Aktivált mammalian target of rapamycin egy potenciális terápiás célpont a gyomor cancer

Aktivált mammalian target of rapamycin egy potenciális terápiás célpont a gyomorrák
Abstract
alapon
Az emlős target of rapamycin (mTOR) játszik kulcsfontosságú szerepet sejtnövekedést és a homeosztázis. A cél a jelenlegi tanulmány célja, hogy megvizsgálja a kifejezése aktivált mTOR (p-mTOR) a gyomorrákos betegek, prognosztikai jelentősége és gátló hatása RAD001 a tumor növekedését és annak megállapítására, hogy a célzott gátlása mTOR lehet potenciális terápiás stratégia gyomorrák. katalógusa módszerek
kifejezése p-mTOR mutattunk példányaival 181 gyomorrák átesett reszekcióra (R0) immunhisztokémiai módszerrel. A korreláció p-mTOR kifejezés klinikopatológiai jellemzők és a túlélés a gyomorrák vizsgáltuk. Azt is megállapítottuk, a gátló hatása RAD001 a tumor növekedését a BGC823 és AGS emberi gyomor rákos sejtvonalak. Katalógusa Eredmények katalógusa Immunfestést p-mTOR pozitív volt 93 181 (51,4%) gyomorrák, szoros kapcsolatban van a nyirok csomópont állapotát és pTNM színpadon. Betegek p-mTOR pozitív szignifikánsan rövidebb betegségmentes túlélés (DFS) és a teljes túlélés (OS) aránya, mint a p-mTOR-negatív tumorok univariable elemzések, és ott volt a tendencia, hogy korreláció p-mTOR kifejezés és túlélés többváltozós elemzéseket. RAD001 jelentősen gátolja dózis-függő proliferációját humán gyomorkarcinóma sejtekre down-expressziójának szabályozására p70S6K, p-p70S6K, c-myc, CyclinD1 és a Bcl-2, up-expressziójának szabályozására P53.
Következtetések
gyomor rák, p-mTOR egy potenciális terápiás célpont és RAD001 volt ígéretes kezelés ügynök indukáló sejtciklus és apoptózis alulszabályozza expressziójának c-myc, CyclinD1 és a Bcl-2, up-expressziójának szabályozására P53. katalógusa háttér katalógusa gyomorrák a negyedik leggyakoribb daganat a második vezető oka a rák okozta halál világszerte, ebből 1 millió új eset évente szerte a világon. [1] Mintegy 60% -a új esetek gyomorrák elő Kelet-Ázsiában [2], különösen Kínában. Sebészi eltávolítását a leghatékonyabb kezelés a gyomorrák és a kemoterápia hatékonyságát továbbra is korlátozott [3]. Számos tanulmány azt mutatta, hogy a mélység a invázió száma és a metasztatikus nyirokcsomók a legfontosabb erős előrejelzője túlélési gyomor rákos betegek [4, 5]. Például, a korábbi vizsgálatok [6, 7] azt találtuk, pozitív nyirokcsomó arány független prognosztikai indikátor után D2 reszekció és intraperitoneális kemoterápia előnyös lehet gyomorrák betegeknél. Azonban alapvető lépés javította a klinikai kimenetel rejlik fokozott megértése a daganat biológiai viselkedése, ami segíthet azonosítani a lehetséges célok egyéni terápia [8, 9].
Az utóbbi években molekulárisan alapú megközelítések kezelés gyomorrák kapott nagy aggodalomra ad okot. Számos cikk már leírták néhány potenciális molekuláris célpontokat terápiára gyomorrák, mint például az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) [10-13], a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) [14], RECEPTEUR d'origine Nantais (RON) [15 ].
A emlős rapamicin célpont (mTOR) egy új potenciális molekuláris célpontja a daganatellenes kezelés. A expresszióját kimutatták különböző sejtvonalakban és a tumor minták, mint például a máj neoplazmák [16], a mellrák [17], epeúti adenokarcinóma, [18] és a méhnyakrák [19, 20]. Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy az mTOR expresszió társított rossz klinikai prognózisa. Lang és munkatársai [21]. is megfigyeltük mTOR aktiválás humán gyomorrák in vitro és in vivo. Jelezték mTOR gyakran aktiválódik humán gyomorrák. Nemrég egy orálisan hasznosuló rapamycinszármazék, RAD001 (everolimusz; Novartis Pharma AG), került kialakításra. Egy fázis III vizsgálatban kiderült kezelés everolimusszal meghosszabbítja progressziómentes túlélés metasztatikus vesesejtes karcinóma, hogy haladtak más célzott terápiák [22]. RAD001 azt is kimutatták, hogy gátolja a proliferációt tumorsejt növekedésének bizonyos karcinómák [23, 24]. De a szerepe RAD001 a gyomor rákos sejt nem világos.
A célja ennek a tanulmánynak, hogy tovább elemezni a kapcsolatot az mTOR kifejezés a prognózis értéke aktivált mTOR (p-mTOR), a hatás RAD001 a növekedés és a sejtciklus humán gyomorrák sejtek in vitro és meghatározza, hogy a gyomorrák egy jó jelölt cél kezelés mTOR inhibitorok. katalógusa módszerek
vizsgált betegek katalógusa a retrospektív vizsgálatot állt 181 átesett betegek reszekcióra ( R0) a szövettanilag igazolt gyomorrák: Cancer Center Szun Jat-szen Egyetemen 1997 januárja és 2002 decembere Minden beteg szövettanilag igazolt adenocarcinoma a gyomor esett át sem közelebbi részbeni eltávolítását, távolabbi részleges vagy teljes gastrectomia gastrectomián. Etikai jóváhagyást nyert Szun Jat-szen Egyetemen Cancer Center kutatás etikai bizottság.
Azok megfelelő szövettani anyag és teljes klinikai adatokat bekerülhető. A jogosultsági feltételeket is tartalmazza szövettanilag igazolt R0 reszekció, amely definíció szerint nincs makroszkopikus és mikroszkopikus reziduális tumor és posztoperatív túlélési idő ≥ 6 hónap. Betegek távoli áttétek és carcinoma gyomor- csonkja a műtét után a jóindulatú betegség kizártuk a vizsgálatból. Ennek oka az, hogy a betegek túlélési távoli áttétek gyakran befolyásolja számos egyéb tényező, például preoperatív kemoterápia vagy elzáródás.
Valamennyi beteg nyomon követése a műtét után a 6-12 hónapos időközönként; A végső határidő utánkövetés volt 2008. december Medián követési idő 50 (átlag: 50,66; tartomány 10-128) hónap minden betegnél, és 74 hónap (átlag: 72,80; tartomány 27-128) a túlélésre. Medián követés 40 (átlag: 43,71; tartomány 11-125) azon betegekben, akik daganatos p-mTOR pozitív kifejezés, illetve 60,5 hónap volt (átlag: 58,01; tartomány 10-128) negatív kifejezés. A túlélést napjától számított diagnózis, amíg a halál időpontját vagy az utolsó utánkövetés során.
Mintagyűjtés és Immunfestést p-mTOR Tanuld az összes tumor mintákat nyert műtétileg eltávolított gyomorrák előtt adjuváns terápia. A formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövet blokkok tároltuk szobahőmérsékleten azonosított egy azonosító számot. Öt-um vastag szövettani metszeteket vágunk a paraffin blokkokat, paraffint xilolban, és rehidratált. Antigén lehívása feldolgozva nátrium-citrát. A lemezeket ezután inkubáltuk 0,3% H 2 O 2-on 10 percig, és blokkoltuk 1% szarvasmarha szérum albumin 60 percig, majd egy nyúl monoklonális antitest specifikus P-mTOR (Phospho-mTOR, Ser2448, 49F9; Cell Signaling Technology) 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán át, majd megfestettük 3,3-diaminobenzidin. Előhívás után az immunreaktivitás a metszeteket hematoxilinnel ellenfestettük majd szerelve.
Értékelése immunhisztokémiai festéssel
A immunfestett metszeteket értékeltük és a szöveteket a humán prosztata adenokarcinómák szolgált pozitív kontrollként. Szerint a közelmúltban leírt kritériumok értékelése mTOR kifejezés, festődés intenzitása határoztuk meg 0 (hiányzik), 1 (gyenge), és a 2. (erős) és expressziós szintjének a biomarkerek arra semiquantified immunohisztokémiai pontszám (tartomány: 0-200) számított megszorozzuk festődés intenzitása a százalékos pozitív tumorsejtek [18]. A betegek egy immunhisztokémiai pontszáma ≤ 20 tekintették p-mTOR-negatív és azokat a pontszám > 20 p-mTOR-pozitív. Minden metszeten egymástól függetlenül két független patológusok ismerete nélkül a betegek klinikai adatait. Amikor a vélemények a két értékelők eltérő megállapodás született gondos vita. Katalógusa Sejtvonalak és tenyésztési körülmények
emberi gyomor rákos sejtvonalak BGC823 és AGS (ATCC száma: CRL-1739), amelyek rosszul differenciált volt ajándék pekingi Egyetem Onkológiai (Peking, Kína). [25]. A sejtvonalakat RPMI 1640 közegben (Invitrogen), kiegészítve 10% magzati marhaszérummal (Hyclone), penicillint (100 egység /ml) és sztreptomicin (100 egység /ml) 37 ° C-on és 5% CO 2-tartalmú nedvesített inkubátorban .
életképesség teszt
Annak vizsgálata hatását RAD001 humán gyomorrák-sejtek, a sejtek életképességét úgy határoztuk meg, MTT assay-vel. RAD001 adta Novartis Pharma (Basel, Svájc). Az életképesség teszt, logaritmikusan növekvő sejteket stimulálunk különböző dózisú RAD001 (0, 5, 10, 20 és 40 uM). Végén a tenyésztési periódus 20 ul tetrazólium festék 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil-bromid (MTT) (Sigma, USA) oldatot 0,2 mg /ml PBS-ben készült oldatához , az optikai sűrűség 490 nm-en (OD490) segítségével határoztuk meg egy enzimmel kapcsolt immunoszorbens assay (ELISA) olvasó. Átlagértékeket számítva három párhuzamos kultúrákban.
Sejtciklus analízis
sejteket összegyűjtöttük, és rögzített 70% -os etanolban egy éjszakán át 4 ° C hőmérsékleten. A sejteket ezután mostuk, és megfestettük propidium-jodid (Pl) (Sigma) 5 ug /ml. Az elegyet 30 percig szobahőmérsékleten, fénytől védve, a sejteket analizáltuk keresztül áramlási citometriával Becton Dickinson FACScan.
Annexin V assay katalógusa A mintákat mossuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), és Annexin V-fluoreszcein izotiocianát (FITC), és a PI festéssel meghatározására foszfatidilszerin expozíció a külső plazmamembrán. Inkubálás után 30 percig szobahőmérsékleten, fénytől védve, a mintákat mennyiségileg áramlási citometriával, Becton Dickinson FACScan.
Reverz transzkripciós PCR
Teljes RNS-t extraháltunk TRIzol módszerrel. Az RNS-t fordítottan átírt egy kereskedelemben kapható készlet (Fermentas, USA). A keveréket (25 ul össz) PCR állt 0,5 ul cDNS, 0,5 U Taq DNS-polimeráz, 2,5 mikroliter 10 x koncentrált PCR-puffert, 2,5 mM dNTP keveréket, és 50 pM szensz és antiszensz primerek minden. CyclinD1 és c-Myc analizáltuk alábbi primerek alkalmazásával: CyclinD1 5'GAACAGAAGTGCGAGGAGGAG3 'és reverz primert 5'AGGCGGTAGTAGGACAGGAAG3'; C-myc, 5 'CGAGCTGCTGGGAGGAGACAT3' és 5 'AGCCGCCCACTTTTGACA GG3 "aktin: 5'GGCACCCAGCACAATGAA 3' és 5 'TAGAAGCATTTGCGGTGG 3'.
Cell lizátum és Western blot analízissel
sejteket lizáltuk lízispufferben, és a koncentráció fehérje határoztuk meg Bradford festék módszerrel (Bio-Rad Laboratories). Egyenlő mennyiségű sejtextraktumot vetettük alá SDS-PAGE és PVDF membránra (Bio-Rad). Western blot analízist végzett különböző specifikus elsődleges antitesteket. Felismerő antitestek foszforilált p70S6K (Thr389), p70S6K, foszfor-mTOR (Ser2448), Bcl-2 és a p53 voltak a Cell Signaling. Katalógusa Statisztikai elemzések katalógusa Az elsődleges végpont a teljes túlélés volt (OS). Ez lett a közötti időszakban a műtét idején és a halál. Betegségmentes túlélés (DFS) volt az az idő között a műtét idején és a visszaesés vagy tumor okozta halál. Elemezték azt, másodlagos végpontot. Az egyesület a p-mTOR kifejezés különböző clinicalopathologic funkciók alkalmazásával analizáltuk chi-négyzet próba alapján. Kumulatív túlélési és betegségmentes túlélés Kaplan-Meier-módszerrel. A log-rank teszttel, hogy értékelje a statisztikai szignifikancia közötti különbségek túlélési görbék. A Cox (visszafelé, lépésenként) többváltozós analízist végeztünk a tényezőket, elért jelentősége univariable elemzés. Statisztikai analízist végeztünk SPSS szoftver (verzió 13 for Windows; SPSS, Chicago, IL). Különbségek a P < 0,05 tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Katalógusa Eredmények katalógusa klinikai és jellemzői
összesen 181 beteget vontak be a vizsgálatba. A medián életkor 59 év volt (tartomány, 23-83 év). A klinikai és patológiai jellemzői a vizsgálati populáció foglalja össze az 1. táblázat 129 férfi volt, és 52 nő. 77 181 tumorok (42,5) volt, a felső gyomor, 74 181 beteg (40,9%) volt az alsó része a gyomor, és a fennmaradó tumorok voltak a középső és az egész test a gyomorban. 118 181 (65,2%) beteg tumor mérete is > 4 cm, és 63 (34,8%) volt ≤ 4 cm. Összhangban az Egészségügyi Világszervezet kritériumai, 4 181 tumorok (2,2%) volt jól differenciált, 55 181 daganatos (30,4%) volt közepesen differenciált, 116 volt gyengén differenciált, és 6 differenciálatlan. Műtét utáni sebészeti stádium besorolása szerint a 2002-es UICC /AJCC osztályozás [26] .table 1 klinikai és korreláció p-mTOR kifejezés gyomorrákban katalógusa tényezők Matton Minden beteg Matton No. A betegek (%) Matton P
katalógusa N katalógusa = 181 (%) Matton mTOR negatív Matton mTOR pozitív Matton katalógusa Életkor (y) hotelben 0,256 katalógusa < 60 katalógusa 95 (52,5) hotelben 50 (56,8) hotelben 45 (48,4) hotelben ≥60 katalógusa 86 (47,5) hotelben 38 (43,2) hotelben 48 (51,6)
Sex katalógusa 0,926 katalógusa Férfi katalógusa 129 (71,3) hotelben 63 (71,6) hotelben 66 (71,0) fiatal női katalógusa 52 (28,7) hotelben 25 (28,4) katalógusa 27 (29,0) hotelben Oldal
0,053 katalógusa Felső katalógusa 77 (42,5) hotelben 33 (37,5) hotelben 44 (47,3) hotelben Közép katalógusa 28 ( 15.5) hotelben 10 (11,4) hotelben 18 (19,4) hotelben alsó katalógusa 74 (40,9) hotelben 43 (48,9) hotelben 31 (33,3) hotelben Diffúz katalógusa 2 ( 1.1) hotelben 2 (2.3) hotelben 0 (0.0) hotelben tumor méretét katalógusa 0,172 katalógusa ≤ 4 cm katalógusa 63 (34,8) hotelben 35 (40,0) hotelben 28 (30.1) hotelben > 4 cm-es katalógusa 118 (65,2) hotelben 53 (60,0) hotelben 65 (69,9) hotelben Borrmann típusú
0,398 katalógusa korai szakaszában katalógusa 7 (3,9) hotelben 6 ( 6.8) hotelben 1 (1,1) hotelben I
4 (2,2) hotelben 2 (2.3) hotelben 2 (2.1) hotelben II
65 (35,9) hotelben 31 ( 35.2) hotelben 34 (36,6) hotelben III
101 (55,8) hotelben 47 (53,4) hotelben 54 (58,1) hotelben IV
4 (2,2) hotelben 2 ( 2.3) hotelben 2 (2.1) hotelben osztályozási katalógusa 0,999 katalógusa 1 katalógusa 4 (2,2) hotelben 2 (2.3) hotelben 2 (2.1) hotelben 2 | 55 (30,4) hotelben 27 (30,7) hotelben 28 (30,1) hotelben 3 katalógusa 116 (64,1) hotelben 56 (63,6) hotelben 60 (64,5) hotelben 4 katalógusa 6 (3.3) hotelben 3 (3.4) hotelben 3 (3.3) hotelben kóros T besorolás katalógusa 0,168 katalógusa T1 katalógusa 17 (9,4) hotelben 12 (13,6) katalógusa 5 (5,4) hotelben T2 katalógusa 35 (19,3) hotelben 18 (20,5) hotelben 17 (18,3) hotelben T3 katalógusa 119 (65,7) hotelben 55 (62,5) hotelben 64 (68,8) hotelben T4 katalógusa 10 (5,5) hotelben 3 (3.4) hotelben 7 (7,5) hotelben kóros N állapot katalógusa 0,008 katalógusa N negatív katalógusa 44 ( 24.3) hotelben 29 (33,0) hotelben 15 (16,1) hotelben N pozitív katalógusa 137 (75,7) hotelben 59 (67,0) hotelben 78 (83,9) hotelben kóros szakasz (pTNM)
0,026 katalógusa I
26 (14,4) hotelben 17 (19,3) hotelben 9 (9,7) hotelben II
47 (26,0) hotelben 28 (31,8)
19 (20,4) hotelben III katalógusa 100 (55,2) hotelben 41 (46,5) hotelben 59 (63,4) hotelben IV
8 (4,4) hotelben 2 (2.3)
6 (6,5) hotelben 129 181 beteg (71,2%) volt a fejlettebb T stádiumú (PT3 + PT4), és 137 beteg (75,7%) volt nyirokcsomó-metasztázis. Teljesen betegek szakasz I-IV 26, 47, 100 és 8 esetben volt.
P-mTOR expresszió gyomorrák
immunfestése p-mTOR volt citoplazmatikus, és részben hártyás. Az 1. ábrán jellegzetes példák p-mTOR immunfestés. A normál gyomornyálkahártya negatív p-mTOR. A 181 beteg, 93 (51,4%) volt p-mTOR-pozitív daganatok. 1. ábra Példák a p-mTOR immunfestés. (A) A normális gyomornyálkahártya negatív P-mTOR (eredeti nagyítás × 200). (B) A rendes gyomornyálkahártya negatív P-mTOR (eredeti nagyítás × 400) a (C) pozitív kifejeződése p-mTOR a gyomorrák (eredeti nagyítás × 200). (D) negatív kifejezése p-mTOR gyomorrákban (eredeti nagyítás × 200).
Túlélési analízis katalógusa betegek p-mTOR pozitív gyomorrák szignifikánsan rövidebb betegségmentes és teljes túlélés aránya, mint a p- mTOR negatív gyomorrák (DFS, 48,9% vs. 30,1%; p = 0,006; OS, 51,1% vs. 34,4%; p = 0,011; 2. táblázat 2A ábra, B). Univariable elemzés kimutatta, hogy a túlélési idő is csökkent a magasabb pT besorolás (DFS, p = 0,001; OS, P = 0,005), nyirokcsomó áttét (DFS, p < 0,0001; OS, P = 0,001), valamint a fejlett pTNM szakasz (DFS, p < 0,001; OS, P = 0,001). Nem volt összefüggés a DFS vagy OS és az életkor, a nem, vagy tumor size.Table 2 Univariable elemzése betegségmentes és teljes túlélést gyomorrákban katalógusa katalógusa katalógusa Betegségmentes suivival Matton Átlag survival

Characteristic

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

Age(y)
0,343 katalógusa 0,583 katalógusa < 60 katalógusa 95 katalógusa 1.00 katalógusa 1.00 katalógusa ≥60 katalógusa 86 katalógusa 0.834 katalógusa 0,573-1,214 katalógusa 0.898 katalógusa 0,611-1,320 katalógusa Sex katalógusa. 662 katalógusa 0,950 katalógusa Férfi katalógusa 129 katalógusa 1.00 katalógusa 1.00 fiatal női katalógusa 52 katalógusa 0.909 katalógusa 0,591-1,396 katalógusa 0.986 katalógusa 0,639-1,521
daganat mérete katalógusa 0,151 katalógusa 0,232 katalógusa ≤4 cm katalógusa 63 katalógusa 1.00 katalógusa 1.00 katalógusa > 4 cm katalógusa 118 katalógusa 1.345 katalógusa 0,897-2,016 katalógusa 1.287 katalógusa 0,851-1,945 katalógusa pT stádium katalógusa 0,001 katalógusa 0,005 katalógusa pT1
17
1,00 katalógusa 1.00 katalógusa pT2
35
1.549
0.558-4.301
.401
1.535
0.553-4.264
.411
pT3
119
3.546
1.437-8.750
.006
3.237
1.310-8.001
.011
pT4
10
4.738
1.547-14.506
.006
4.068
1.289-12.836
.017
pN szakaszban katalógusa < 0,0001 katalógusa 0,001 katalógusa Negatív katalógusa 44 katalógusa 1.00 katalógusa 1.00 katalógusa Pozitív katalógusa 137 katalógusa 2,617 katalógusa 1,538-4,451 katalógusa 2.389 katalógusa 1.401- 4.075 katalógusa pTNM szakaszban katalógusa < 0,0001 katalógusa 0,001 katalógusa I
26 katalógusa 1.00 katalógusa 1.00 katalógusa II
47
2.920
1.197-7.121
.018
2.860
1.173-6.973
.021
III
100
4.955
2.152-11.409
< 0,0001 katalógusa 4,455 katalógusa 1,930-10,281 katalógusa < 0,0001 katalógusa IV katalógusa 8 katalógusa 7,369 katalógusa 2,470-21,981 katalógusa < 0,0001 katalógusa 6.103 katalógusa 1,965-18,957 katalógusa 0,002 katalógusa p-mTOR katalógusa 0,008 katalógusa 0,013 katalógusa Negatív katalógusa 88 katalógusa 1.00 katalógusa 1,00
Pozitív katalógusa 93 katalógusa 1.667 katalógusa 1,146-2,454 katalógusa 1,644 katalógusa 1,112-2,430 katalógusa 2. ábra Kaplan-Meier a túlélés valószínűségét. Betegek p-mTOR pozitív szignifikánsan rövidebb a teljes túlélés (A) és a betegségmentes túlélés (B) aránya, mint a p-mTOR negatív kifejezés. (P = 0,011 és p = 0,006) kapcsolatosan.
Többváltozós elemzés nyirokcsomómetastasis (DFS, p = 0,018; OS, P = 0,038) és a PT szakasz (DFS, p = 0,018; OS, P = 0,046) szignifikáns független prognosztikai tényezője túlélési időt. Ezen túlmenően, többváltozós analízis (3. táblázat) szintén jelezte a tendencia, hogy korreláció p-mTOR kifejezés és csökken a túlélés, de a tendencia nem érte el a statisztikailag szignifikáns mértéket (DFS, p = 0,059; OS, P = 0,070) .table 3. Többváltozós cox regressziós elemzés betegségmentes és teljes túlélést katalógusa katalógusa
A betegségtől mentes suivival Matton Átlag survival

Factors

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

p-mTOR
0.059 katalógusa 0.070 katalógusa Negatív katalógusa 88 katalógusa 1.00 katalógusa 1.00 katalógusa Pozitív katalógusa 93 katalógusa 1.452 katalógusa 0,986-2,138 katalógusa 1.443 katalógusa 0,970-2,147
infiltráló mélység katalógusa 0.018 katalógusa 0,046 katalógusa pT1
17 katalógusa 1.00 katalógusa 1.00 katalógusa pT2
35
1.050
0.366-3.016
0.928
1.078
0.375-3.101
0.889
pT3
119
2.251
0.867-5.845
0.096
2.146
0.823-5.595
0.118
pT4
10
2.926
0.920-9.305
0.069
2.616
2.616-8.580
0.113
Lymph csomópont állapotát katalógusa 0.018 katalógusa 0.038 katalógusa Negatív katalógusa 44 katalógusa 1.00 katalógusa 1.00 katalógusa Pozitív katalógusa 137 katalógusa 1.981 katalógusa 1,981-3,488 katalógusa 1,828
1,034-3,233 katalógusa RAD001 proliferációját gátolja, és megakadályozza, hogy p70S6K foszforiláció katalógusa hatásának vizsgálata a RAD001 az elterjedése az emberi gyomor rákos sejtvonalak BGC823 és AGS végeztünk proliferációs vizsgálattal 48 órás expozíció RAD001. Ennek eredményeként RAD001 generál szignifikáns gátlás a két sejtvonal egy dózis-függő módon. (3A ábra). A 3. ábra (A) RAD001 proliferációját gátolja a gyomor rákos sejteket. A gyomor rákos sejteket kezeltük a jelzett koncentrációjú RAD001 jelenlétében 10% FBS 48 órán át. A sejtek életképességét értékelte MTT assay. (B) foszforilezése a p70S6K szignifikánsan csökkent dózisfüggő módon mindkét AGS és BGC823 sejtek által a kezelés RAD001. Mindkét sejtvonalat inkubálunk növekvő dózisú RAD001 48 órán, sejtlizátumokat vetettük alá Western-blot-analízis és a foszforilezett p-S6K és S6K antitestek.
Western blot kísérletek végeztünk RAD001 0, 5, 10, 20 | iM 48 órán át. P70S6-kináz egy fontos downstream célpontja mTOR és mTOR-függő foszforilezését lehetővé teszi fordítását riboszomális fehérjék. Megvizsgáltuk a foszforilációs állapotát downstream célpontja p70S6K immun. Ábrán látható a 3B, azt találtuk, hogy a kezelés mindkét sejtvonalban BGC823 és AGS a RAD001 jelentősen megakadályozzák foszforilációját p70S6K dózis-függő módon.
RAD001 indukál G0 /G1 sejtciklus és apoptózis gyomor rákos sejtek
Annak meghatározására, hogy a szuppresszió a sejtburjánzás volt köszönhető G0 /G1-fázisban vagy apoptózis, sejtciklus-eloszlás analizáltuk FCM. 4. ábra azt mutatta, hogy a kezelés a BGC823 sejtjeinek a RAD001 48 órán eredményezett robusztus G1 és támogatni az apoptózist. A növekvő dózisú RAD001, egyre több és több sejt maradt G1-fázisban, míg a sejtciklus progressziójában, az S fázist csökkenő (4a ábra). RT-PCR analízis kimutatta RAD001 dózisfüggően csökkentette a mRNS szintje a ciklin D1 és a c-myc (4b ábra). 4. ábra RAD001 sejtciklusleállást és apoptózist BGC823 sejtekben. (A) BGC823 sejteket tettünk ki különböző koncentrációjú RAD001 48 órán át. (B) RNS-t kivontuk a sejtekből. Ciklin D1 és c-myc expresszió szintet detektáltunk RT-PCR-rel, az aktin, mint egy terhelési kontrollként. (C) a sejteket inkubáltuk 48 órán a jelzett dózisokban RAD001 festés előtt Annexin V-FITC-vel. A százalékokat az apoptotikus sejtek jelennek meg. (D) A sejteket 48 órán a jelzett dózisokban RAD001. A sejteket összegyűjtjük, lizáljuk és vetjük alá Western-blot-analízis a Bcl-2 és a p53 ellenanyagokat. GAPDH használtunk terhelési kontrollként.
Annexin-V vizsgálati eljárásokban azt mutatták, hogy RAD001 jelentősen indukált apoptózist BGC823 sejtekben. Fokozódott az apoptózis mértéke analizáltuk FCM növekedésével a dózis (4C). Western-blot analízis azt mutatta, RAD001 dózisfüggően csökkenti a fehérje szintje a Bcl-2, és növeli a fehérje szinten a p53 (ábra 4d). Hasonló eredményeket figyeltünk meg AGS sejtekben (adatokat nem köziünk).
Megbeszélés
mammalian target of rapamycin (mTOR) fedezték fel a korai 1990 s tanulmányozása hatásmechanizmusának rapamicin, amelyet eredetileg megtalálható, mint egy gombaellenes szer és később felismerték rákellenes tulajdonságokkal [27]. Mint egy Ser /Thr fehérje-kináz, az mTOR kulcsszerepet játszik a sejtszaporodás és a homeosztázis [28]. Az mTOR fehérje komplexet képez adapter fehérjék, mTORC1 (mammalian target of rapamycin komplex 1) és mTORC2. Aktiválása mTORC1 szabályozza a sejtnövekedést moduláló fehérje szintézist, riboszóma biogenezisben és autofágia [29]. A mTORC2 útvonal kulcsfontosságú szerepet játszik az aktiváló Akt, mint PDK1 (3-foszfatidil-függő protein kináz 1) és a PI3K, potenciális gyógyszer célpontja rákok, ahol van Akt dereguláció [26].
A jelenlegi vizsgálat során, azt tapasztaltuk, hogy a 93 (51,4%) betegnél pozitív kifejeződése p-mTOR 181 gyomorrákos betegek. Összhangban a következtében, egy másik vizsgálatban, beleértve a 1072 beteg, a kifejezés p-mTOR 46,5% [30].
Korábbi tanulmányok arról számoltak be, prognosztikai jelentősége p-mTOR kifejezést. Herberger munkatársai [18]. azonosított p-mTOR, hogy egy független prognosztikai tényezője halál betegek epeúti adenocarcinoma. Tanulmányukban a teljes túlélés jelentősen rövidebb volt azoknál a betegeknél, p-mTOR-pozitív daganatok betegekhez képest p-mTOR-negatív tumorok (P = 0,004). A gyomorrák, Yu és mtsai. értékelték kifejezése p-mTOR 1072 gyomorrákos betegek egy szövet microarray, bizonyítva túltermelése p-mTOR egy független prognosztikai tényező [30]. Azonban egy vizsgálatban 109 beteg gyomor adenocarcinoma, akik radikálisan gastrectomián [31], Murayama et al. talált sem citoplazmatikus p-mTOR sem nukleáris p-mTOR független prognosztikai tényező, bár azonosították citoplazmatikus p-mTOR kifejezés társult rosszabb túlélési és korrelál a mélysége tumor invázió, nyirokcsomók és a daganat stádiuma. A jelen tanulmányban azt megerősítette, hogy a PT besorolás és a nyirokcsomó státusz független prognosztikai tényező a klinikai kimenetel gyomorrákos betegek Többváltozós elemzések. Mivel azonban a legtöbb betegnél lokálisan előrehaladott betegségben, egyéb másodlagos prognosztikai markerek, különösen p-mTOR, hasznos lehet [13]. Eredményeink egyértelműen mutatják, hogy a p-mTOR kifejezés korrelál erősen gyenge teljes és betegségmentes túlélés univariable elemzéseket az a tendencia összefüggést többváltozós elemzéseket. Katalógusa Összhangban a jelenlegi vizsgálat során több tanulmány is felismerték antiproliferatív hatásai mTOR inhibitorok a gyomor rákos sejtekben. Például, Lang és munkatársai [21]. azonosították a rapamicin is gátolja a gyomor rákos sejtek növekedését mindkét szubkután tumor modell és egy kísérleti modellt. Eredményeik kiemelik az alkalmasságát mTOR inhibitorok használhatók egy antiangiogén kontextust terápia gyomorrák.
Azonban RAD001 egy új mTOR inhibitor rákellenes szer. A mechanizmus körülbelül RAD001 a gyomorrák nem világos. Čejka et al. mutatta a antiangiogén aktivitásának RAD001 kombinálva a magas dózisú ciklofoszfamid feltárta szinergikus tumorellenes aktivitást fejt gyomorrákban [32]. Azt is megállapítottuk, hogy RAD001 csökkent proliferáció és legyengített termelés HIF-1α, valamint a VEGF gyomorrák-sejtek in vitro [33]. A jelenlegi vizsgálatban, az adataink azt mutatták, hogy RAD001-terápia legyengített foszforilációja p70S6K és jelentősen gátolta a proliferációt a gyomor rákos sejtek keresztül sejtciklus és apoptózis in vitro. Találtunk RAD001 indukált a G0 /G1-fázisban történő leállást, amelyet csökkenésével jár ciklin D1 és c-myc. Sőt, azt mutatta, az első alkalom, hogy RAD001, mint egy új mTOR inhibitor dózisfüggően indukált apoptózist gyomorrák sejtek Annexin V vizsgálati eljárásokban. Ez a hatás is szerepet játszhat a celluláris hálózatokban és a későbbi cél, beleértve P53 és Bcl-2. Ezek az eredmények még jobban megmagyarázza a hatékonyságát RAD001. Katalógusa Következtetés
Összefoglalva, mi végzett szisztematikus kutatás mTOR gyomorrák, jelezve a kapcsolatok kifejezése a prognózis értéke aktivált mTOR (p-mTOR) in vivo, hatását RAD001 és az a része a mechanizmusok gyomor rákos sejtek in vitro. Eredményeink azt mutatták, hogy a p-mTOR szolgálna a potenciális biológiai marker azonosítása alcsoportja gyomorrákos betegek rossz prognózist. Azt is kimutatta, hogy RAD001 volt ígéretes szernek kezelésére gyomorrák indukáló sejtciklus és apoptózis alulszabályozza expressziójának c-myc, CyclinD1 és a Bcl-2, up-expressziójának szabályozására P53. További vizsgálatok szükségesek tisztázására szerepét az aktiválási mTOR és végül tegyen javaslatot mTOR egy konkrét cél gyomorrák terápia. Katalógusa Megjegyzés katalógusa támogatás nyújtására: Támogató Nemzeti magas technológiai kutatás és fejlesztés (863) Program Kína katalógusa Notes
Da-zhi Xu, Qi-rong Geng hozzájárult egyaránt ezt a munkát. katalógusa nyilatkozatok katalógusa Köszönetnyilvánítás katalógusa ezt a munkát támogatott National High Technology Kutatási és Fejlesztési (863) program Kína. A szerzők értékelik a kiváló technikai támogatást Li-hui Wang Fei-Meng Zheng, Zheng-zhi Zou, Yan Zhang és Zi Jie Long. Katalógusa Szerzők eredeti beküldötteknek képeket
alábbiakban a linkeket a szerzők eredeti beküldötteknek képeket. 12885_2009_2335_MOESM1_ESM.pdf A szerzők eredeti fájlt az 1. ábra szerinti 12885_2009_2335_MOESM2_ESM.pdf A szerzők eredeti fájl 2. ábrán 12885_2009_2335_MOESM3_ESM.pdf A szerzők eredeti fájl 3. ábra 12885_2009_2335_MOESM4_ESM.pdf A szerzők eredeti fájl 4. ábra Érdekütközés
A szerzők kijelentik, hogy nincs versengő érdekek. katalógusa

• A prognosztikai hatását etnikai gyomor- és nyelőcsőrák: a populáció-alapú tapasztalat British Columbia, Kanada
• Azonosítása prognosztikai faktorok és sebészeti jelzések áttétes gyomorrák