Aktivert mammalian target of rapamycin er en potensiell terapeutisk mål i magekreft

Aktivert mammalian target of rapamycin er en potensiell terapeutisk mål i magekreft
Abstract
Bakgrunn
mammalian target of rapamycin (mTOR) spiller en sentral rolle i cellevekst og homeostase. Formålet med vår nåværende studien er å undersøke uttrykket av aktivert mTOR (p-mTOR) i magekreftpasienter, deres prognostisk betydning og hemming effekten av RAD001 på tumorvekst og for å avgjøre om målrettet hemming av mTOR kan være en potensiell terapeutisk strategi for magekreft.
Metoder
uttrykk for p-mTOR ble påvist i prøver av 181 mage kreft som gjennomgikk radikal reseksjon (R0) ved immunhistokjemi. Korrelasjonen p-mTOR uttrykk til clinicopathologic funksjoner og overlevelse av magekreft ble studert.
Vi har også bestemt hemming effekten av RAD001 på tumorvekst ved hjelp BGC823 og AGS menneskelige mage kreft cellelinjer. Resultater
Farging for p-mTOR var positiv i 93 av 181 (51,4%) mage kreft, tett korrelert med lymfe node status og pTNM scenen. Pasienter med p-mTOR positive viste signifikant kortere sykdomsfri overlevelse (DFS) og total overlevelse (OS) priser enn de med p-mTOR-negative svulster i univariable analyser, og det var en trend mot en sammenheng mellom p-mTOR uttrykk og overlevelse i multivariable analyser. RAD001 markert hemmet på en doseavhengig proliferasjon av human gastrisk karsinom celler ved å nedregulere ekspresjon av p70s6k, p-p70s6k, C-myc, CyclinD1 og Bcl-2, opp-regulerer ekspresjon av P53
. Konklusjoner
I gastrisk kreft, er p-mTOR et potensielt terapeutisk mål og RAD001 var en lovende behandlingsmiddel med indusering av cellesyklus og apoptose ved å nedregulere ekspresjon av c-myc, CyclinD1 og Bcl-2, opp-regulerer ekspresjon av P53.
bakgrunn
Gastric kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, inkludert 1 million nye tilfeller per år i hele verden [1]. Om lag 60% av nye tilfeller av magekreft forekommer i Øst-Asia [2], spesielt i Kina. Kirurgisk reseksjon er den mest effektive behandling for magekreft og effektiviteten av kjemoterapi fortsatt begrenset [3]. Mange studier har indikert at dybden av invasjon og antallet metastatiske lymfeknuter er de viktigste kraftigste prediktorene for overlevelse for magekreftpasienter [4, 5]. For eksempel, i tidligere studier [6, 7] har vi funnet positive lymfeknute-forholdet er en uavhengig prognostisk indikator etter reseksjon D2 og intraperitoneal kjemoterapi kan være fordelaktig overfor magekreftpasienter. Imidlertid er en fundamental skritt mot å forbedre klinisk resultat ligger i økt forståelse av tumoren biologisk oppførsel, som kan bidra til å identifisere mulige mål for individuell behandling [8, 9].
I de senere år, molekylært baserte tilnærminger for behandling i magekreft har fått stor bekymring. En rekke artikler har beskrevet noen potensielle molekylære mål for terapi i magekreft, slik som epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) [10-13], vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) [14], RECEPTEUR d'origine nantais (RON) [15 ].
mammalian target of rapamycin (mTOR) er en ny potensiell molekylære mål for kreftbehandling. Dets ekspresjon er blitt vist i forskjellige cellelinjer og tumorprøver, som for eksempel lever neoplasmer [16], brystkreft [17], galleveier adenokarsinom [18], og livmorhalskreft [19, 20]. Disse studiene viste at mTOR uttrykket ble assosiert med dårlig klinisk prognose. Lang et al [21]. Det er også observert mTOR-aktivering i human magekreft in vitro og in vivo. De indikerte mTOR er ofte aktivert i human magekreft. Nylig, en oralt biotilgjengelig derivat av rapamycin, RAD001 (everolimus, Novartis Pharma AG), har blitt utviklet. En fase III studie viste behandling med everolimus forlenger progresjonsfri overlevelse hos pasienter med metastatisk nyrecellekarsinom som har gått senere på andre målrettede terapier [22]. RAD001 har også vist seg å inhibere proliferasjonen av tumorcellevekst i noen karsinomer [23, 24]. Men rollen som RAD001 i magekreftcelle er ikke klart.
Formålet med denne studien var å analysere forholdet mTOR uttrykk med prognosen verdien av aktivert mTOR (p-mTOR), effekten av RAD001 på veksten og cellesyklus av menneskelige mage kreftceller in vitro og avgjør om magekreft er en god kandidat for målet behandling med mTOR-hemmere.
Metoder
pasienter studert
Denne retrospektive studien besto av 181 pasienter som gjennomgikk radikal reseksjon ( R0) for histologisk bekreftet magekreft fra Cancer Center of Sun Yat-sen-universitetet mellom januar 1997 og desember 2002. Alle pasienter med histologisk bekreftet adenokarsinom i magen hadde gjennomgått enten proksimale delvis gastrektomi, distal delvis gastrektomi eller total gastrektomi. Etisk godkjenning er innhentet fra Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center forskningsetisk komité.
De med tilstrekkelig histologisk materiale og fullstendige kliniske data ble kvalifisert for inkludering. Kriteriene også inkludert histologisk bekreftet R0 reseksjon, som ble definert som ingen makroskopisk og mikroskopisk resttumor og postoperativ overlevelsestid ≥ 6 måneder. Pasienter med fjernmetastaser og karsinom av mage stubben etter reseksjon for benign sykdom ble ekskludert fra studien. Årsaken er at overlevelse av pasienter med fjernmetastaser blir ofte påvirket av mange andre faktorer, som preoperativ kjemoterapi eller hindring
Alle pasientene hadde oppfølging etter kirurgi ved 6 til 12 måneders intervaller.; den endelige datoen for oppfølging var desember 2008. Median oppfølgingstid var 50 (gjennomsnitt: 50,66; range 10-128) måneder for alle pasienter, og 74 måneder (gjennomsnitt: 72.80, range 27-128) for å overleve. Median varighet av oppfølging var 40 (gjennomsnitt: 43.71; range 11-125) for pasienter som hadde svulster i p-mTOR positive uttrykk, og 60,5 måneder (gjennomsnitt: 58.01, range 10-128) for negative uttrykk. Overlevelse ble beregnet fra datoen for diagnose frem til dato for død eller siste oppfølging.
Prøvetaking og Farging for p-mTOR
Alle kreftprøver ble innhentet fra kirurgisk resected mage kreft før adjuvant behandling. Formalinfikserte, parafininnstøpte vevsblokker ble lagret ved romtemperatur identifisert ved et identifikasjonsnummer. Fem-mikrometer tykk vevssnitt ble kuttet fra parafinblokker, deparaffinized i xylen, og vannes ut. Antigen gjenfinning ble behandlet med natriumsitrat. Platene ble deretter inkubert i 0,3% H 2o 2 i 10 minutter, og blokkert i 1% bovint serumalbumin i 60 min etterfulgt av en kanin monoklonalt antistoff som er spesifikt for p-mTOR (fosfo-mTOR, Ser2448, 49F9, Cell Signaling Technology) ved 4 ° C over natten, og deretter farget med 3,3-diaminobenzidin. Etter visualisering av immunoreaktivitets, ble seksjonene kontra med hematoksylin og deretter montert.
Evaluering av immunhistokjemisk farging
De immun seksjonene ble evaluert og vev fra menneskelige prostata adenokarsinomer tjente som positiv kontroll. I henhold til nylig beskrevne kriterier for vurdering mTOR ekspresjon, ble fargingsintensiteten bestemt som 0 (fraværende), 1 (svak), og to (sterk) og uttrykk nivåer av biomarkører ble semiquantified ved hjelp av immuno skår (range, 0-200) beregnet ved å multiplisere fargeintensitet med prosentandelen av positive tumorceller [18]. Pasienter med immunhistokjemi score på ≤ 20 ble vurdert som p-mTOR-negative og de med en score på > 20 som p-mTOR-positive. Alle lysbildene ble uavhengig vurdert av to uavhengige patologer uten kjennskap til pasientens kliniske opplysninger. Når meningene til de to evaluatorer var annerledes, ble det oppnådd enighet ved forsiktig diskusjon
Cellelinjer og kulturforhold
menneskemagekreft cellelinjer BGC823 og AGS (ATCC Antall: CRL-1739). Som er dårlig differensiert var gaver fra Peking University School of Oncology (Beijing, Kina.) [25]. Cellelinjene ble opprettholdt i RPMI 1640-medium (Invitrogen) supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone), penicillin (100 enheter /ml) og streptomycin (100 enheter /ml) ved 37 ° C og 5% CO2 i en fuktig inkubator .
celleviabilitet analysen
å analysere effekten av RAD001 på menneskelige mage kreftceller, ble celleviabilitet bestemt ved MTT-analyse. RAD001 ble gitt av Novartis Pharma (Basel, Sveits). For levedyktigheten analysen ble logaritmisk voksende celler stimulert med forskjellige doser av RAD001 (0, 5, 10, 20 og 40 uM). Ved slutten av dyrkningsperioden, 20 ul av tetrazolium fargestoff 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5- difenyltetrazoliumbromid (MTT) (Sigma, USA) løsning ved 0,2 mg /ml i PBS ble tilsatt den optiske tetthet ved 490 nm (OD490) ble bestemt ved anvendelse av en enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) leser. Gjennomsnittsverdier ble beregnet ut fra triplikate kulturer.
Cellesyklusanalyse
Celler ble samlet opp og fiksert i 70% etanol over natten ved 4 ° C. Cellene ble deretter vasket og farget med propidiumjodid (PI) (Sigma) 5 ug /ml. Etter 30 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys, ble cellene analysert via flowcytometri ved anvendelse av en Becton Dickinson FACScan.
Annexin V-analyse
Prøvene ble vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) og ved hjelp av Annexin V-fluorescein isotiocyanat (FITC) og PI farging for bestemmelse av fosfatidylserin eksponering på den ytre plasmamembran. Etter inkubering i 30 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys, ble prøvene kvantifisert ved strømningscytometri ved å bruke en Becton Dickinson FACScan.
Revers transkripsjon-PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av TRIzol-metode. RNA ble omvendt transcripted med en kommersielt tilgjengelig kit (Fermentas, USA). Blandingen (25 pl totalt) for PCR bestod av 0,5 pl cDNA, 0,5 U Taq DNA-polymerase, 2,5 ul 10 x PCR-buffer, 2,5 mM dNTP-blanding, og 50 pM sense- og antisense-primere hver. CyclinD1 og C-myc ble analysert ved hjelp av følgende primere: CyclinD1 5'GAACAGAAGTGCGAGGAGGAG3 'og revers primer 5'AGGCGGTAGTAGGACAGGAAG3'; C-myc, 5 'CGAGCTGCTGGGAGGAGACAT3' og 5 'AGCCGCCCACTTTTGACA GG3' Actin:. 5'GGCACCCAGCACAATGAA 3 'og 5' TAGAAGCATTTGCGGTGG 3 '
Cellelysatet og Western blot-analyse
Cellene ble lysert i lyseringsbuffer, og konsentrasjonen av protein ble bestemt ved Bradford-fargemetode (Bio-Rad Laboratories). Like mengder av celleekstrakt ble underkastet SDS-PAGE og overført til PVDF-membran (Bio-Rad). Western blot analyser ble gjort med ulike spesifikke primære antistoffer. Antistoffer som gjenkjenner fosfor-p70S6K (Thr389), p70S6K, fosfor-mTOR (Ser2448), Bcl-2 og p53 var fra Cell Signaling.
Statistiske analyser
primære endepunktet for studien var total overlevelse (OS). Det ble definert som perioden mellom tidspunktet for kirurgi og død. Sykdomsfri overlevelse (DFS) var tidsrommet mellom tidspunktet for kirurgi og tilbakefall eller tumorrelaterte dødsfall. Det ble analysert som en sekundær sluttpunkt. Foreningen av p-mTOR uttrykk med ulike clinicalopathologic funksjoner ble analysert ved hjelp av chi-kvadrat test. Akkumulert overlevelse og sykdomsfri overlevelse ble anslått av Kaplan-Meier metoden. Log-rank-test ble anvendt for å evaluere den statistiske signifikans av forskjellene mellom overlevelseskurver. En Cox proporsjonal risikomodell (bakover, trinnvis) for multivariabel analyse ble brukt for faktorer som oppnådde betydning i univariable analyse. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS (versjon 13 for Windows, SPSS, Chicago, IL). Forskjeller på P < 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
. Resultater
Clinicopathologic funksjoner
Totalt 181 pasienter ble inkludert i studien. Median alder var 59 år (range, 23-83 år). De clinicopathologic karakteristikker av studiepopulasjonen er oppsummert i tabell 1. 129 pasientene var menn og 52 kvinner. 77 av 181 tumorer (42,5) var fra den øvre mage, 74 av 181 pasienter (40,9%) var fra den nedre del av magesekken, og de gjenværende tumorene var fra midten og hele kroppen av magen. 118 av 181 (65,2%) pasienter tumorstørrelse var > 4 cm, og 63 (34,8%) var ≤ 4 cm. I henhold til Verdens helseorganisasjon kriterier, 4 av 181 svulster (2,2%) var godt differensiert, 55 av 181 svulster (30,4%) ble moderat differensierte, 116 var dårlig differensiert, og 6 var udifferensiert. Postoperativ kirurgisk stadium ble klassifisert i henhold til 2002 UICC /AJCC klassifisering [26] .table en Clinicopathologic korrelasjon p-mTOR uttrykk i magekreft
Factors
Alle pasienter
No. av pasientene (%)
P

N
= 181 (%)
mTOR negativ
mTOR positiv

Age (y)
0,256
< 60
95 (52,5)
50 (56.8)
45 (48,4)
≥60
86 (47,5)
38 (43,2)
48 (51,6)
Sex
0,926
Mann fra 129 (71,3)
63 (71,6)
66 (71,0)
Kvinne
52 (28,7)
25 (28,4)
27 (29,0)
Site
0,053
Øvre
77 (42,5)
33 (37,5)
44 (47,3)
Middle
28 ( 15.5)
10 (11,4)
18 (19,4)
lavere
74 (40,9)
43 (48,9)
31 (33,3)
Diffuse
2 ( 1.1)
2 (2,3)
0 (0,0)
Tumor størrelse
.172
≤ 4 cm
63 (34,8)
35 (40,0)
28 (30.1)
> 4 cm
118 (65,2)
53 (60,0)
65 (69,9)
Borrmann typen
0,398
Tidlig stadium
7 (3,9)
6 ( 6.8)
1 (1,1)
I
4 (2,2)
2 (2,3)
2 (2,1)
II
65 (35,9)
31 ( 35.2)
34 (36,6)
III
101 (55,8)
47 (53,4)
54 (58,1)
IV
4 (2,2)
2 ( 2.3)
2 (2,1)
gradering
0,999
1 4 (2,2)
2 (2,3)
2 (2,1)
2
55 (30,4)
27 (30,7)
28 (30,1)
3
116 (64,1)
56 (63,6)
60 (64,5)
4
6 (3,3)
3 (3,4)
3 (3,3)
Pathologic T klassifisering
0,168
T1
17 (9,4)
12 (13,6)
5 (5,4)
T2
35 (19,3)
18 (20,5)
17 (18,3)
T3
119 (65,7)
55 (62,5)
64 (68,8)
T4
10 (5,5)
3 (3,4)
7 (7,5)
Pathologic N status
0,008
N negativ
44 ( 24,3)
29 (33,0)
15 (16,1)
N positiv
137 (75,7)
59 (67,0)
78 (83,9)
Pathologic scenen (pTNM)
0,026
jeg
26 (14,4)
17 (19,3)
9 (9,7)
II
47 (26,0)
28 (31,8)
19 (20,4)
III
100 (55,2)
41 (46,5)
59 (63,4)
IV
8 (4.4)
2 (2,3)
6 (6,5)
129 av 181 pasienter (71,2%) hadde mer avansert T stadium sykdommen (PT3 + PT4), og 137 pasienter (75,7%) hadde lymfeknutemetastase. Helt pasienter med stadium I-IV var 26, 47, 100 og 8 tilfeller, henholdsvis.
P-mTOR uttrykk i magekreft
Farging av p-mTOR var cytoplasmatic og delvis membran. Figur 1 viser representative eksempler på p-mTOR farging. Den normale mageslimhinnen er negativ for p-mTOR. Av de 181 pasientene, 93 (51,4%) var p-mTOR-positive svulster. Figur 1 Eksempler på p-mTOR farging. (A) Den normale gastriske slimhinne er negativ for p-mTOR (opprinnelig forstørrelse x 200). (B) Den normale gastriske slimhinne er negativ for p-mTOR (opprinnelig forstørrelse x 400) (C) Positiv ekspresjon av p-mTOR i magekreft (opprinnelig forstørrelse x 200). (D) negative uttrykk for p-mTOR i magekreft (original forstørrelse × 200).
Survival analyse
Pasienter med p-mTOR positive magekreft viste signifikant kortere sykdomsfrie og samlet overlevelse enn de med p- mTOR negativ magekreft (DFS, 48,9% versus 30,1%, p = 0,006, OS, 51,1% versus 34,4%, p = 0,011, Tabell 2, Figur 2A, B). Univariable analyse viste at overlevelsestiden også redusert med høyere pT klassifisering (DFS, p = 0,001, OS, P = 0,005), lymfeknutemetastase (DFS, p < 0,0001, OS, P = 0,001) og avansert pTNM stadium (DFS, p < 0,001, OS, P = 0,001). Det var ingen sammenheng mellom DFS eller OS og alder, kjønn eller svulst size.Table 2 Univariable analyse av sykdomsfri og total overlevelse i magekreft


Sykdomsfri suivival
Totalt survival

Characteristic

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

Age(y)
0,343
0,583
< 60
95
1.00
1.00
≥60
86
0,834
0,573 til 1,214
0,898
0,611 til 1,320
Sex
. 662
0,950
Mann fra 129
1.00
1.00
Kvinne
52
0.909
0,591 til 1,396
0,986
0,639 til 1,521
Tumor størrelse
0,151
0,232
≤4 cm
63
1.00
1.00
> 4 cm
118
1,345
0,897 til 2,016
1,287
0,851 til 1,945
pT scenen
0,001
0,005
PT1
17
1,00
1.00
pT2
35
1.549
0.558-4.301
.401
1.535
0.553-4.264
.411
pT3
119
3.546
1.437-8.750
.006
3.237
1.310-8.001
.011
pT4
10
4.738
1.547-14.506
.006
4.068
1.289-12.836
.017
pN stadium
< 0,0001
0,001
Negativ
44
1.00
1.00
Positive
137
2,617
1,538 til 4,451
2,389
1.401- 4,075
pTNM scenen
< 0,0001
0,001
jeg
26
1.00
1.00
II
47
2.920
1.197-7.121
.018
2.860
1.173-6.973
.021
III
100
4.955
2.152-11.409
< 0,0001
4,455
1,930 til 10,281
< 0,0001
IV
8
7,369
2,470 til 21,981
< 0,0001
6,103
1,965 til 18,957
0,002
p-mTOR
0,008
0,013
Negativ
88
1.00
1,00
Positive
93
1,667
1,146 til 2,454
1,644
1,112 til 2,430
Figur 2 Kaplan-Meier-estimatene for sannsynligheten for å overleve. Pasienter med p-mTOR positive viste signifikant kortere total overlevelse (A) og sykdomsfri overlevelse (B) priser enn de med p-mTOR negative uttrykk. (P = 0,011 og p = 0,006, henholdsvis)
I multivariat analyse, lymfeknutemetastase (DFS, p = 0,018, OS, P = 0,038). Og PT scenen (DFS, p = 0,018; OS, P = 0,046) var signifikant uavhengig prognostisk faktor for overlevelse. I tillegg multivariat analyse (tabell 3) indikerte også en trend mot en sammenheng mellom p-mTOR uttrykk og redusert overlevelse, men trenden nådde ikke statistisk signifikans (DFS, p = 0,059, OS, P = 0,070) .table 3 multivariabel cox regresjonsanalyse av sykdom og total overlevelse


Sykdomsfri suivival
Totalt survival

Factors

No.

HR

95%CI

p

HR

95%CI

p

p-mTOR
0,059
0,070
Negativ
88
1.00
1.00
Positive
93
1,452
0,986 til 2,138
1,443
0,970 til 2,147
infiltrere dybde
0,018
0,046
PT1
17
1.00
1.00
pT2
35
1.050
0.366-3.016
0.928
1.078
0.375-3.101
0.889
pT3
119
2.251
0.867-5.845
0.096
2.146
0.823-5.595
0.118
pT4
10
2.926
0.920-9.305
0.069
2.616
2.616-8.580
0.113
Lymph node status
0,018
0,038
Negativ
44
1.00
1.00
Positive
137
1,981
1,981 til 3,488
1,828
1,034 til 3,233
RAD001 hemmer spredning og forhindrer p70S6K fosforylering
å undersøke effektene av RAD001 på proliferasjonen av humane mage kreft cellelinjer BGC823 og AGS, utførte vi spredningsanalyser med 48-timers eksponering for RAD001. Som et resultat genererer RAD001 signifikant inhibering på begge cellelinjer i en doseavhengig måte. (Figur 3A). Figur 3 (A) RAD001 inhiberer proliferasjon av magekreftceller. Gastrisk kreft celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av RAD001 i nærvær av 10% FBS i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble bedømt ved MTT-analyse. (B) Fosforylering av p70s6K ble signifikant redusert på en doseavhengig måte i både AGS og BGC823 celler ved behandling med RAD001. Begge cellelinjer ble inkubert med økende dose av RAD001 i 48 timer, ble cellelysater underkastet Western blot-analyse med fosforylerte p-S6K og S6K antistoffer.
Western blot eksperimenter ble utført med RAD001 på 0, 5, 10, 20 pM i 48 timer. P70s6 kinase er en viktig nedstrøms mål av mTOR og dens mTOR-avhengig fosforylering tillater oversettelse av ribosomale proteiner. Vi undersøkte fosforylering status for nedstrøms mål p70s6K av immunoblotting. Som vist i figur 3B, fant vi at behandling av begge cellelinjer BGC823 og AGS med RAD001 betydelig hindre fosforylering av p70s6K på en doseavhengig måte.
RAD001 induserer G0 /G1 cellesyklus og apoptose i magekreftceller
for å finne ut om undertrykkelse i celleproliferasjon skyldtes G0 /G1-fasen arrest eller apoptose, cellesyklus distribusjon ble analysert ved FCM. Figur 4 viser at behandling av BGC823 celler med RAD001 i 48 timer resulterte i en robust G1 arrest og fremmet apoptose. Med den økende dose av RAD001, forble flere og flere celler i G1-fase, mens cellesyklusprogresjon inn i S-fasen ble nedad (figur 4A). RT-PCR-analyse avslørte RAD001 doseavhengig redusert mRNA nivå av Cyclin D1 og C-myc (figur 4B). Figur 4 RAD001 induserer cellesyklus og apoptose i BGC823 celler. (A) BGC823 celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av RAD001 i 48 timer. (B) RNA ble ekstrahert fra cellene. Cyklin D1 og C-myc ekspresjonen nivå ble påvist ved RT-PCR, actin som en lasting kontroll. (C) celler ble inkubert i 48 timer med angitte doser av RAD001 før farging med annexin V-FITC. Prosentandelene av apoptotiske celler er vist. (D) Cellene ble inkubert i 48 timer med angitte doser av RAD001. Celler ble samlet opp, lysert og utsatt for Western blot-analyse med Bcl-2 og p53-antistoffer. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting.
Annexin V-analysene viste at RAD001 signifikant induserte apoptose i BGC823 celler. En økning i apoptose hastigheten ble analysert ved FCM med økningen av dosen (figur 4C). Western blot analyse viste RAD001 doseavhengig reduksjon av proteinnivået av Bcl-2 og øke proteinnivået av p53 (figur 4D). Lignende resultater ble observert i AGS celler (data ikke vist).
Diskusjon
mammalian target of rapamycin (mTOR) ble oppdaget på begynnelsen av 1990 tallet i å studere virkningsmekanismen til rapamycin, som opprinnelig ble funnet som en soppdrepende middel og ble senere anerkjent som kreft egenskaper [27]. Som Ser /Thr protein kinase, spiller mTOR en nøkkelrolle i mobilnettet vekst og homeostase [28]. Den mTOR protein danner et kompleks med adapter proteiner, mTORC1 (mammalian target of rapamycin kompleks 1) og mTORC2. Aktivering av mTORC1 regulerer cellevekst ved modulering av proteinsyntese, ribosom biogenese og autofagi [29]. Den mTORC2 svei spiller en viktig del av aktivering Akt, som PDK1 (3-phosphoinositide-avhengig proteinkinase 1) og PI3K, et potensielt medikament mål for kreft hvor det er Akt deregulering [26].
I denne studien vi observert at 93 (51,4%) av pasientene hadde positive uttrykk for p-mTOR i 181 mage kreftpasienter. I samsvar med våre resultat, i en annen studie med 1072 pasienter, uttrykket av p-mTOR er 46,5% [30].
Tidligere studier har rapportert den prognostiske betydningen av p-mTOR uttrykk. Herberger et al [18]. identifisert p-mTOR å være en uavhengig prognostisk faktor for død hos pasienter med galleveier adenokarsinom. I sin studie, var total overlevelse signifikant kortere hos pasienter med p-mTOR-positive tumorer sammenlignet med pasienter med p-mTOR-negative tumorer (P = 0,004). I magekreft, Yu et al. evaluert uttrykk for p-mTOR i 1072 magekreftpasienter ved hjelp av en vev microarray, viser overekspresjon av p-mTOR var en uavhengig prognostisk faktor [30]. Men i en studie inkluderte 109 pasienter med mage adenokarsinomer som gjennomgikk en radikal gastrektomi [31], Murayama et al. funnet hverken cytoplasmatiske p-mTOR eller kjernefysisk p-mTOR var uavhengig prognostisk faktor, selv om de identifiserte cytoplasmisk p-mTOR-ekspresjon var assosiert med dårligere overlevelsen og korrelert med dybden av tumorinvasjon, lymfeknuter og tumorstadiet. I denne studien fikk vi bekreftet at pT klassifisering og lymfeknute status er uavhengig prognostisk indikator på klinisk utfall i mage kreftpasienter med multivariable analyser. Men fordi de fleste pasientene stede med lokalavansert sykdom, andre sekundære prognostiske markører, spesielt p-mTOR, kan være til nytte [13]. Våre resultater viser tydelig at p-mTOR uttrykk er korrelert sterkt med dårlig samlet og sykdomsfri overlevelse i univariable analyser med en trend mot korrelasjon i multivariable analysene.
I samsvar med vår nåværende studie, har flere studier også anerkjent antiproliferative effekter av mTOR-hemmere i mage kreftceller. For eksempel Lang et al [21]. identifisert rapamycin kunne hemme magekreft cellevekst i både en subkutan tumor modell, og i en eksperimentell modell. Deres resultater markere egnetheten av mTOR-inhibitorer som skal brukes i en antiangiogen sammenheng for behandling av magekreft.
Er imidlertid RAD001 en ny mTOR-inhibitor som anticancer-middel. Mekanismen om RAD001 i magekreft er ikke klart. Cejka et al. viste den antiangiogene aktivitet av RAD001 kombinert med en høy dose av cyklofosfamid viste synergistisk antitumoraktivitet mot magekreft [32]. De har også funnet at RAD001 redusert proliferasjon og dempet produksjon av HIF-1α samt VEGF i magekreftceller in vitro [33]. I denne studien, våre data viste at RAD001-terapi svekket fosforylering av p70S6K og markert hemmet spredning av magekreftceller gjennom cellesyklus og apoptose in vitro. Vi fant RAD001 indusert G0 /G1 fase arrest, som ble assosiert med redusert cyclin D1 og C-myc. Videre viste vi for første gang at RAD001 som en ny mTOR-inhibitor doseavhengig måte induserte apoptose i magecancerceller ved Annexin V-analyser. Denne effekten kan være diktert av den cellulære sammenheng og nedstrøms mål inkludert P53 og Bcl-2. Disse funnene kan videre forklare effekten av RAD001.
Konklusjon
Oppsummert vi gjennomført systematisk forskning for å mTOR i magekreft, noe som indikerer forholdet uttrykket med prognosen verdien av aktivert mTOR (p-mTOR) in vivo, virkningen av RAD001 og den del av mekanismer i magekreftceller in vitro. Våre funn indikerer at p-mTOR ville tjene som en potensiell biologisk markør for å identifisere en undergruppe av magekreftpasienter med dårlig prognose. Det viste også at RAD001 var et lovende middel for behandling av magekreft med indusering av cellesyklus og apoptose ved å nedregulere ekspresjon av c-myc, CyclinD1 og Bcl-2, opp-regulerer ekspresjon av P53. Videre studier er nødvendig for å belyse rollen til aktivering av mTOR og slutt å foreslå mTOR som et konkret mål for magekreft terapi
Merk
Grant Support:. Støttet av National High Technology Research and Development (863) Program Kina
Merknader Webshop-zhi Xu Qi-Rong Geng bidratt likt til dette arbeidet
Erklæringer
Takk.
dette arbeidet ble støttet av National High Technology Research and Development (863) Program Kina. Forfatterne setter pris på god teknisk assistanse av Li Hui Wang, Fei-Meng Zheng, Zheng Zhi Zou Yan Zhang og Zi-Jie Long.
Forfattere 'originale innsendte filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes originale legges filer for bilder. 12885_2009_2335_MOESM1_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 1 12885_2009_2335_MOESM2_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 2 12885_2009_2335_MOESM3_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 3 12885_2009_2335_MOESM4_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 4 Konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende interesser.

• Den prognostiske effekten av etnisitet for mage og spiserørskreft: befolkningen basert erfaring i British Columbia, Canada
• Identifikasjon av prognostiske faktorer og kirurgiske indikasjoner for metastatisk adenokarsinom cancer