Geactiveerde zoogdieren doelwit van rapamycin is een potentieel therapeutisch doelwit bij maagkanker

Geactiveerde zoogdieren doelwit van rapamycin is een potentieel therapeutisch doelwit bij maagkanker
Abstracte achtergrond
De zoogdieren doelwit van rapamycin (mTOR) een belangrijke rol in de celgroei en homeostase speelt. Het doel van onze studie is de expressie van geactiveerde mTOR (p-mTOR) bij maagkanker patiënten, hun prognostische betekenis en de inhibitie effect van RAD001 op tumorgroei te onderzoeken en te bepalen of gerichte remming van mTOR een mogelijke therapeutische strategie zou kunnen zijn voor maagkanker.
Methods
De expressie van p-mTOR werd aangetroffen in monsters van 181 maagkanker die radicale resectie (R0) onderging door immunohistochemie. De correlatie van p-mTOR expressie clinicopathologic kenmerken en overleving van maagkanker bestudeerd. We hebben ook bepaald de remming effect van RAD001 op tumorgroei met behulp BGC823 en AGS menselijke maagkanker cellijnen.
Resultaten
Immunokleuring voor p-mTOR was positief in 93 van de 181 (51,4%) van de maag kankers, nauw gecorreleerd met lymfe Status knooppunt en pTNM podium. Patiënten met p-mTOR positieve vertoonden significant kortere ziektevrije overleving (DFS) en algehele overleving (OS) tarieven dan die met p-mTOR-negatieve tumoren in univariabele analyses, en er was een trend naar een correlatie tussen p-mTOR expressie en overleving in multivariabele analyses. RAD001 opmerkelijk remde dosisafhankelijk proliferatie van humane gastrische carcinoomcellen op-neer reguleren van expressie van p70S6K, p-p70S6K, C-myc, CyclinD1 en Bcl-2, up-reguleren van expressie van P53.
Conclusies
In maag kanker, p-mTOR is een potentieel therapeutisch doelwit en RAD001 was een veelbelovende behandeling agent met het induceren van de celcyclus en apoptose door naar beneden reguleren van expressie van C-myc, CyclinD1 en Bcl-2, up-reguleren van expressie van P53.
achtergrond
Maagcarcinoom is de vierde meest voorkomende vorm van kanker en de tweede belangrijkste oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen wereldwijd, waarvan 1 miljoen nieuwe gevallen per jaar in de hele wereld [1]. Ongeveer 60% van de nieuwe gevallen van maagkanker ontstaan ​​in Oost Azië [2], vooral in China. Chirurgische resectie is de meest effectieve behandeling van maagkanker en werkzaamheid van chemotherapie blijft beperkt [3]. Vele studies hebben aangetoond dat de diepte van invasie en het aantal metastatische lymfeknopen de belangrijkste krachtige voorspellers van overleving van maagkankerpatiënten [4, 5]. Bijvoorbeeld, in eerdere studies [6, 7], hebben we positieve lymfklier ratio een onafhankelijke prognostische indicator na D2 resectie en intraperitoneale chemotherapie kan gunstig maagkanker patiënten. Echter, een fundamentele stap naar het verbeteren van de klinische uitkomst ligt in het beter begrip van de tumor biologisch gedrag, die kunnen bijdragen tot de mogelijke targets te identificeren voor individuele therapie [8, 9].
Laatste jaren moleculair gebaseerde benaderingen voor verwerking maagkanker is gegeven grote zorg. Verscheidene artikelen zijn beschreven sommige potentiële moleculaire doelwitten voor therapie bij maagkanker, zoals epidermale groeifactorreceptor (EGFR) [10-13], vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) [14], RECEPTEUR d'origine nantais (RON) [15 ]. Ondernemingen De zoogdieren doelwit van rapamycin (mTOR) is een nieuw potentieel doelwit voor anti-kanker therapie. Zijn expressie is aangetoond in diverse cellijnen en tumormonsters, zoals lever tumoren [16], borstkanker [17], galwegen adenocarcinoom [18], en cervicale kanker [19, 20]. Deze studies toonden aan dat mTOR expressie was geassocieerd met een slechte klinische prognose. Lang et al [21]. Ook waargenomen mTOR activering in menselijke maagkanker in vitro en in vivo. Zij gaven mTOR wordt vaak geactiveerd in menselijke maagkanker. Onlangs, een oraal biobeschikbare derivaat van rapamycine, RAD001 (everolimus; Novartis Pharma AG), ontwikkeld. Een fase III studie toonde de behandeling met everolimus verlengt progressievrije overleving bij patiënten met gemetastaseerd niercelcarcinoom die op andere gerichte therapieën [22] had geboekt. RAD001 is ook aangetoond dat de proliferatie van tumorcelgroei in bepaalde carcinomen [23, 24] te remmen. Maar de rol van RAD001 bij maagkanker cel niet duidelijk. Ondernemingen De doelstellingen van dit onderzoek waren te onderzoeken welke relatie de mTOR expressie met de prognose waarde van geactiveerde mTOR (p-mTOR), het effect op de groei RAD001 en celcyclus van menselijke maagkanker cellen in vitro en bepalen of maagkanker is een goede kandidaat voor behandeling met doelwit mTOR remmers.
Methods
patiënten bestudeerd Inloggen Deze retrospectieve studie bestond uit 181 patiënten die een radicale resectie ondergaan ( R0) voor histologisch bevestigde maagcarcinoom van het Cancer Center van Sun Yat-sen Universiteit tussen januari 1997 en december 2002. Alle patiënten met histologisch bevestigd adenocarcinoom van de maag had ofwel proximale gedeeltelijke gastrectomie, distale gedeeltelijke gastrectomie of totale gastrectomie ondergaan. Ethische goedkeuring werd verkregen van Sun Yat-sen Universiteit Cancer Center onderzoek ethische commissie.
Degenen met adequate histologische materiaal en volledige klinische gegevens werden in aanmerking komen voor opname. De criteria omvatte ook histologisch bevestigde R0 resectie, die werd gedefinieerd als geen macroscopische en microscopische residuele tumor en postoperatieve overlevingstijd ≥ 6 maanden. Patiënten met metastasen op afstand en carcinoom van de maag stomp na resectie voor benigne ziekte werden uitgesloten van de studie. De reden is dat de overleving van patiënten met metastasen vaak wordt beïnvloed door vele factoren, zoals preoperatieve chemotherapie of verstopping
Alle patiënten hadden follow-up na de operatie na 6 tot 12 maanden intervallen.; de einddatum voor de follow-up was december 2008. De mediane follow-up periode was 50 (gemiddelde: 50,66; range 10-128) maanden voor alle patiënten, en 74 maanden (gemiddelde: 72,80; range 27-128) om te overleven. De mediane follow-up was 40 (gemiddelde: 43,71; range 11-125) voor patiënten met tumoren van p-mTOR positieve uitdrukking, en 60,5 maanden hadden (gemiddelde: 58.01; bereik 10-128) voor negatieve expressie. Overleving werd berekend vanaf de datum van de diagnose tot de datum van overlijden of laatste follow-up.
Specimen verzamelen en Immunokleuring voor p-mTOR Leer Alle tumor monsters werden verkregen van chirurgisch weggesneden maagkanker voor adjuvante therapie. Met formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel blokken werden bewaard bij kamertemperatuur geïdentificeerd met een identificatienummer. Vijf urn dikke coupes werden gesneden uit de paraffineblokken, paraffine ontdaan in xyleen, gerehydrateerd en. Antigene retrieval werd behandeld met natriumcitraat. De objectglaasjes werden vervolgens geïncubeerd in 0,3% H 2O 2 gedurende 10 minuten, en geblokkeerd in 1% bovien serum albumine gedurende 60 minuten gevolgd door een konijn monoklonaal antilichaam specifiek voor p-mTOR (fosfo-mTOR, Ser2448, 49F9; Cell Signaling Technology) bij 4 ° C gedurende de nacht, en daarna gekleurd met 3,3-diaminobenzidine. Na visualisatie van immunoreactiviteit werden de secties tegengekleurd met hematoxyline en vervolgens gemonteerd.
Evaluatie van immunohistochemische kleuring Ondernemingen De immuun-secties werden geëvalueerd en weefsel van menselijke prostaat adenocarcinoma diende als positieve controle. Volgens recent beschreven criteria voor de waardering mTOR expressie, werd kleuring intensiteit bepaald als 0 (afwezig), 1 (zwak) en 2 (sterk) en expressie niveaus van de biomarkers werden semiquantified met behulp van een immunohistochemie score (range, 0-200) berekende door vermenigvuldiging kleurintensiteit het percentage van positieve tumorcellen [18]. Patiënten met een immunohistochemie score van ≤ 20 werden beschouwd als p-mTOR-negatieve en mensen met een score van > 20 p-mTOR-positief. Alle objectglaasjes werden onafhankelijk beoordeeld door twee onafhankelijke pathologen zonder enige kennis van de klinische gegevens van de patiënten. Wanneer de adviezen van de twee beoordelaars verschillend waren, werd een akkoord bereikt door een zorgvuldige discussie
Cellijnen en kweekomstandigheden
Human maagkanker cellijnen BGC823 en AGS (ATCC Nummer: CRL-1739). Die slecht gedifferentieerde zijn werden geschenken van Peking University School of Oncology (Beijing, PR China.) [25]. De cellijnen werden aangehouden in RPMI 1640 medium (Invitrogen) aangevuld met 10% foetaal runderserum (Hyclone), penicilline (100 eenheden /ml) en streptomycine (100 eenheden /ml) bij 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator .
cellevensvatbaarheid assay Belgique Om het effect van RAD001 menselijke maagkanker cellen te analyseren, de cellevensvatbaarheid werd bepaald door MTT-bepaling. RAD001 werd verstrekt door Novartis Pharma (Basel, Zwitserland). Voor de levensvatbaarheid assay werden logaritmisch groeiende cellen gestimuleerd met verschillende doses RAD001 (0, 5, 10, 20 en 40 uM). Eind kweekperiode, 20 pl tetrazoliumkleurstof 3- (4,5-dimethylthiazool-2-yl) -2,5- difenyltetrazoliumbromide (MTT) oplossing (Sigma, VS) bij 0,2 mg /ml in PBS werd toegevoegd de optische dichtheid bij 490 nm (OD490) werd bepaald met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) lezer. Gemiddelde waarden werden berekend uit drievoudige kweken.
Celcyclusanalyse
Cellen werden verzameld en een nacht in 70% ethanol gefixeerd bij 4 ° C. Cellen werden vervolgens gewassen en gekleurd met propidium jodide (PI) (Sigma) 5 ug /ml. Na 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht, werden de cellen via stroom cytometrie geanalyseerd met een Becton Dickinson FACScan.
Annexine V assay
De monsters werden met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en met behulp Annexine V-fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) en PI kleuring voor de bepaling van fosfatidylserine blootstelling op het buitenste plasmamembraan. Na incubatie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht, werden de monsters gekwantificeerd met flowcytometrie met behulp van een Becton Dickinson FACScan.
Omgekeerde transcriptie-PCR
Totaal RNA werd geëxtraheerd met TRIzol methode. RNA werd omgekeerd Transcripted met behulp van een commercieel verkrijgbare kit (Fermentas, USA). Het mengsel (25 pl totaal) voor PCR bestond uit 0,5 pi cDNA, 0,5 U Taq DNA-polymerase, 2,5 pi 10 x PCR-buffer, 2,5 mM dNTP mengsel en 50 pM sense en antisense primers elk. CyclinD1 en C-myc werden geanalyseerd door volgende primers: CyclinD1 5'GAACAGAAGTGCGAGGAGGAG3 'en reverse primer 5'AGGCGGTAGTAGGACAGGAAG3; C-myc, 5 'CGAGCTGCTGGGAGGAGACAT3' en 5 'AGCCGCCCACTTTTGACA GG3' Actin. 5'GGCACCCAGCACAATGAA 3 'en 5' TAGAAGCATTTGCGGTGG 3 '
cellysaat en Western blotanalyse
Cellen werden gelyseerd in lysis buffer en de concentratie van eiwit werd bepaald door de Bradford kleurstof-methode (Bio-Rad Laboratories). Gelijke hoeveelheden celextract werd onderworpen aan SDS-PAGE en overgebracht naar PVDF-membraan (Bio-Rad). Western blot analyses werden uitgevoerd met verschillende specifieke primaire antilichamen. Antilichamen die fosfo-p70S6K (Thr389), p70S6K, fosfo-mTOR (Ser2448), Bcl-2 en p53 waren van cell signaling.
Statistische analyses
Het primaire eindpunt van deze studie was de totale overleving (OS). Werd gedefinieerd als de periode tussen het tijdstip van de operatie en de dood. Ziektevrije overleving (DFS) was de tijd tussen het moment van de operatie en recidief of tumor-gerelateerde dood. Het werd geanalyseerd als secundair eindpunt. De associatie van p-mTOR expressie met verschillende clinicalopathologic functies werd geanalyseerd met behulp van de chi-kwadraat test. Cumulatieve overleving en ziektevrije overleving werden geschat door de Kaplan-Meier-methode. De log-rank test werd gebruikt om de statistische significantie van verschillen tussen overlevingscurves evalueren. Een Cox model (achteruit, stapsgewijze) voor multivariabele analyse werd aangevraagd factoren die betekenis univariabele analyse bereikt. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van SPSS-software (versie 13 voor Windows, SPSS, Chicago, IL). Verschillen bij P < 0,05 werden beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
Clinicopathologische functies
Een totaal van 181 patiënten werden geïncludeerd in deze studie. De mediane leeftijd was 59 jaar (range, 23-83 jaar). Clinicopathologic de kenmerken van de onderzoekspopulatie zijn samengevat in tabel 1. 129 patiënten waren mannen en 52 vrouwen. 77 van 181 tumoren (42,5) waren de bovenbuik, 74 van 181 patiënten (40,9%) waren vanaf het onderste gedeelte van de maag, en de resterende tumoren werden uit het midden en het gehele lichaam van de maag. 118 van de 181 (65,2%) grootte van de tumor patiënten waren > 4 cm, en 63 (34,8%) waren ≤ 4 cm. In overeenstemming met de World Health Organization criteria, 4 van 181 tumoren (2,2%) waren goed gedifferentieerd, 55 van de 181 tumoren (30,4%) werden matig gedifferentieerd, 116 waren slecht gedifferentieerde en 6 waren ongedifferentieerde. Post-operatieve chirurgische fase werd geclassificeerd volgens de UICC 2002 /AJCC classificatie [26] .table 1 Clinicopathologische correlatie van p-mTOR expressie bij maagkanker
Factoren
Alle patiënten
No. van de patiënten (%)
P

N
= 181 (%)
mTOR negatieve
mTOR positieve

Age (y)
0,256
< 60
95 (52,5)
50 (56,8)
45 (48,4)
≥60
86 (47,5)
38 (43,2)
48 (51,6)
Sex
0,926
Man
129 (71,3)
63 (71,6)
66 (71,0)
Vrouw
52 (28,7)
25 (28,4)
27 (29,0)
Site
0,053
Upper
77 (42,5)
33 (37,5)
44 (47,3)
Midden
28 ( 15.5)
10 (11.4)
18 (19,4)
lagere
74 (40,9)
43 (48,9)
31 (33,3)
Zend Pagina 2 ( 1.1) Pagina 2 (2.3)
0 (0,0)
tumorgrootte
0,172
≤ 4 cm
63 (34,8)
35 (40,0)
28 (30.1) Restaurant > 4 cm
118 (65,2)
53 (60,0)
65 (69,9)
Borrmann soort
0,398
Vroeg stadium
7 (3,9)
6 ( 6.8)
1 (1.1)
I
4 (2.2) Pagina 2 (2.3) Pagina 2 (2.1)
II
65 (35,9)
31 ( 35.2)
34 (36,6)
III
101 (55,8)
47 (53,4)
54 (58,1)
IV
4 (2.2) Pagina 2 ( 2.3) Pagina 2 (2.1)
grading
0,999 1
4 (2.2) Pagina 2 (2.3) Pagina 2 (2.1) 2
55 (30,4)
27 (30,7)
28 (30.1)
3
116 (64,1)
56 (63,6)
60 (64,5)
4
6 (3.3)
3 (3.4)
3 (3.3)
Pathologische T classificatie
0,168
T1
17 (9.4)
12 (13,6)
5 (5.4)
T2
35 (19,3)
18 (20,5)
17 (18.3)
T3
119 (65,7)
55 (62,5)
64 (68,8)
T4
10 (5.5)
3 (3.4)
7 (7,5)
Pathologische N-status
0,008
N negatief
44 ( 24.3)
29 (33,0)
15 (16.1)
N positieve
137 (75,7)
59 (67,0)
78 (83,9)
Pathologische fase (pTNM)
0,026
I
26 (14,4)
17 (19,3)
9 (9,7)
II
47 (26.0)
28 (31,8)
19 (20,4)
III
100 (55,2)
41 (46,5)
59 (63,4)
IV
8 (4.4) Pagina 2 (2.3)
6 (6.5)
129 van de 181 patiënten (71,2%) had meer gevorderde T stadium van de ziekte (PT3 + PT4), en 137 patiënten (75,7%) hadden lymfklier metastase. Totally patiënten van stadium I-IV werden 26, 47, 100 en 8 de gevallen.
P-mTOR expressie bij maagkanker
Immunokleuring van p-mTOR was cytoplasmatische en deels membraneuze. Figuur 1 toont representatieve voorbeelden van p-mTOR immunokleuring. De normale maagslijmvlies is negatief voor p-mTOR. Van de 181 patiënten, 93 (51,4%) werden p-mTOR-positieve tumoren. Figuur 1 Voorbeelden van p-mTOR immunokleuring. (A) De normale maagslijmvlies is negatief voor p-mTOR (oorspronkelijke vergroting x 200). (B) De normale maagslijmvlies is negatief voor p-mTOR (oorspronkelijke vergroting x 400) (C) Positieve expressie van p-mTOR bij maagkanker (oorspronkelijke vergroting x 200). (D) negatieve expressie van p-mTOR bij maagkanker (oorspronkelijke vergroting x 200).
Survival analyse
Patiënten met een p-mTOR positieve maagkanker bleek significant korter ziekte-vrije en de algehele overleving dan die met p- mTOR negatieve maagkanker (DFS, 48,9% versus 30,1%; p = 0,006; OS, 51,1% versus 34,4%; p = 0,011; Tabel 2, Figuur 2A, B). Univariabele analyse bleek dat overlevingstijd daalde ook met hogere pT classificatie (DFS, p = 0,001; OS, P = 0,005), lymfeklier metastase (DFS, p < 0,0001; OS, p = 0,001) en geavanceerde pTNM fase (DFS, p < 0,001; OS, P = 0,001). Er was geen verband tussen DFS of OS en leeftijd, geslacht of tumor size.Table 2 univariabele analyse van de ziekte-vrije en de algehele overleving bij maagkanker


Ziektevrij suivival
Overall survival

Characteristic

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

Age(y)
0,343
0,583
< 60
95
1,00
1,00
≥60
86
0,834
0,573-1,214
0,898
0,611-1,320
Sex
. 662
0,950
Man
129
1,00
1,00
Female
52
0,909
0,591-1,396
0,986
0,639-1,521
tumorgrootte
0,151
0,232
≤4 cm
63
1,00
1,00
> 4 cm
118
1.345
0,897-2,016
1.287
0,851-1,945
pT stadium
0,001
0,005
pT1
17
1,00
1,00
pT2
35
1.549
0.558-4.301
.401
1.535
0.553-4.264
.411
pT3
119
3.546
1.437-8.750
.006
3.237
1.310-8.001
.011
pT4
10
4.738
1.547-14.506
.006
4.068
1.289-12.836
.017
pN stadium Restaurant < 0,0001
0,001
Negatief
44
1,00
1,00
Positieve
137
2,617
1,538-4,451
2,389
1.401- 4,075
pTNM stadium Restaurant < 0,0001
0,001
I
26
1,00
1,00
II
47
2.920
1.197-7.121
.018
2.860
1.173-6.973
.021
III
100
4.955
2.152-11.409
< 0,0001
4,455
1,930-10,281 Restaurant < 0,0001
IV
8
7,369
2,470-21,981 Restaurant < 0,0001
6,103
1,965-18,957
0,002
p-mTOR
0,008
0,013
Negatief
88
1,00
1,00
Positieve
93
1.667
1,146-2,454
1.644
1,112-2,430
Figuur 2 Kaplan-Meier schatting van de kans op overleving. Patiënten met p-mTOR positieve vertoonden significant kortere totale overleving (A) en ziektevrije overleving (B) tarieven dan die met p-mTOR negatieve expressie. (P = 0,011 en p = 0,006, respectievelijk)
In multivariabele analyse, lymfeklier metastase (DFS, p = 0,018; OS, P = 0,038). En Pt fase (DFS, p = 0,018; OS, P = 0,046) waren significante onafhankelijke prognostische factor voor overleving. Bovendien multivariabele analyse (Tabel 3) is ook een tendens naar een correlatie tussen p-mTOR expressie en verminderde overleving, maar de trend niet bereikt statistische significantie (DFS, p = 0,059; OS; p = 0,070) .table 3 Multivariate cox regressie-analyse van de ziekte-vrije en de algehele overleving


Ziekte-vrije suivival
Overall survival

Factors

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

p-mTOR
0.059
0.070
Negatief
88
1,00
1,00
Positieve
93
1,452
0,986-2,138
1.443
0,970-2,147
Infiltreren diepte
0,018
0,046
pT1
17
1,00
1,00
pT2
35
1.050
0.366-3.016
0.928
1.078
0.375-3.101
0.889
pT3
119
2.251
0.867-5.845
0.096
2.146
0.823-5.595
0.118
pT4
10
2.926
0.920-9.305
0.069
2.616
2.616-8.580
0.113
Lymph knooppunt status van
0,018
0,038
Negatief
44
1,00
1,00
Positieve
137
1,981
1,981-3,488
1,828
1,034-3,233
RAD001 proliferatie remt en voorkomt p70S6K fosforylering Belgique om de effecten van RAD001 op de proliferatie van menselijke maagkanker cellijnen BGC823 en AGS onderzoeken, voerden wij proliferatie assays met 48 uur blootstelling aan RAD001. Hierdoor RAD001 genereert significante remming op beide cellijnen een dosis-afhankelijke wijze. (Figuur 3A). Figuur 3 (A) RAD001 de proliferatie van maagkanker cellen. Maagkanker cellen werden behandeld met de aangegeven concentraties van RAD001 in aanwezigheid van 10% FBS gedurende 48 uur. Levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald door MTT assay. (B) Fosforylering van p70S6k werd significant verlaagd in een dosis-afhankelijke wijze zowel AGS en BGC823 cellen door behandeling met RAD001. Beide cellijnen werden geïncubeerd met toenemende dosis RAD001 gedurende 48 uur, werden cellysaten onderworpen aan Western blot analyse met gefosforyleerde p-S6K en S6K antilichamen.
Western blot-experimenten werden uitgevoerd met RAD001 op 0, 5, 10, 20 pM gedurende 48 uur. P70S6 kinase is een belangrijke downstream doelwit van mTOR en de mTOR-afhankelijke fosforylering laat de vertaling van ribosomale eiwitten. Onderzochten we de fosforylering status van de downstream doelwit p70S6k door immunoblotting. Zoals getoond in figuur 3B, vonden wij dat de behandeling van beide cellijnen BGC823 en AGS met RAD001 significant voorkomen fosforylering van p70S6K op een dosis-afhankelijke wijze.
RAD001 induceert G0 /G1 celcyclus en apoptose bij maagkanker cellen
om te bepalen of de onderdrukking van celproliferatie waren door G0 /G1-fase-arrest of apoptose, celcyclus verdeling werd geanalyseerd door FCM. Figuur 4 bleek dat behandeling van cellen met BGC823 RAD001 gedurende 48 uur resulteerde in een robuuste G1 arrestatie en apoptose bevorderen. Met de toenemende dosis RAD001, steeds meer cellen in de G1-fase, terwijl de voortgang van de celcyclus in de S-fase afnam (figuur 4A). RT-PCR analyse toonde RAD001 dosisafhankelijk verminderde mRNA niveau van Cycline D1 en C-myc (Figuur 4B). Figuur 4 RAD001 induceert celcyclus en apoptose in BGC823 cellen. (A) BGC823 cellen werden blootgesteld aan verschillende concentraties RAD001 gedurende 48 uur. (B) RNA werd geëxtraheerd uit cellen. Cycline D1 en C-myc expressie werden gedetecteerd met RT-PCR, actine als ladingscontrole. (C) cellen werden gedurende 48 uur met aangegeven doseringen van RAD001 vóór kleuring met annexine V-FITC. Het percentage apoptotische cellen worden weergegeven. (D) Cellen werden gedurende 48 uur met aangegeven doseringen van RAD001. Cellen werden verzameld, gelyseerd en onderworpen aan Western blot analyse met Bcl-2 en p53-antilichamen. GAPDH werd gebruikt als beladingscontrole.
Annexine-V assays toonden dat RAD001 significant geïnduceerde apoptose in BGC823 cellen. Een toename van apoptose percentage werd geanalyseerd door FCM met de toename van de dosis (Figuur 4C). Western blot analyse toonde RAD001 dosisafhankelijk verlagen van het eiwitgehalte van Bcl-2 en verhogen het eiwitniveau van p53 (figuur 4D). Vergelijkbare resultaten werden waargenomen in AGS cellen (gegevens niet getoond).
Discussie
zoogdieren doelwit van rapamycine (mTOR) werd ontdekt in de vroege jaren 1990 bestudering van het werkingsmechanisme van rapamycine, die oorspronkelijk werd gevonden als antischimmelmiddel en werd later erkend als antikanker eigenschappen [27]. Als Ser /Thr proteïne kinase, mTOR speelt een belangrijke rol in celgroei en homeostase [28]. De mTOR een complex vormt met adapter eiwitten, mTORC1 (zoogdier doel van rapamycine complex 1) en mTORC2. Activering van mTORC1 regelt celgroei door modulatie eiwitsynthese, ribosoom biogenese en autofagie [29]. De mTORC2 pathway speelt een belangrijk onderdeel van het activeren van Akt, zoals PDK1 (3-fosfoinositide afhankelijke proteïne kinase 1) en PI3K, een potentieel geneesmiddel doelwit voor kanker waarin sprake is van Akt deregulering [26].
In de huidige studie, we vonden dat 93 (51,4%) patiënten hadden positieve expressie van p-mTOR in 181 maagkankerpatiënten. In overeenstemming met onze resultaten in een andere studie met 1072 patiënten, de expressie van p-mTOR is 46,5% [30].
Eerdere studies hebben de prognostische significantie van p-mTOR expressie gerapporteerd. Herberger et al [18]. geïdentificeerd p-mTOR een onafhankelijke prognostische factor voor overlijden bij patiënten met galwegen adenocarcinoom. In hun studie, totale overleving was significant korter bij patiënten met p-mTOR-positieve tumoren in vergelijking met patiënten met p-mTOR-negatieve tumoren (P = 0,004). Bij maagkanker, Yu et al. geëvalueerd expressie van p-mTOR in 1072 maagkankerpatienten met een tissue microarray, tonen overexpressie van p-mTOR een onafhankelijke prognostische factor [30]. In een studie omvatte 109 patiënten met maag adenocarcinomen die een radicale gastrectomie [31], Murayama e.a. ondergaan. In totaal noch cytoplasmatische p-mTOR noch nucleaire p-mTOR was onafhankelijke prognostische factor, hoewel ze geïdentificeerd cytoplasmatische p-mTOR expressie werd geassocieerd met slechtere overleving en gecorreleerd met de diepte van tumorinvasie, lymfeklieren en tumor stadium. In de huidige studie hebben we bevestigd dat pT classificatie en lymfeklierstatus zijn onafhankelijke prognostische indicator van de klinische uitkomst bij maagkanker patiënten door het multivariabele analyses. Echter, omdat de meeste patiënten aanwezig met lokaal gevorderde ziekte, andere secundaire prognostische markers, in het bijzonder p-mTOR, of gebruik [13] kan zijn. Onze resultaten tonen duidelijk aan dat de p-mTOR expressie sterk gecorreleerd met slechte algemene en ziektevrije overleving in univariabele analyses met een trend in de richting van correlatie in multivariabele analyses.
In overeenstemming met onze huidige studie, hebben verschillende studies ook erkend de antiproliferatieve effecten van mTOR remmers bij maagkanker cellen. Bijvoorbeeld, Lang et al [21]. geïdentificeerd rapamycine kan maagkanker celgroei remt in zowel subcutane tumormodel en in een experimenteel model. De resultaten benadrukken de geschiktheid van mTOR remmers voor gebruik in een context antiangiogene therapie voor maagkanker.
Echter RAD001 een nieuw mTOR remmer als antikankermiddel. Het mechanisme over RAD001 bij maagkanker is niet duidelijk. Cejka et al. toonde de antiangiogene activiteit van RAD001 combinatie met een hoge dosis cyclofosfamide gebleken synergistische antitumor werking tegen maagkanker [32]. Zij hebben ook gevonden dat RAD001 verminderde proliferatie en verzwakte productie van HIF-1α en VEGF bij maagkanker cellen in vitro [33]. In de huidige studie, onze gegevens bleek dat RAD001-therapie verzwakte fosforylering van p70S6K en aanzienlijk remde de proliferatie van maagkanker cellen door celcyclus arrestatie en apoptose in vitro. We vonden RAD001 veroorzaakte de G0 /G1 fase, die werd geassocieerd met een verminderde cycline D1 en C-myc. Bovendien toonden we voor de eerste keer dat RAD001 als nieuwe mTOR remmer dosis afhankelijke geïnduceerde apoptose bij maagkanker cellen door Annexine V assays. Dit effect kan worden bepaald door de cellulaire context en benedenstroomse targets zoals P53 en Bcl-2. Deze bevindingen kunnen de effectiviteit van RAD001 nader toe te lichten.
Conclusie
Samenvattend, voerden we systematisch onderzoek mTOR bij maagkanker, met vermelding van de relaties van de expressie met de prognose voor de waarde van geactiveerde mTOR (p-mTOR) in vivo, het effect van RAD001 en het deel van mechanismen maagkanker cellen in vitro. Onze resultaten gaven aan dat p-mTOR als potentiële biologische marker om een ​​subgroep van patiënten met maagkanker slechte prognose identificeren zou dienen. Ook bleek dat RAD001 een veelbelovend middel voor de behandeling van maagkanker met induceren celcyclus en apoptose door omlaag reguleren van expressie van c-myc, CyclinD1 en Bcl-2, up-reguleren van expressie van P53. Verdere studies zijn nodig om de rol van de activering van mTOR te helderen en uiteindelijk tot mTOR voorgesteld als een concreet doel voor maagkanker therapie
notitiekaarten Grant Ondersteuning:. Ondersteund door National High Technology Research en Development (863) Program van China
Notes
Da-Zhi Xu, Qi-rong Geng eveneens bijgedragen aan dit werk.
verklaringen
Dankwoord
dit werk werd ondersteund door National High Technology Research en Development (863) Program van China. De auteurs waarderen de uitstekende technische ondersteuning van Li-Hui Wang, Fei-Meng Zheng, Zheng Zhi-Zou, Yan Zhang en Zi-jie Long.
Authors 'originele ingediende dossiers voor afbeeldingen
Hieronder staan ​​de links naar de oorspronkelijke auteurs 'ingediende dossiers voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 12885_2009_2335_MOESM2_ESM.pdf Authors' 12885_2009_2335_MOESM1_ESM.pdf Auteurs originele bestand voor figuur 2 12885_2009_2335_MOESM3_ESM.pdf Authors 'originele bestand voor figuur 3 12885_2009_2335_MOESM4_ESM.pdf Authors' originele bestand voor figuur 4 Concurrerende belangen Ondernemingen De auteurs verklaren dat zij hebben geen concurrerende belangen.

• De prognostische effect van etniciteit voor maag- en slokdarmkanker: de bevolking op basis van ervaring in British Columbia, Canada
• Identificatie van prognostische factoren en chirurgische indicaties voor gemetastaseerde maag cancer