola použitá ako kontrola nanášania.
Annexin-V testy ukázali, že RAD001 významne indukovanú apoptózu v bunkách BGC823. Zvýšenie rýchlosti apoptózy sa analyzovala FCM so zvýšením dávky (obrázok 4C). Western blot analýza ukázala, RAD001 v závislosti na dávke znižujú hladiny proteínu Bcl-2 a zvýšenie hladiny proteínu p53 (obr 4D). Podobné výsledky boli pozorované v AGS bunkách (dáta nie sú ukázaná).
Diskusia
cicavčie cieľ rapamycínu (mTOR), bol objavený v roku 1990 so začiatkom pri štúdiu mechanizmu pôsobenia rapamycínu, ktorý bol pôvodne nájdený ako antimykotikum, neskôr bol uznaný ako protirakovinových vlastností [27]. Ako proteínové kinázy Ser /Thr, mTOR hrá kľúčovú úlohu v bunkovom raste a homeostázy [28]. MTOR proteín tvorí komplex s adaptérom bielkovín, mTORC1 (cicavčie cieľ rapamycínu komplexu 1) a mTORC2. Aktivácia mTORC1 reguluje rast buniek moduláciou syntézu bielkovín, ribozomálnu biogenezi a autofagie [29]. MTORC2 systém hrá kľúčovú úlohu aktivácia Akt, ako PDK1 (3-fosfoinositid závislé na proteín kináza 1) a PI3K, potenciálnych cieľov drogy pre nádory, v ktorom existuje Akt deregulácie [26].
V súčasnej štúdii, sme pozorovali, že 93 (51,4%) pacientov malo pozitívny expresiu p-mTOR vo 181 pacientov s karcinómom žalúdka. V súlade s naším Výsledkom je, že v inej štúdii zahŕňajúcej 1072 pacientov, ktorých expresia p-mTOR je 46,5% [30].
Predchádzajúce štúdie preukázali prognostický význam p-mTOR expresie. Herberger et al [18]. identifikovať p-mTOR za nezávislý prognostický faktor pre úmrtia u pacientov s adenokarcinóm žlčových ciest. Vo svojej štúdii, celkové prežívanie bol významne kratší u pacientov s p-mTOR-pozitívnych nádorov v porovnaní s pacientmi s p-mTOR-negatívne nádory (p = 0,004). V prípade rakoviny žalúdka, Yu et al. hodnotená expresia p-mTOR v 1,072 pacientov s karcinómom žalúdka pomocou mikroskopické sústavy tkanív, čo ukazuje, že nadmerná expresia p-mTOR bol nezávislý prognostický faktor [30]. Avšak, v štúdii zahŕňali 109 pacientov s žalúdočnými adenokarcinómy, ktorí podstúpili radikálnu gastrektómii [31], Murayama et al. nájdených ani cytoplazmatická p-mTOR, ani nukleárnej p-mTOR bol nezávislý prognostický faktor, aj keď možno identifikovať cytoplazmatická expresie p-mTOR bola spojená s horším prežitím a koreluje s hĺbkou invázie nádoru, lymfatických uzlín a štádiom nádoru. V tejto štúdii sme potvrdili, že pT klasifikácie a stav lymfatických uzlín sú nezávislé prognostickým indikátorom klinický výsledok u pacientov s rakovinou žalúdka o viac premenných analýz. Avšak, pretože u väčšiny pacientov prichádza s lokálne pokročilým ochorením, ďalšie sekundárne prognostických markerov, najmä p-mTOR, môže byť použitie [13]. Naše výsledky jasne ukazujú, že p-mTOR expresie je silne koreluje s celkovým zlým a prežitie bez choroby v univariable analýz s trendom korelácia vo viacerých premenných analýzach.
V súlade s našou súčasnej štúdiu, niekoľko štúdií tiež uznali antiproliferatívne účinky inhibítory mTOR v rakovinových bunkách žalúdka. Napríklad, Lang et al [21]. identifikované rapamycín môžu inhibovať rast rakovinových buniek žalúdočnej ako v subkutánnom nádorovom modeli a v experimentálnom modeli. Ich výsledky zdôrazňujú vhodnosť inhibítorov mTOR, ktorý bude použitý v súvislosti s antiangiogenetické pre liečbu karcinómu žalúdka.
Však RAD001 je nový inhibítor mTOR ako protinádorové činidlo. Mechanizmus o RAD001 v karcinómu žalúdka, nie je jasné. Čejka a kol. bolo zistené, že antiangiogenetické aktivita RAD001 v kombinácii s vysokou dávkou cyklofosfamidu ukázal, synergickú protinádorovú aktivitu proti rakovine žalúdka [32]. Majú tiež zistili, že RAD001 znížili proliferáciu a produkciu atenuovaného HIF-1α, rovnako ako VEGF v nádorových bunkách žalúdku in vitro [33]. V tejto štúdii, naše dáta ukazujú, že RAD001 terapiu oslabenej fosforylácii p70S6K a výrazne inhibuje proliferáciu buniek karcinómu žalúdka prostredníctvom zástave bunkového cyklu a apoptózy in vitro. Zistili sme, RAD001 indukované G0 /G1 fáze zástava, ktorá bola spojená so znížením cyklin D1 a c-myc. Navyše sme ukázali prvýkrát, že RAD001 ako nový inhibítor mTOR v závislosti na dávke indukovanú apoptózu v nádorových bunkách žalúdočnej annexinu V testoch. Tento účinok môže byť daná tým, bunkovej kontextu a nadväzujúcich cieľov vrátane p53 a Bcl-2. Tieto poznatky by mohli ďalej vysvetľovať účinnosť RAD001.
Záver
Stručne povedané, sme vykonali systematickú výskum mTOR u karcinómu žalúdka, čo naznačuje Vzťahy výraz s hodnotou prognózy aktivovaného mTOR (p-mTOR) in vivo, účinok RAD001 a časť mechanizmov buniek karcinómu žalúdka in vitro. Naše výsledky ukázali, že p-mTOR, budú slúžiť ako potenciálny biologickú markeru pre identifikáciu podskupinu pacientov s rakovinou žalúdka so zlou prognózou. Sa tiež ukázalo, že RAD001 bol sľubný prostriedok pre liečbu karcinómu žalúdka s indukciu zastavenia bunkového cyklu a apoptózu down-reguláciu expresie c-myc, CyclinD1 a Bcl-2, up-reguláciu expresie p53. Ďalšie štúdie sú potrebné na objasnenie úlohy aktivácia mTOR a nakoniec navrhnúť mTOR ako konkrétny cieľ pre terapiu rakoviny žalúdka
Poznámka
grantovej podpory :. Podporovaná Národným High Technology výskum a vývoj (863) Program čínska
Notes
Da-Zhi Xu, Qi-Rong geng prispeli rovnakou mierou k tejto práci.
deklarácia
Poďakovanie
Táto práca bola podporená National High technologický výskum a vývoj (863) program China. Autori ocenia výbornú technickú pomoc Li-hui Wang, Fei-meng Zheng, Zheng Zhi-Zou, Yan Zhang a Zi-Jie Long.
Autori "pôvodné predložené súbory pre obrazy
Nižšie sú uvedené odkazy na adresára pôvodné autorov predložený súbory obrazov. "Pôvodný súbor pre Obrázok 1 12885_2009_2335_MOESM2_ESM.pdf autorského 12885_2009_2335_MOESM1_ESM.pdf autorov pôvodného súboru na obrázku 2 12885_2009_2335_MOESM3_ESM.pdf autorského pôvodného súboru pre obrázok 3 12885_2009_2335_MOESM4_ESM.pdf autorov pôvodný súbor obrázku 4 Konflikt záujmov
autori vyhlasujú, že nemajú žiadne protichodné záujmy.

• Prognostický Vplyv etnického pôvodu na žalúdočné a rakoviny pažeráka: skúsenosť populačnej v Britskej Kolumbii, Canada
• Identifikácia prognostických faktorov a chirurgických označenie pre metastatické žalúdočné cancer