Aktyvuotas žinduolių rapamicino taikinio yra potencialus terapinis taikinys skrandžio vėžio

Aktyvuotas žinduolių rapamicino taikinio yra potencialus terapinis taikinys skrandžio vėžio
Anotacija
faktai
žinduolių rapamicino taikinio (mTOR) vaidina svarbų vaidmenį ląstelių augimo ir homeostazę. Mūsų Šio tyrimo tikslas yra ištirti aktyvuota mTOR (P-mTOR) išraišką skrandžio vėžiu sergančių pacientų, jų prognostinę reikšmę ir inhibavimo poveikį RAD001 naviko augimą ir nustatyti, ar tikslingai slopinimas mTOR gali būti potencialus terapinis strategija skrandžio vėžio.
metodai
p-mTOR išraiška buvo aptiktas egzempliorių 181 skrandžio vėžio, kuriems buvo atlikta radikali rezekcija (R0) imunohistocheminiu. P-mTOR išraišką clinicopathologic funkcijų ir išlikimo skrandžio vėžio ryšys buvo tiriamas. Taip pat nustatėme, inhibavimo poveikį RAD001 naviko augimą naudojant BGC823 ir AGS žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas.
Rezultatai
imunodažymu p-mTOR buvo teigiamas 93 181 (51,4%) skrandžio vėžys, glaudžiai koreliuoja su limfos mazgas statusą ir pTNM etapas. Pacientai, kurių p-mTOR teigiamas parodė žymiai trumpesnis ligos reiškinių išgyventas (DFS) ir bendrasis išgyvenamumas (BI) normas nei tie, su p mTOR neigiami navikų univariacinį analizių, ir ten buvo tendencija koreliacijos tarp p mTOR saviraiškos ir išgyvenimo kintamųjų analizės. RAD001 žymiai slopinamas priklausomai nuo dozės plėtimas žmogaus skrandžio karcinoma ląstelių žemyn reguliavimo išraiška p70s6k, p-p70s6k C-MYC, CyclinD1 ir BCL-2, iki reguliavimo išraišką P53.
Išvadose
skrandžio vėžys, p mTOR yra potencialus terapinis taikinys ir RAD001 buvo perspektyvi apdorojimo medžiaga su skatinančius ląstelių ciklo suėmimą ir apoptozę DOWN reguliavimo išraišką C-myc, CyclinD1 ir BCL-2, iki reguliavimo išraišką P53.
fone
Skrandžio vėžys yra ketvirtoji dažniausia vėžio ir antroji pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirčių visame pasaulyje, įskaitant 1 mln naujų atvejų per metus visoje [1] visame pasaulyje. Apie 60% naujų atvejų skrandžio vėžio pasitaiko Rytų Azijoje [2], ypač Kinijoje. Chirurginės rezekcija yra efektyviausias gydymas skrandžio vėžio ir chemoterapijos veiksmingumas išlieka ribotas. [3] Daugelis tyrimų parodė, kad invazijos gylis ir metastazių limfmazgiuose skaičius yra svarbiausi galingi faktoriai, išlikimo skrandžio vėžiu sergančių pacientų [4, 5]. Pavyzdžiui, ankstesniuose tyrimuose [6, 7], mes nustatėme, teigiamas limfinių mazgų santykis yra nepriklausoma prognostinė rodiklis po D2 rezekcija ir į pilvo ertmę chemoterapija gali būti naudinga skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. Tačiau esminis žingsnis gerinant klinikinei baigčiai slypi didinti supratimą apie naviko biologinio elgesio, kuris gali padėti nustatyti galimus tikslus individuali terapija [8, 9].
Pastaraisiais metais molekules grindžiamus metodus gydytis skrandžio vėžio buvo suteikta didelį susirūpinimą. Keli straipsniai apibūdino keletą potencialių molekulinius taikinius už gydymą, skrandžio vėžio, pavyzdžiui, epidermio augimo faktoriaus receptoriaus (EGFR) [10-13], kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) [14], recepteur d'origine NANTAIS (RON) [15 ].
žinduolių rapamicino taikinio (mTOR) yra naujas potencialus molekulinės taikiniu terapija vėžio. Jo išraiška buvo įrodytas įvairių ląstelių linijų ir naviko egzempliorių, pavyzdžiui, kepenų navikų [16], krūties vėžio [17], tulžies takų adenokarcinoma [18] ir gimdos kaklelio vėžio [19, 20]. Šie tyrimai parodė, kad mTOR išraiška buvo susijęs su prasta klinikinės prognozė. Lang et al [21]. taip pat pastebėta mTOR aktyvaciją žmogaus skrandžio vėžio in vitro ir in vivo. Jie nurodė, mTOR dažnai įsijungia žmogaus skrandžio vėžio. Neseniai per burną biologiškai darinys rapamicino, RAD001 (everolimuzo; Novartis Pharma AG), buvo sukurta. III fazės tyrimo metu paaiškėjo, gydymas everolimuzą prailgina išgyvenimą be progresavimo pacientams, sergantiems metastazavusiu inkstų ląstelių karcinoma, kad progresavo nuo kitų tikslinių gydymo [22]. RAD001 taip pat buvo įrodyta, kad slopina auglio ląstelių augimą proliferaciją in kai karcinomų [23, 24]. Bet RAD001 vaidmuo skrandžio vėžio ląstelės nėra aišku.
Šio tyrimo tikslas buvo toliau analizuoti santykius su mTOR išraišką su prognozė vertės aktyvintos mTOR (p-mTOR), iš RAD001 poveikį augimui ir ląstelių ciklo žmogaus skrandžio vėžio ląsteles in vitro ir nustatyti, ar skrandžio vėžys yra geras kandidatas tikslinės terapijos su mTOR inhibitoriais.
metodai
tirtų pacientų
Ši retrospektyvinė studija sudarė 181 pacientų, kuriems buvo atlikta radikali rezekcija ( R0) už histologiškai patvirtinta skrandžio karcinoma nuo vėžio centro Sun Yat-sen universiteto nuo 1997 sausio ir 2002 metų gruodžio Visi pacientai, sergantys histologiškai patvirtinta adenokarcinoma skrandžio buvo atlikta arba proksimalinės dalinį pašalintas skrandis, distalinio dalinį pašalintas skrandis arba bendras pašalintas skrandis. Etikos patvirtinimas buvo gautas iš Sun Yat-sen Universiteto Cancer Center tyrimų etikos komitetas.
Tie tinkamą histologinio medžiagos ir visiškai klinikiniais duomenimis buvo gauti įtraukimo. Tinkamumo kriterijai taip pat įtraukiami histologiškai patvirtinta R0 rezekcijos, kuris buvo apibrėžiamas kaip be makroskopinių ir mikroskopinių likutinės naviko ir pooperacinio išgyvenamumo laiko ≥ 6 mėnesius. Pacientai, kurių tolimų metastazių ir karcinomos skrandžio kelmo po rezekcijos dėl gerybinės ligos buvo pašalintas iš tyrimo. Priežastis yra ta, kad pacientams, sergantiems tolimų metastazių išlikimo dažnai įtakos turi daug kitų veiksnių, kaip antai Priešoperacinės chemoterapija ar obstrukcija
Visi pacientai turėjo tolesnių po operacijos bent 6 iki 12 mėnesių intervalais.; galutinis terminas tolesnių buvo 2008 gruodis mediana iki laikotarpis buvo 50 (vidurkis: 50.66; diapazonas 10 iki 128) mėnesių visiems pacientams, ir 74 mėnesių (reiškia: 72.80; svyravo nuo 27 į 128) išlikimui. Trukmės mediana stebėjimo metus buvo 40 (vidurkis: 43.71; diapazonas 11 į 125) pacientų, kurie turėjo auglius p mTOR teigiamą išraiška, ir 60,5 mėnesiai (vidurkis: 58.01; nuo 10 iki 128) dėl neigiamo išraiška. Išgyvenimo buvo skaičiuojamas nuo diagnozės nustatymo datos iki mirties arba paskutinės tolesnių dienos.
MĖGINIŲ ĖMIMAS IR imunodažymu p-mTOR pervežimas Visi naviko egzempliorių buvo gauti iš chirurginiu rezekcijos skrandžio vėžio prieš pagalbinį gydymą. Formalinu fiksuoto, parafino-patalpinto audinio blokai buvo laikomi žymimas identifikacijos numeriu, kambario temperatūroje. Penki mkm storio audinio skyriai buvo sumažinti iš parafino blokus, deparaffinized į ksileno ir rehidrataciją. Antigeninė paieška buvo tvarkomi su natrio citrato. tada skaidres buvo inkubuojamos 0,3% H 2O 2 už 10 min, ir užblokuotas 1% albumino galvijų serumo 60 min, po to triušio monokloninio antikūno, specifinio p-mTOR (PHOSPHO-mTOR, Ser2448, 49F9; Mobilusis signalines technologijos), esant 4 ° C temperatūroje per naktį, ir vėliau yra nudažomi su 3,3-diaminobenzidinu. Po vizualizacija reaktyvumas, sekcijos buvo counterstained hematoksilinu ir tada montuojamas.
Vertinimas imunohistocheminį dažymo Viesbutis The immunostained dalys buvo įvertintos ir audiniai iš žmogaus prostatos adenokarcinomos tarnavo kaip teigiamą kontrolę. Pagal neseniai aprašytų kriterijų įvertinimas mTOR išraiškos, dėmių intensyvumas nustatomas kaip 0 (nebuvimo), 1 (silpnai), ir 2 (stiprus) ir saviraiškos lygių biologinių žymenų buvo semiquantified naudojant imunohistocheminis rezultatą (diapazonas, 0-200), kuris apskaičiuojamas dauginant raiškos intensyvumas su teigiamų vėžinių ląstelių [18] procentais. Pacientai, sergantys imunohistocheminis rezultatas ≤ 20 buvo laikomi p mTOR-neigiamas ir tiems, su >rezultatą; 20 p-mTOR-teigiamas. Visos skaidrės buvo nepriklausomai įvertinti dviejų nepriklausomų patologai be jokių pacientų klinikinės informacijos žinių. Kai abiejų vertintojų nuomonės skyrėsi, buvo pasiektas susitarimas kruopščiai diskusijų
Mobilaus ryšio linijų ir auginimo sąlygos
žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas BGC823 ir AGS (ATCC numeris: BEL-1739). Kurie prastai diferencijuotas buvo dovanos iš Pekino universiteto Onkologijos (Pekinas, Kinija.) [25]. Ląstelių linijų ir buvo išlaikytos RPMI 1640 terpė (Invitrogen), papildytoje su 10% vaisiaus galvijų serumo (Hyclone), penicilinui (100 vienetų /ml) ir streptomicino (100 vienetų /ml) 37 ° C temperatūroje ir 5% CO2 drėgmėje, inkubatoriuje .
ląstelių gyvybingumas tyrimas
išanalizuoti RAD001 poveikį žmogaus skrandžio vėžio ląstelių, ląstelių gyvybingumas nulėmė MTT. RAD001 buvo pateikta Novartis Pharma (Bazelis, Šveicarija). Už gyvybingumo tyrimą,, logaritmiškai auginimo ląstelės buvo stimuliuojama su įvairių dozių RAD001 (0, 5, 10, 20 ir 40 mikronų). Kultūros laikotarpio pabaigos, 3- (4,5-dimethylthiazole-2-il) -2,5- diphenyltetrazolium bromidas (MTT) (Sigma, JAV) tirpalas, kuriame yra 0,2 mg /buvo įtraukta 20 pL tetrazolio dažų ml PBS , optinis tankis, esant 490 nm bangos ilgiui (OD490) buvo nustatomas naudojant imunofermentinės analizės (IFA) skaitytuvą. Vidutinės vertės buvo apskaičiuotos iš trijų dalių kultūrų.
Mobilusis ciklo analizei
Ląstelės buvo surinkti ir sumontuoti 70% etanolio per naktį 4 ° C temperatūroje. Ląstelės buvo plaunami ir tamsintas su propidiumo jodido (PI) (sigma), 5 mikrogramai /ml. Po to, kai 30 min, esant būtų apsaugota nuo šviesos kambario temperatūroje, ląstelės buvo analizuojami per tėkmės citometrijos naudojant "Becton Dickinson FACScan.
Ir prie aneksino V tyrimas
mėginiai buvo išplauti su fosfatas-buferinio tirpalo (PBS) ir naudojant prie aneksino V-fluoresceino izotiocianato (FITC) ir PI dažymo nustatymo fosfatidilserinas poveikio dėl išorinės membranos koncentraciją plazmoje. Po inkubacijos 30 min apsaugotas nuo šviesos kambario temperatūroje, mėginiai buvo kiekybiškai tėkmės citometrijos, naudojant Becton Dickinson FACScan.
Atvirkštinę transkripciją-PCR
bendra RNR buvo ekstrahuojama naudojant TRIzol metodą. RNR buvo atvirkščiai transcripted naudojant komerciškai prieinamą komplektas (Fermentas, JAV). Mišinys (25 pL, kad bendras) PGR sudarė 0,5 mikrol, kDNR, 0,5 U Taq DNR polimerazės, 2,5 pL 10 × PGR buferio, 2,5 mM trifosfato mišinio, ir 50 pM, jutimo ir priešprasmės pradmenų kiekvienas. CyclinD1 ir C-MYC buvo analizuojami šie gruntai: CyclinD1 5'GAACAGAAGTGCGAGGAGGAG3 "ir pakeisti gruntą 5'AGGCGGTAGTAGGACAGGAAG3"; , C-MYC, 5 'CGAGCTGCTGGGAGGAGACAT3 "ir 5" AGCCGCCCACTTTTGACA GG3' Actin:. 5'GGCACCCAGCACAATGAA 3 "ir 5" TAGAAGCATTTGCGGTGG 3 "
Mobilusis lizatas ir Vakarų dėmė analizė
ląstelės buvo lizuoti į lizės buferiniame tirpale ir koncentracija baltymas buvo nustatomas pagal Bradfordo dažų metodą (Bio-rad Laboratories). Lygios sumos ląstelių ekstrakto buvo atliktas ant SDS-PAGE ir perkelti į PVDF membrana (Bio-Rad). Vakarų dėmė analizė buvo daroma su įvairių specifinių pirminių antikūnų. Antikūnai pripažįstant fosfo-p70S6K (Thr389), p70S6K, fosfo-mTOR (Ser2448), BCL-2 ir p53 buvo iš ląstelių signalizacijos.
Statistines analizes
pirminės galutinio taško mūsų tyrime buvo bendras išgyvenamumas (BI). Ji buvo apibrėžiama kaip skirtumas tarp operacijos ir mirties tikrą laikotarpį. išgyvenimą iki ligos progresavimo (DFS) buvo tarp operacijos ir atkryčio ar naviko susijusių mirties laikas. Ji buvo analizuojamos kaip antrinio galutinio taško. P-mTOR išraiškos su įvairiomis clinicalopathologic funkcijų asociacija buvo analizuojami naudojant chi kvadrato testas. Kaupiamasis išgyvenamumas ir išgyvenamumas be ligos buvo apskaičiuota pagal Kaplan-Meier metodu. Žurnalo-rank testas buvo naudojamas įvertinti statistinį reikšmingumą skirtumų tarp išgyvenimo kreivių. Cox proporcinės rizikos modeliu (atgal, palaipsniui) už kintamųjų analizei buvo taikomas veiksnių, pasiektus reikšmę univariacinį analizė. Statistinė analizė atlikta naudojant SPSS programinę įrangą (versija 13 for Windows; SPSS, Čikaga, IL). Skirtumai p < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas.
Rezultatai
Clinicopathologic funkcijos
kaip 181 pacientų iš viso dalyvavo šiame tyrime. Vidutinis pacientų amžius buvo 59 metai (diapazonas, 23-83 metų). Į clinicopathologic charakteristikos tiriamos populiacijos yra apibendrinti 1 lentelėje 129 pacientai buvo vyrai ir 52 moterų. 77 181 navikų (42,5) buvo iš viršutinio skrandžio, 74 181 pacientų (40,9%) buvo nuo apatinės dalies, skrandžio, ir likusios navikai buvo nuo vidurio ir viso kūno, skrandžio. 118 181 (65,2%) pacientų naviko dydis buvo > 4 cm, ir 63 (34,8%) buvo ≤ 4 cm. Pagal Pasaulio sveikatos organizacijos kriterijais, 4 181 navikų (2,2%) buvo gerai diferencijuota, 55 181 navikai (30,4%) buvo vidutiniškai diferencijuoti, 116 buvo blogai diferencijuotas ir 6 buvo nediferencijuota. Pooperacinis chirurgijos etapas buvo klasifikuojami pagal 2002 UICC /AJCC klasifikaciją [26] .table 1 Clinicopathologic koreliacija p-mTOR raiškos skrandžio vėžio
veiksniai

Visi pacientai
Nr pacientų (%)
P

N
= 181 (%)
mTOR neigiamas
mTOR teigiamas

amžius (y)
0,256
< 60
95 (52,5)
50 (56,8)
45 (48,4)
≥60
86 (47,5)
38 (43,2)
48 (51,6)
Lytis
.926
Vyras
129 (71,3)
63 (71,6)
66 (71,0)
Moteris
52 (28,7)
25 (28,4)
27 (29,0) Svetainės
0,053
Aukštutinė
77
(42,5) 33 (37,5)
44 (47,3)
Vidurio
28 ( 15.5)
10 (11,4)
18 (19,4)
mažesnis
74 (40,9)
43 (48,9)
31 (33,3)
Difuzinė
2 ( 1.1)
(2.3)
2: 0 (0.0)
naviko dydis
.172
≤ 4 cm
63 (34,8)
35 (40,0)
28 (30.1)
> 4 cm
118 (65,2)
53 (60,0)
65 (69,9)
BORRMANN tipas
0,398
anksti
7 (3.9)
6 ( 6.8)
1 (1,1)
Aš
4 (2.2)
2 (2.3)
2 (2.1)
II
65 (35,9)
31 ( 35,2)
34 (36,6)
III
101 (55,8)
47 (53,4)
54 (58,1)
IV
4 (2.2)
2 ( 2.3)
2 (2.1)
rūšiavimas
0,999
1
4 (2.2)
2 (2.3)
2 (2.1)
2
55 (30,4)
27 (30,7)
28 (30,1)
3
116 (64,1)
56 (63,6)
60
(64,5) 4
6 (3.3)
3 (3,4)
3 (3,3)
patologinis T klasifikaciją
0,168
T1
17 (13,6)
(9.4)
12 5 (5,4)
T2
35 (19,3)
18 (20,5)
17 (18,3)
T3
119 (62,5)
(65,7)
55 64 (68,8)
T4
10 (5,5)
3 (3,4)
7 (7.5)
patologinė N. statusas
0,008
N. neigiamas
44 ( 24,3)
29 (33,0)
15 (16,1)
N. teigiamas
137 (75,7)
59 (67,0)
78 (83,9)
patologinė stadija (pTNM)
0,026
Aš
26 (14,4)
(19.3)
17 9 (9,7)
II
47 (26,0)
28 (31,8)
19 (20,4)
III
100 (55,2)
41 (46,5)
59 (63,4)
IV
8 (4.4) 2 (2,3)
6 (6,5)
129 181 pacientų (71,2%) turėjo daugiau pažangių, T stadijos liga (PT3 + PT4), ir 137 pacientai (75,7%) turėjo limfmazgių metastazių. Totally pacientai I etapo-IV buvo 26, 47, 100 ir 8 atvejai, atitinkamai.
P mTOR išraiška skrandžio vėžio
imunodažymu p-mTOR buvo citoplazminiame dalies membraninis. 1 paveiksle matyti tipinius pavyzdžius p-mTOR imunodažymu. Normalus skrandžio gleivinė yra neigiamas p-mTOR. Iš 181 pacientų, 93 (51,4%) buvo p mTOR teigiami navikai. 1 pav pavyzdžiai p mTOR imunodažymu. (A) normalus skrandžio gleivinė yra neigiamas p-mTOR (originalas priartinimas × 200). (B) normalus skrandžio gleivinė yra neigiamas p-mTOR (originalas priartinimas × 400) (C) Teigiamas išraiška p-mTOR skrandžio vėžiu (originalus didinimo × 200). (D) neigiamas išraiška p-mTOR skrandžio vėžio (originalas didinimas × 200).
Išgyvenamumo analizė
Pacientai su p mTOR teigiamas skrandžio vėžys parodė žymiai trumpesnis ligos progresavimo ir bendro išgyvenimo, nei su P- mTOR neigiamas skrandžio vėžys (DFS, 48,9%, palyginti su 30,1%; p = 0,006; OS 51.1%, lyginant su 34,4%; p = 0,011; 2 lentelė; 2A pav B). Univariacinį analizė parodė, kad išgyvenimo laikas taip pat sumažėjo su aukštuoju pT klasifikaciją (DFS, p = 0,001; OS, p = 0,005), limfmazgių metastazių (DFS, p < 0,0001; OS, p = 0,001) ir pažangios pTNM etapas (DFS, p < 0,001; OS, p = 0,001). Nebuvo ryšys tarp DFS arba OS ir amžiaus, lyties ar naviko size.Table 2 univariacinį analizė ligos progresavimo ir bendro išgyvenimo skrandžio vėžio


ligos be suivival
Reitingas survival

Characteristic

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

Age(y)
0,343
0,583
< 60
95
1.00
1.00
≥60
86
0,834
0,573-1,214
0,898
0.611-1.320 pervežimas Sex
. 662
.950
Male
129
1.00
1.00
Moteris
52
0,909
0,591-1,396
0,986
0,639-1,521
naviko dydis
0,151
0,232
≤4 cm
63
1.00
1.00
> 4 cm
118
1,345
0,897-2,016
1,287
0,851-1,945 pervežimas pT etape
0,001
0,005
PT1
17
1,00
1.00
pT2
35
1.549
0.558-4.301
.401
1.535
0.553-4.264
.411
pT3
119
3.546
1.437-8.750
.006
3.237
1.310-8.001
.011
pT4
10
4.738
1.547-14.506
.006
4.068
1.289-12.836
.017
pN etapas
< 0,0001
0,001
Neigiama
44
1.00
1.00
Teigiamas
137
2,617
1,538-4,451
2,389
1.401- 4,075
pTNM etapas
< 0,0001
0,001
Aš
26
1.00
1.00
II
47
2.920
1.197-7.121
.018
2.860
1.173-6.973
.021
III
100
4.955
2.152-11.409
< 0,0001
4.455
1,930-10,281
< 0,0001
IV
8
7,369
2,470-21,981
< 0,0001
6,103
1,965-18,957
0,002
P-mTOR
0,008
0,013
Neigiama
88
1.00
1,00
teigiamą
93
1,667
1,146-2,454
1,644
1,112-2,430 pervežimas 2 pav Kaplan-Meier išgyvenimo tikimybė. Pacientai, kurių p-mTOR teigiamą parodė žymiai trumpesnį bendrą išgyvenimą (A) ir išgyvenimo be ligos (B) dydžiai negu su p mTOR neigiamą išraišką. (P = 0,011 ir p = 0,006, atitinkamai)
kintamųjų analizė, limfmazgių metastazės (DFS, p = 0,018; OS, p = 0,038)., Ir pt etapas (DFS, p = 0,018; OS, p = 0,046) buvo žymus nepriklausomos prognostinis faktorius išlikimo laiką. Be to, kelių kintamųjų analizė (3 lentelė) taip pat nurodė tendenciją koreliacijos tarp p mTOR žodžio ir sumažėjo išlikimą, bet tendencija nepasiekė statistinis reikšmingumas (DFS, p = .059; OS, p = .070) .table 3 kintamųjų COX regresinė analizė ligos progresavimo ir bendro išlikimą


ligos be suivival
Reitingas survival

Factors

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

p-mTOR
0,059
0.070
Neigiama
88
1.00
1.00
Positive
93
1,452
0,986-2,138
1,443
0,970-2,147
infiltrating gylis
0,018
0,046
PT1
17
1.00
1.00
pT2
35
1.050
0.366-3.016
0.928
1.078
0.375-3.101
0.889
pT3
119
2.251
0.867-5.845
0.096
2.146
0.823-5.595
0.118
pT4
10
2.926
0.920-9.305
0.069
2.616
2.616-8.580
0.113
Lymph mazgas statusas
0,018
0,038
Neigiama
44
1.00
1.00
Positive
137
1,981
1,981-3,488
1,828
1,034-3,233
RAD001 slopina proliferaciją ir apsaugo p70S6K fosforilinimo
ištirti RAD001 poveikį žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas BGC823 ir AGS platinimu, mes atliekame platinimo tyrimus, atliekamus su 48 valandų poveikio RAD001. Kaip rezultatas, RAD001 generuoja reikšmingai neslopina ant abiejų ląstelių linijoms taip, kad nuo dozės priklausomu būdu. (3A pav.) 3 pav (A), RAD001 slopina proliferaciją skrandžio vėžio ląsteles. Skrandžio vėžio ląstelės buvo gydomi nurodytų koncentracijos RAD001 nuo 10% FBS buvimo už 48 h. Ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas MTT. (B) fosforilinimas p70s6K buvo žymiai sumažėjo priklausomai nuo dozės priklausomu būdu abiem AGS ir BGC823 ląstelių gydymui su RAD001. Abi ląstelių linijos buvo inkubuojamos su didinant dozę RAD001 48 val, ląstelių fragmentai buvo atliktas Western Blot analizės fosforilintu p-S6K ir S6K antikūnų.
Western Blot eksperimentus buvo atliktas su RAD001 ne 0, 5, 10, 20 mikromolių už 48 val. P70s6 kinazės yra svarbus tolesnis tikslas mTOR ir jos mTOR priklauso nuo fosforilinimo leidžia vertimą ribosomų baltymus. Mes išnagrinėjo fosforilinimo statusą vartotojų tikslinės p70s6K munoblotingu. Kaip parodyta 3B pav, mes nustatėme, kad abiejų ląstelių linijų BGC823 ir AGS su RAD001 gydymas žymiai išvengti fosforilinimo p70s6K dozės priklausomu būdu.
RAD001 skatina G0 /G1 ląstelės ciklo suėmimą ir apoptozę skrandžio vėžio ląstelių
Norėdami nustatyti, ar ląstelių proliferacijos slopinimas buvo dėl G0 /G1 fazės suėmimo ar apoptozės, ląstelių ciklo pasiskirstymas analizuojamu FCM. 4 pav parodė, kad gydymas BGC823 ląstelių su RAD001 48 val lėmė tvirta G1 suėmimo ir skatinti apoptozę. Su vis dozę RAD001, vis daugiau ir daugiau ląstelių liko G1 fazėje, o ląstelės ciklo progresavimą į S fazę mažėjo (4a paveikslas). RT-PGR analizė parodė, RAD001 priklausomai nuo dozės sumažėjo lygis mRNR nuo ciklino D1 ir C-myc (4b pav). 4 pav RAD001 skatina ląstelių ciklo suėmimą ir apoptozę BGC823 ląsteles. (A) BGC823 ląstelės buvo veikiamos įvairios koncentracijos RAD001 už 48 h. (B) RNR buvo paimti iš ląstelių. Ciklino D1 ir C-myc raiškos lygis buvo aptikta RT-PGR, aktino prisotinamosios kontrolės. (C) ląstelės buvo inkubuojamos 48 val su nurodytomis dozėmis RAD001 prieš dažant aneksino V-FITC. Ekrane rodomi apoptozinių ląstelių procentai. (D) Ląstelės buvo inkubuojamos 48 val su nurodytomis dozėmis RAD001. Ląstelės buvo surinkti, lizuojamos ir veikiamas Western Blot analizės Bcl-2 ir p53 antikūnų. GAPDH buvo naudojamas kaip pakrovimo kontrolę.
Aneksinas-V tyrimai parodė, kad RAD001 gerokai sukeltos apoptozės BGC823 ląsteles. In apoptozė tarifo padidinimas buvo analizuojami FCM su doze (4c pav) padidėjimas. Western Blot analizė parodė, RAD001 priklausomai nuo dozės mažėja baltymų lygį Bcl-2 ir padidinti baltymų lygį p53 (4d pav). Panašūs rezultatai buvo pastebėtas AGS ląstelių (duomenys neparodyti).
Diskusijos
žinduolių rapamicino taikinio (mTOR) buvo atrastas 1990 metų pradžios s studijuoti veiksmų rapamicino mechanizmą, kuris iš pradžių buvo nustatyta kaip priešgrybelinis agentas, o vėliau buvo pripažintas priešvėžinių savybių [27]. Kaip Ser /THR baltymų kinazės, mTOR vaidina svarbų vaidmenį ląstelių augimo ir homeostazės [28]. MTOR baltymas sudaro kompleksus su adapteriu baltymų, mTORC1 (žinduolių rapamicino taikinio komplekso 1) ir mTORC2. Aktyvinimas mTORC1 reguliuoja ląstelių augimą, keičiant baltymų sintezę, ribosomos Biogenezė ir autofagija [29]. MTORC2 kelias vaidina svarbų vaidmenį aktyvuotų Akt, kaip PDK1 (3 phosphoinositide priklauso nuo baltymų kinazės 1) ir PI3K, potencialus narkotikų tikslo vėžio, kuriose yra Akt reguliavimą [26].
Dabartiniame tyrime mes nustatėme, kad 93 (51,4%) pacientai turėjo teigiamą išraišką p-mTOR 181 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. Suderinamas su mūsų rezultatas, kitą tyrimą, įskaitant 1072 pacientus, p-mTOR išraiška yra 46,5% [30].
Ankstesni tyrimai pranešė prognostinę reikšmę p mTOR išraiška. Herberger et al [18]. identifikuoti p mTOR būti nepriklausoma prognostinis faktorius mirties pacientus, kuriems yra tulžies takų adenokarcinoma. Jų tyrimo duomenimis, bendrasis išgyvenamumas buvo žymiai trumpesnis pacientams, sergantiems p mTOR teigiamas navikų, palyginti su pacientais, kurių p mTOR neigiamas navikų (p = 0,004). Skrandžio vėžio, J. et al. įvertintas išraiška p-mTOR 1.072 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, naudojant audinių mikrogardeliq, demonstruodama raiškos p-mTOR buvo nepriklausoma prognostinis faktorius [30]. Tačiau, tyrimo įtraukti 109 pacientai, sergantys skrandžio adenokarcinomos, kuriems buvo atlikta radikali pašalintas skrandis [31], Murayama et al. nerasta nei citoplazmos p mTOR nei branduolinis p mTOR buvo nepriklausoma prognostinis faktorius, nors jie nustatė citoplazmos p mTOR išraiška buvo susijęs su prastesne išlikimo ir koreliuoja su naviko invazijos, limfmazgių ir naviko stadijos gylio. Šiame tyrime mes patvirtino, kad pT klasifikacija ir limfmazgių būklė yra nepriklausomi prognostinė rodiklis klinikinės baigties skrandžio vėžio pacientams kintamųjų analizės. Tačiau, kadangi dauguma pacientų, esančių lokaliai progresavusia liga, kitų antrinių prognostinių žymenų, ypač p-mTOR, gali būti naudinga [13]. Mūsų rezultatai aiškiai rodo, kad P-mTOR išraiška koreliuoja stipriai su prasta bendra ir ligų be išlikimo univariacinį analizių su tendencija koreliacijos kintamųjų analizės.
Laikantis dabartinės studijų, keletas tyrimų, taip pat pripažino antiproliferaciniu poveikį mTOR inhibitorių skrandžio vėžio ląsteles. Pavyzdžiui, Lang et al [21]. identifikuoti rapamicinas gali slopinti skrandžio vėžio ląstelių augimą tiek po oda auglio modelio ir eksperimentinio modelio. Jų rezultatai pabrėžti mTOR inhibitorių tinkamumą būti naudojama esant antiangiogeniniu kontekste terapijos skrandžio vėžio.
Tačiau RAD001 yra naujas mTOR inhibitorius priešvėžinis agentas. Mechanizmas apie RAD001 skrandžio vėžio nėra aiški. Cejka ir kt. parodė, kad antiangiogeninio veikla RAD001 kartu su didele doze ciklofosfamido atskleidė sinergetinį priešvėžinėmis skrandžio vėžio [32]. Jie taip pat nustatė, kad RAD001 sumažėjo platinimu ir mažėjančios gamybos HIF-1α taip pat VEGF skrandžio vėžio ląsteles in vitro [33]. Atsižvelgiant į dabartinę studijų, mūsų duomenys rodo, kad RAD001 terapijos susilpnintas fosforilinimo p70S6K ir gerokai slopina skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją per mobilųjį ciklo arešto ir apoptozės in vitro. Mes nustatėme, RAD001 paskatino G0 /G1 fazės suėmimas, kuris buvo susijęs su sumažėjusiu ciklino D1 ir C-myc. Be to, mes parodė, pirmą kartą, kad RAD001 kaip naują mTOR inhibitorius priklausomai nuo dozės sukeltas apoptozę skrandžio vėžio ląsteles ir prie aneksino V tyrimų. Šis poveikis gali būti padiktavo ląstelių kontekste ir paskesnių tikslus, įskaitant P53 ir BCL-2. Šie duomenys gali dar paaiškinti RAD001 veiksmingumą.
Išvada
Apibendrinant, mes atlikome sisteminį tyrimus mTOR skrandžio vėžio, nurodant ryšius išraišką su prognozė vertės aktyvintos mTOR (p-mTOR) in vivo, iš RAD001 poveikis ir mechanizmų skrandžio vėžio ląstelėse in vitro dalis. Mūsų rezultatai rodo, kad P-mTOR pasitarnautų kaip potencialus biologinis persekiotoją, kad nustatyti skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, blogos prognozės pogrupį. Ji taip pat parodė, kad RAD001 buvo perspektyvus agentas su skrandžio vėžio gydymui su skatinant ląstelių ciklo suimti ir apoptozę pagal žemyn reguliavimo išraiška C-myc, CyclinD1 ir Bcl-2, iki reguliavimo išraiška P53. Tolesni tyrimai privalo išsiaiškinti apie mTOR aktyvavimo vaidmenį ir galiausiai pasiūlyti mTOR kaip konkretų tikslą skrandžio vėžio gydymo
Pastaba
suteikti paramą. Palaikoma Nacionalinės aukštųjų technologijų mokslinių tyrimų ir plėtros (863) programa Kinijos
pastabos
Da Zhi Xu Qi Rong Geng prisidėjo vienodai prie šio darbo.
deklaracijų
nusipelniusieji
Šis darbas parėmė Nacionalinės aukštųjų technologijų mokslinių tyrimų ir plėtros (863) programa Kinija. Autoriai vertiname puikią techninę pagalbą Li-Hui Wang, Fei-Meng Zheng Zheng-zhi Zou, Yan Zhang ir Zi-JIE Long.
Autoriai pradinis pateiktų failų vaizdų
Žemiau yra nuorodos į Autoriaus originalus pateiktų failų vaizdų. 12885_2009_2335_MOESM1_ESM.pdf Autorių originalus failas 1 pav 12885_2009_2335_MOESM2_ESM.pdf Autorių originalaus failo 2 pav 12885_2009_2335_MOESM3_ESM.pdf Autorių originalaus failo 3 pav autoriai 12885_2009_2335_MOESM4_ESM.pdf pradinis failą 4 paveiksle konkuruojančių interesų Viesbutis The autoriai deklaruoja, kad jie neturi konkuruojančius interesus.

• Prognostinę poveikis tautybės skrandžio ir stemplės vėžiu: gyventojų pagrindu patirtis Britų Kolumbija, Canada
• Identifikavimas prognozinių veiksnių ir chirurginių nuorodų metastazavusiu skrandžio cancer