Prognostický význam detekcie životaschopné cirkulujúcich nádorových buniek u pacientov s rakovinou žalúdka pomocou telomerázy špecifické vírusovej agent: prospektívnej štúdie

Prognostický význam detekcie životaschopné cirkulujúcich nádorových buniek u pacientov s rakovinou žalúdka pomocou telomerázy špecifické vírusovej agent: prospektívnej štúdie
abstraktné
pozadia
identifikáciu cirkulujúcich nádorových buniek (CTC) v periférnej krvi je užitočným prístupom odhadnúť prognózu, sledovanie progresie ochorenia, a merať účinky liečby v rôznych nádorových ochorení. Avšak klinický význam CTC je sporný. Pokúsili sme sa zistiť životaschopné CTC v periférnej krvi pacientov s karcinómom žalúdka pomocou telomerasové špecifické vírusové činidlo.
Metódy
sme sa 7,5 ml vzorky krvi 65 pacientov s rakovinou žalúdka liečených negatívny pred chirurgickým zákrokom a 10 zdravých dobrovoľníkov. Zistili sme životaschopné CTC vo vzorkách krvi po ich inkubácii s telomerázy špecifické, replikácie selektívne, onkolytického adenovirové zástupcom, ktorý vykonáva zelený fluorescenčný proteín (GFP) gén (OBP-401). GFP-pozitívnych CTC boli definované ako majúce priemer aspoň 7.735 um; táto hranica bola stanovená prijímačom prevádzkové charakteristiky analýzy krivky. GFP-pozitívne bunky boli spočítané pod fluorescenčným mikroskopom.
Výsledky
tu významný rozdiel v celkovom prežívaní medzi pacientmi s 0-4 a tie s ≥5 GFP-pozitívnych CTC v štádiu I-IV v skupine ochorení a fázy II-IV skupina pokročilým ochorením. Celkový počet GFP-pozitívnych CTC nebol príbuzný fáze rakoviny. Medzi patologické nálezy, počet GFP-pozitívnych CTC ešte len významne súvisí s žilovej invázii, aj keď boli tendencia k viac GFP-pozitívnych CTC s progresiou ochorenia (hĺbky nádoru, lymfatických uzlín, vzdialené metastázy, lymfatickú inváziu a histologický typ
). Závery
Tam bol významný vzťah medzi počtom GFP-pozitívnych CTC a celkové prežívanie u pacientov s rakovinou žalúdka. Detekcia CTC s použitím OBP-401 môže byť užitočné pre prognostický vyhodnotenie.
Registrácia Trial
University Hospital Medical informačnú sieť v Japonsku, UMIN000002018.
Kľúčové
Cirkulujúce nádorové bunky žalúdočné rakovina Telomerase pozadia
vzdialenej metastázy pevného nádoru je silný prognostický faktor [1-3]. Existencia cirkulujúcich nádorových buniek (CTC) v periférnej krvi nasvedčuje tomu, že pacient je vo fáze systémové ochorenie [4]. Identifikácia CTC v periférnej krvi je užitočným prístupom pre odhad prognózy, sledovanie progresie ochorenia, a merať účinky liečby v prsníku, prostaty, kože, hrubého čreva a gastrointestinálnych malignít. Z tohto dôvodu boli vyvinuté rôzne metódy pre detekciu CTC, a sú občas používajú v kombinácii. Bežné techniky pre obohatenie a detekcia CTC s gradientom hustoty separačné [5], priamy obohatenie filtráciou [6, 7], imunomagnetická oddeľovanie [8], prietoková cytometria [9], v reálnom čase, reverznej transkriptázy polymerázovej reťazovej reakcie (RT PCR) [10, 11], a mikročip technológie [12].
Cell obohacovanie separáciou gradientu hustoty sa vykonáva za použitia komerčných kitov, ako je OncoQuick® (Greiner, Frickenhausen, Nemecko) [13] a Lymphoprep® (Nycomed, Oslo , Nórsko) [14]. gradientu hustoty separácie je založená na teórii, že rôzne typy buniek môžu byť rozdelené podľa ich hustoty. Z tohto dôvodu je ťažké získať všetky CTC kvôli migráciu buniek. RT-PCR je jednou z najbežnejších metód detekcie nádorových buniek z dôvodu jeho vysokej citlivosti a špecifickosti, za predpokladu, že zodpovedajúce primeru a konštrukciu sondy. Avšak, falošne pozitívne výsledky môžu byť z dôvodu jeho technickej jemnosťou a vysokou citlivosťou [15, 16].
Imunomagnetická obohatenie buniek, ako je, že vykonáva CellSearch System® (Veridex, LLC, Raritan, NJ, USA) [ ,,,0],17], je v súčasnej dobe najčastejšie používa metóda k obohateniu a detekciu CTC [18-21]. Výhodou separácie imunomagnetické buniek je to, že CTC možno vizualizovať s fluorescenčným mikroskopom. Bunky detekované s protilátkami proti epitelu markerov (epiteliálnych bunkových adhéznych molekúl; EpCAMs) sú rozhodnutí byť CTC. Preto je táto technika môže poskytovať falošne pozitívne výsledky na základe normálne epitelové markerov expresie nenádorových buniek, a falošne negatívne výsledky môžu vzniknúť na základe nedostatku expresie selektívneho markeru na nádorových bunkách. V dôsledku obmedzení spojených s vyššie uvedenými postupmi, je potrebná nová technika pre detekciu životaschopné CTC presne.
Telomerázy hrá dôležitú úlohu v karcinogenéze, rakovina inváziu a metastázy [22-24]. Sme vyvinuli techniku ​​využívať vysokú telomerasovou aktivitu v bunkách. Táto technika používa telomerasové špecifické, replikačná selektívne modifikovaný vírusový prostriedok (OBP-401, TelomeScan®, Oncolys BioPharma, Tokyo, Japan), v ktorom ľudské Telomerase reverznej transkriptázy (TERT
) promótor génu sa vloží do oblasti E1 a zelený fluorescenčný proteín (GFP), gén je pod kontrolou promótorom cytomegalovírusu v oblasti E3 ako marker vírusovej replikácie [25]. Bolo oznámené, že OBP-401 môže byť použitá na detekciu životaschopných CTC medzi normálnou krvné bunky [26, 27].
Tu sme aplikovali testu k detekcii životaschopných CTC s potenciálom pre metastáz u pacientov s rakovinou žalúdka. Zistili sme, GFP-pozitívnych CTC. Na rozdiel od toho je možné, že non-rakovinové bunky vysielajú GFP fluorescencie po infekcii OBP-401 [28]. Preto sme vybrali bunky väčšie ako je prahová hodnota stanovená porovnaním medzi zdravých dobrovoľníkov a pacientov, pretože CTC sú väčšie ako normálne krvné bunky [7, 29, 30]. . Študovali sme asociáciu GFP-pozitívnych CTC číslo s prežitím a patologických indexov progresie
Metódy
pacientov au zdravých dobrovoľníkov
Pacienti zaradení do tejto predbežnej štúdii boli pacientov podstupujúcich plánovanou chirurgickú liečbu; Pacienti, ktorí boli vhodné pre endoskopické slizničnej resekcie alebo endoskopickou podslizničním pitve boli vylúčené. Kritériá pre zaradenie sú: (i) histologicky preukázané adenokarcinóm žalúdka endoskopické biopsiu; (Ii) klinické osamelý nádor; (Iii) bez predchádzajúcej endoskopické resekcia, chemoterapia, rádioterapia alebo; (Iv) vo veku 20 až 80 rokov; (V) performance status Eastern Cooperative Oncology Group [31] 0 alebo 1; (Vi) dostatočné orgánové funkcie; a (vii) písomný informovaný súhlas. Vylučovacích kritérií, boli: (i) synchrónny alebo metachronní zhubný nádor; (Ii) tehotné alebo dojčiace ženy; (Iii) aktívny alebo chronickú vírusovú hepatitídu; (Iv) aktívny bakteriálne alebo plesňové infekcie; (V) diabetes mellitus; (Vi) systémové podávanie kortikosteroidov; a (vii) nestabilná hypertenzia. Štádium ochorenia pacientov bola patologicky vyznačuje použitím siedme vydanie TNM klasifikácie Medzinárodnej únie proti rakovine [32]. Hĺbka nádoru u troch pacientov bez gastrektómii a regionálne status uzlín piatich pacientov bez dostatočného lymfadenektómia bola diagnostikovaná chirurgicky.
Všetci pacienti našej nemocnici pravidelne zúčastňuje po operácii, a kontrolovali sa každé 3 mesiace. Pacienti tiež podstúpili endoskopiu a počítačovej tomografie aspoň raz za rok, v závislosti na ich stupni a priebehu ochorenia.
Sme tiež adoptívne zdravých dobrovoľníkov pôsobiť ako kontroly. Všetky zdravých dobrovoľníkov boli zamestnanci Sysmex Corporation a zahŕňala sedem mužov (priemerný vek 31,4 rokov, rozsah 24-39 rokov) a tri ženy (priemerný vek 33,7 rokov, rozmedzie 26-48 rokov). Všetci dobrovoľníci podstúpili lekárske prehliadky upon zamestnania a ročne; check-ups súčasťou lekárskej rozhovory, počúvanie, RTG hrudníka a krv a moč analýz. Ďalej sme vykonali individuálne rozhovory pred odberom vzorky; Každý dobrovoľník, ktorý bol dočasne lekárskym ošetrením, tehotné alebo dojčiace, alebo ktorí darovali krv v uplynulom mesiaci bol vylúčený.
Vírus
OBP-401, je telomeráza špecifické replikácie selektívne adenovirový prostriedok, v ktorom TERT
promotorový element riadi expresiu génov
EIA a EIB
, a do ktorého sa gén GFP je integrovaný, bol použitý v tejto štúdii. Senzitivita a špecificita testu za použitia OBP-401 boli už skôr študované Kim et al. [27]. Test bol opakovaný päťkrát testovanie vo vzorke, vrátane 1, MDA-MB-468 (bunky karcinómu prsníka) a 7,5 ml krvi, a počet GFP-pozitívnych buniek bolo 1, 1, 1, 2 a 3; vo vzorke, vrátane 20 MDA-MB-468 (bunky karcinómu prsníka), počty GFP-pozitívnych buniek bol 15, 17, 19, 22 a 24. Vírusové vzorky boli skladované pri -80 ° C.
bunkových línií a kultúra
A549 (karcinóm pľúc), HepG2 (hepatocelulárny karcinóm), bunkové línie HEC-1 (endometria adenokarcinóm), KATO-III (rakovina žalúdka), a SBC-3 (malobunkový karcinóm pľúc) boli získané zo zdravotníctva Science Research Resources Bank (Osaka, Japonsko). LNCaP (adenokarcinóm prostaty) a OVCAR-3 (ovariálny karcinóm) bunkové línie boli získané z bunkovej banky Riken (Tokyo, Japonsko). Bunky boli kultivované v súlade so špecifikáciami dodávateľa. MDA-MB-468 bunky boli kultivované ako bolo opísané skôr [27].
Príprava vzoriek a buniek počítaním
7,5 ml vzorky periférnej žilovej krvi boli získané od každého pacienta pred operáciou a z každého dobrovoľníka. Vzorky boli spracované do skúmaviek, ktoré obsahujú kyselinu citrónovú, kyselinu fosforečnú, a dextrózu, a skladovať pri teplote 4 ° C. Skúška sa začala v priebehu 48 hodín.
Vzorky boli centrifugovány po dobu 5 minút pri 540 g a plazma fáza bola odstránená. Bunky potom boli premyté štyrikrát s fyziologickým roztokom pufrovaným fosfáty (PBS) a dvakrát sa Roswell Park Memoriál Institute médiá. Vzorky boli infikované 4 x 10 8 plak tvoriacich jednotiek (PFU) na OBP-401 vírusov inkubáciou v médiu po dobu 24 hodín pri teplote 37 ° C. Potom, čo
farbenie mŕtvych buniek po červenej fluorescenčné reaktívne farbivá L23102 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA), OBP-401 boli inaktivované vírusy a bunky boli fixované 2% paraformaldehydom (PFA) po dobu 20 minút pri teplote miestnosti.
vzorky boli ošetrené povrchovo aktívne prostriedok (Emalgen 2025 G; Kao Chemicals, Tokyo, Japan) počas 10 minút pri teplote 40 ° C, aby sa rozkladať červených krviniek. A konečne, 7,5 ml krvi bolo použité na vytvorenie dvoch vzoriek sklíčko pre mikroskopické analýze. Všetky GFP-pozitívne bunky na dve snímky boli počítané s použitím počítačom riadený fluorescenčného mikroskopu (IX71, Olympus, Tokyo, Japonsko) a skúšajúci nepoznali vzorky detaily. Celková doba testu bola 27,5 h (obrázok 1). Obrázok 1 Protokol a metódy "GFP-CTC testu". Každá 7,5 ml vzorky periférnej žilovej krv bola získaná od pacientov pred operáciou a od dobrovoľníkov. Vzorky boli spracované do skúmaviek, ktoré obsahujú kyselinu citrónovú, kyselinu fosforečnú a dextrózu. Vzorky boli odstredené a plazma fáza bola odstránená. Po premytí buniek pomocou PBS a Roswell Park Memoriál Institute médium, vzorky boli infikované s 4 x 108 PFU OBP-401 vírusu. vírus OBP-401 bol inaktivovaný a bunky boli fixované 2% paraformaldehydom (PFA). Tieto vzorky boli ošetrené povrchovo aktívneho činidla k degradácii červené a biele krvinky. Dve vzorky sklíčko z 7,5 ml krvi boli pripravené pre mikroskopické analýze. Všetky GFP-pozitívnych buniek na dve snímky boli počítané s použitím počítačom riadené fluorescenčného mikroskopu.
Stanovenie prahové hodnoty intenzity fluorescencie GFP
Prah pre intenzitu fluorescencie GFP bola stanovená nasledujúcim spôsobom. Približne 30000 kultivované bunky boli pridané do 7,5 ml vzoriek krvi od zdravých dobrovoľníkov, ktoré boli pridané rôzne nádorových bunkových línií: A549, HepG2, HEC-1, KATO-III, SBC-3, LNCaP, MDA-MB-MB468 a OVCAR -3. Krvné vzorky boli podrobené testu detekcie CTC, a potom detekovateľné bunky boli počítané pomocou fluorescenčnej mikroskopie. Viac ako 100 buniek boli analyzované v každej vzorke. Zistili sme, 2,85 x 10 7 znamená ekvivalentná fluorochrómy byť prahová hodnota pre intenzitu GFP signálu od minimálnej úrovne intenzity GFP pozorované v krvi vzorky s prídavkom bunkové línie (obrázok 2). Údaje sú uvedené ako počet GFP-pozitívnych CTC za 7,5 ml vzorky periférnej krvi. Obrázok intenzity signálu 2 GFP z rôznych nádorových bunkových línií. Spodnej a hornej časti skrine sú horné a dolné kvartil, a kapela z krabice je medián. Čiary na konci fúzy sú minimálne a maximálne. Os y predstavuje GFP intenzity signálu na stupnici log
imunologické
fykoerytrín značený anti-humánne CD45 protilátky (BioLegend, San Diego, CA, USA) bol zriedený 1: 5. A Pacific Blue-značený anti-ľudský CD326 (EpCAM) protilátky (BioLegend) sa zriedi v pomere 1:10 v PBS obsahujúcom 2% fetálne hovädzie sérum. Bunky boli inkubované s protilátkami zriedenými počas 30 minút pri teplote 25 ° C. Po premytí s PBS obsahujúcom 2% fetálne hovädzie sérum, bunky boli umiestnené na sklíčka a analyzované pomocou fluorescenčného mikroskopu. (IX71, Olympus)
Štatistická analýza
Štatistická analýza bola vykonaná pomocou JMP štatistický objav 9.0.2 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Pre stanovenie prahovej hodnoty priemernej bunky, detekovanej GFP-pozitívnych CTC boli analyzované za použitia prijímača prevádzková charakteristika (ROC) medzi vzorkami od pacientov s karcinómom žalúdka, a tými z dobrovoľníkov. Pre viacnásobné porovnávania skupín, homogenita rozptylu bola hodnotená testom Levente. Pre parametrické porovnanie sme použili analýzy variance a pre Neparametrické porovnanie sme použili Wilcoxonův a testy Kruskal-Wallis. Použili sme Fisher je presný a χ
2 testy s 2 × 2 a tabuľku 4 × 2, respektíve porovnať klinicko znaky v skupine pacientov. Kaplan-Meierove krivky odhadovaného prežívanie bez známok ochorenia a celkové prežívanie boli vytvorené a porovnania medzi skupinami boli vykonávané s použitím obojstranného log-rank testu. P
hodnoty ≤ 0,05 boli považované za štatisticky významné.
Štúdia bola schválená Institutional Review Board of Showa univerzity, Northern Yokohama nemocnice. Vysvetlili sme protokol štúdie s pacientmi a dobrovoľníkmi, ako dali písomný informovaný súhlas. Táto štúdia bola registrovaná u University Hospital Medical informačnej siete v Japonsku, číslo 000002018.
Výsledky
účastník charakteristiky
Šesťdesiat päť pacientov s adenokarcinómom žalúdka (46 mužov a 19 žien, priemerný vek 58,8 rokov, rozpätie 33 -76 rokov), ktorí podstúpili chirurgický zákrok na tráviaci chorôb Stredu Showa univerzity Northern Yokohama nemocnice v období od septembra 2009 do mája 2011 boli zahrnuté v tejto štúdii. Dvadsať deväť mala distálnej gastrektómii, 32 mala celkovú gastrektómii a štyri mali operovaná. charakteristika pacientov sú zhrnuté v tabuľke 1. Dvadsať osem z 65 pacientov dostávala chemoterapiu po chirurgickom zákroku. Kontrolnú skupinu tvorilo 10 zdravých volunteers.Table 1 charakteristík pacienta a patologického nálezu
parametre
spoločností Počty pacientov
sex
Muž
46
Žena
19
Vek (priemer, rozsah)
58,8, 33-76
gastrektómia
distálnej
29
Celkom
32
Žiadne
4
Chirurgická prístup
laparoskopia
54
Otvorené laparotomie
11
Kurabilita
R0
57
R1
0
R2
8
TNM etapa
Aj
40
II
6
III
10
IV
9
nádor hĺbkou invázie
T1
36
T2
8
T3
9
T4
12
lymfatických uzlín
N0
39
N1
5
N2
6
N3
15
vzdialenej metastázy
M0
56
M1
9
Hlavný histologický typ †
rozlíšené
25
bližšie neurčené
40
Lymfatická invázie
LX
4
L0
35
L1
26
Žilová invázie
VX
4
V0
35
V1-2
26
† dobre alebo stredne diferencovaný adenokarcinóm a papilárnej adenokarcinóm boli kvalifikované ako diferencované typu. karcinóm Signet ring-cell, zle diferencovaný adenokarcinóm a mucinózní adenokarcinóm boli kvalifikované ako nediferencovaného typu.
GFP-pozitívnych CTC v periférnej krvi
Pomocou fluorescenčného mikroskopu, bunky s fluorescenčné emisie ≥2.85 × 10 7 znamenajú ekvivalent fluorochrómy sa počítali ako GFP-pozitívnych buniek
rôzne veľkosti GFP-pozitívnych buniek boli pozorované v každej vzorke .; preto bolo ťažké určiť jednu reprezentatívnu bunka medzi GFP-pozitívnych buniek, pre porovnanie medzi pacientmi a zdravých dobrovoľníkov. Z tohto dôvodu, aby sa zabránilo používanie ľubovoľnú hodnotu, sme sa rozhodli použiť optimálne limity odvodia z analýzy ROC na základe veľkosti bunky, to znamená, že 7.735 um, ako je prahová hodnota pre definovanie GFP-pozitívnych CTC (obrázok 3). Obrázok 3 Porovnanie priemeru buniek medzi pacientmi a dobrovoľníkmi. Ak chcete určiť prahovú hodnotu, sme porovnali priemery buniek od pacientov s rakovinou žalúdka a kontrol podľa ROC analýzy. Bol významný rozdiel medzi pacientmi s rakovinou žalúdka a kontrol (p Hotel &0,001, plocha pod krivkou = 0,57; 95% interval spoľahlivosti = 0,54-0,60)
imunohistochemickým farbením s použitím anti-EpCAM a. proti-CD45 protilátky, sme potvrdili, že GFP-pozitívnych CTC boli EpCAM-pozitívne a CD45-negatívne (Obrázok 4). Obrázok 4 Príklady mikroskopických snímok. Reprezentatívne obrazy z dvoch vzoriek žalúdočnej rakovinou GFP-pozitívnych CTC a imunocytochemickou analýzu anti-EpCAM- a anti-CD45-pozitívnych buniek. Bunky boli počítané za použitia počítačom riadený fluorescenčného mikroskopu skúšajúci zaslepeným k stavu vzorky. Mierka, 10 um. EU Počet GFP-pozitívnych CTC vo vzorkách periférnej krvi sú znázornené na obrázku 5. Nebol žiadny významný rozdiel medzi detekčnými sadzieb GFP-pozitívnych CTC vo vzorkách reprezentujúcich jednotlivé fázy rakoviny. Obrázok 5 počet GFP-pozitívnych buniek. Bodky sú počty GFP-pozitívnych CTC vo vzorkách pacientov. Spodná a horná časť krabice predstavujú hornú a dolnú kvartily, a kapela cez pole ukazuje medián. Spodná a horná tyče na koncoch whiskery vykazujú najnižšie dátový bod počas 1,5 medzikvartilové rozsahov dolnom kvartile, a najvyšší dátový bod počas 1,5 medzikvartilové rozsahov hornom kvartile, resp. Zelené pruhy označujú strednú hodnotu.
Asociácie GFP-pozitívnych CTC s prežitím
priemerný počet GFP-pozitívnych CTC vo vzorkách z 10 zdravých dobrovoľníkov bol 4,8. sme rozdelili pacientov do dvoch skupín na základe počtu GFP-pozitívnych CTC: 0-4 a ≥5. Tieto klinicko-patologické charakteristiky oboch skupín sú zhrnuté v tabuľke 2. Nebol žiadny významný rozdiel medzi týmito dvoma skupinami s výnimkou, že existuje iba jedna kategória lymfatických metastasis.Table 2 klinicko znaky dvoch skupín pacientov podľa počtu CTC
počet CTC
0-4
5 ≤
P
hodnota
počet subjektov
41

24
TNM: Stage
0,1586
I. etapa
29
11
Stage II
4
2
Stage III
4
6
Stage IV
4
5
TNM: kategória T
0.2753
T1
26
10
T2
5 Sims 3
T3
5
4
T4
5
7
TNM: N kategória
0,0257 *
N0
27
12
N1
5
0
N2
4
2
N3
5
10
TNM: M kategória
0.2121
M0
37
19
M1
4
5
Hlavný histologický typ
0,6844
rozlíšené typu
15
10
nediferencovaná vývozná typ
26
14
Lymfatická invázie
0,3177
Lx
2
2
L0
25
10
L1
14
12
Žilová invázie
0,1293
Vx
2
2
V0
26
9
V1-2
13
13
chirurgia
0.2124
kuratívnu resekciu
38
19
Non-kuratívny resekcia
1 Sims 3
Nie resekcia
2.
2
Pooperačné chemoterapia
0.1672
prítomnosť
15
13
Absencia
26
11
* * Významný rozdiel.
Obrázok 6a ukazuje Kaplan -Meier krivky celkového prežívania v dvoch skupín: pacienti s 0-4 CTC a tí s ≥5. Bol významný rozdiel medzi týmito dvoma skupinami (p = 0,0021
). Okrem toho, u pacientov s pokročilou rakovinou žalúdka s ochorením fázy II-IV, existuje významný rozdiel medzi týmito dvoma skupinami (p = 0,0126
) (obrázok 6b). Obrázok 6 Celkové prežívanie. (A) Celkové prežívanie všetkých pacientov. (B) Celkové prežívanie u pacientov s ochorením fázy II-IV. Prežitie bol porovnaný podľa počtu CTC s použitím Kaplan-Meierovej analýzy a log-rank štatistiky. ** P Hotel < 0,01, p * Hotel < 0,05.
Asociácie GFP-pozitívnych CTC s patologickými indexmi
Nebol žiadny významný vzťah medzi počtom GFP-pozitívnych CTC a štádiu rakoviny (p = 0,2313
) (obrázok 5). Aj keď žiadna štatistická významnosť bola pozorovaná, počet GFP-pozitívnych CTC tendenciu zvyšovať s progresiou primárneho nádoru (p = 0,1521)
(obrázok 7a). Počet CTC vo vzorkách od pacientov s pozitívnymi uzlinami je väčší, ako u pacientov s negatívnymi uzlinami (p = 0,1752
) (obrázok 7b). V porovnaní s pacientmi bez vzdialených metastáz, tie, ktoré sa vzdialenými metastázami mal podobný počet GFP-pozitívnych CTC (p = 0,5655
) (obrázok 7c). Nebol významný rozdiel medzi diferencované a nediferencované typu (p = 0,8387)
(obrázok 7d). Počty CTC boli podobné vo vzorkách od pacientov s a bez lymfatickou invázii (p = 0,2054)
(obr 7e). Žilová invázie, počet CTC vo vzorkách od pacientov s invázie bol významne vyššia ako u pacientov bez invázie (p = 0,0351
) (Obrázok 7f). Obrázok 7 Vzťah medzi počtom GFP-pozitívnych CTC v 7,5 ml vzorky krvi od pacientov s rakovinou žalúdka a patologické nálezy u pacientov. Bodky sú počty GFP-pozitívnych CTC vo vzorkách pacientov. Spodná a horná časť krabice predstavujú hornú a dolnú kvartily, a kapela cez pole ukazuje medián. Spodná a horná tyče na koncoch whiskery vykazujú najnižšie dátový bod počas 1,5 medzikvartilové rozsahov dolnom kvartile, a najvyšší dátový bod počas 1,5 medzikvartilové rozsahov hornom kvartile, resp. a, nádor hĺbka invázie (T1-T4 ukazujú na rastúci hĺbka). b, Lymfatická metastázy (N0 = negatívne, N1-3 = pozitívne). c, vzdialené metastázy (M0 = negatívne, M1 = pozitívne). d, histologický typ (diferencovaný typ a nediferencovanej typ). e, Lymfatická invázie (L0 = negatívne, L1 = pozitívne). f, Žilová invázie (V0 = negatívne, V1 = pozitívne), * p Hotel < 0.05. Hoci jediný žilovej invázie zobrazená štatisticky významný rozdiel, tam boli niektoré tendencie k nárastu počtu CTC s výhradou progresie rastúcou ochorenia.
Diskusia
papier vykazuje koreláciu medzi CTC a rakovinou žalúdka, ktorá je druhou najčastejšou príčinou rakovina súvisiace s úmrtí na celom svete. Užitočnosť detekciu CTC v diagnostike, stanovenie prognózy a hodnotenie účinkov liečby už boli popísané pre prsníka [27, 33], prostaty [34], pľúc [35] a tráviaceho ústrojenstva [11, 36, 37 ] rakoviny. Táto štúdia ukazuje, že je tiež užitočné pre rakovinu žalúdka.
Jedným z hlavných výsledkom našej štúdii bol významný vzťah medzi počtom CTC a prognózu. Aj keď sme použili krátku následnou-up obdobie, prognóza pacientov, ktorí trpeli ≥5 CTC vo svojich 7,5 ml vzorkách periférnej krvi bola zlá. Pacienti s včasným štádiom ochorenia majú všeobecne nižší počet recidív [38], a tí s ochorením štádium I v skutočnosti nemal recidívu v našej štúdii. Máme tiež vypočítať mieru prežitia u pacientov s pokročilou rakovinou žalúdka s ochorením II-IV štádiu a ukázal, že títo pacienti mali podobný prežitie vzor pre tých s ochorením stupeň I-IV. Tieto výsledky naznačujú, že predoperačné chemoterapie alebo komplexná liečba je vhodná pre pacientov pokročilým ochorením, ktorí majú veľa CTC v predbežnej spracovanie vzoriek, pretože ich zlou prognózou.
Medzi našimi patologické nálezy, iba žilovej invázia mal významný vzťah k počtu CTC. To naznačuje dohodu medzi tradičné patológie a modernej molekulárnej techniky. Domnievame sa, že nedostatok významný rozdiel medzi počtom zistených CTC naším testom a ďalších patologických indexov možno vysvetliť tým, metodických problémov, ako je napríklad malej veľkosti vzorky. Naša metóda osvedčila ako prognostický hodnotiaci nástroj - poskytovať informácie o potrebe pooperačné adjuvantnej terapie - a to môže poskytnúť užitočný pomocný nástroj na klasifikáciu patológie na báze
Nie je jasné, či všetky detekovanej CTC majú metastatické potenciál .. Životaschopné CTC boli detekované vo vzorkách od pacientov s rakovinou, začínajúcich v tejto štúdii, ale takmer všetci pacienti fázy I Skupina prežila bez recidívy [38]. Máme v úmysle potvrdiť, či rezistentné nádorové bunky, rovnako ako nádorových kmeňových buniek, boli prítomné v detegovaných GFP-pozitívnych buniek. Tiež budeme analyzovať funkcie životaschopných CTC individuálne po triedenie buniek, a identifikovať CTC s metastatickým potenciálom pomocou ďalších nástrojov, ako je analýza DNA ploidii [39, 40]. Okrem toho sa bude profilovanie génovej expresie medzi životaschopných CTC, odumretých buniek, primárnych nádorov a metastatických nádorov odhalí ďalšie dôležité informácie týkajúce sa mechanizmov nádorových metastáz.
Naše výsledky musia byť interpretované s istou opatrnosťou, vzhľadom na obmedzenia tejto štúdie. Po prvé, je počet CTC sa značne líši medzi jednotlivcami, vrátane pacientov a zdravých dobrovoľníkov. Okrem toho, že nebola ovplyvnená fáze nádoru alebo prítomnosť klinicky detekovateľných metastáz. Podobne, nebol zistený žiadny vzťah medzi prítomnosťou metastáz lymfatických uzlín (alebo vzdialené) alebo inváziu a počtu CTC, ktorá spochybňujú použitie CTC predvídať metastatické potenciál. Avšak, je možné, že relatívne malá veľkosť vzorky obmedzený potenciál pre detekciu skutočné rozdiely medzi týmito skupinami pacientov. A konečne, treba uznať, že naše výsledky sa vzťahujú len na predoperačnej, doteraz neliečených pacientov rakoviny žalúdka a nemal by byť celkový k iným typom rakoviny.
Je zrejmé, že ďalšie štúdium väčšieho počtu pacientov s rôznymi typmi rakoviny , sú potrebné na objasnenie klinickú použiteľnosť detekcie CTC. V súčasnej dobe pripravujeme štúdiu s cieľom skúmať účinky liečby rakoviny žalúdka o počte CTC, ktorá by mala pomôcť vytvoriť svoj vzťah s budúcim progresie ochorenia a či počet CTC môže pomôcť guidetherapy voľby.
Závery
Nastalo signifikantný rozdiel v prežívaní medzi pacientmi s 0-4 CTC a tie s ≥5. Je však jasné, či všetky CTC majú skutočný metastatické potenciál a sú potrebné ďalšie štúdie.
Deklarácia
Poďakovanie
Tento výskum bol podporovaný z časti grantom-in-pomoc pre náročných predbežného výskumu (23659308) z Japonska spoločnosť pre podporu vedy (JSP). Telo financovania hral žiadnu úlohu v dizajne štúdie; v zbierke, analýzou alebo interpretáciu dát; pri písaní rukopisu; alebo v rozhodnutí predložiť rukopis k publikácii. Sme vďační všetkým zdravým dobrovoľníkom i pacientom, ktorí darovali krv k tejto štúdii. Radi by sme poďakovali profesora Toshiyoshi Fujiwara (Okayama University Graduate School of Medicine, Okayama, Japonsko) za poskytnutie užitočné pripomienky a návrhy; Pán Yasuo urátov (Oncolys BioPharma, Tokyo, Japonsko) pre napájanie OBP-401; Dr. Yukio Tsujino Dr. Toshiyuki Ozawa a Dr. Akinori masage (Sysmex Corporation, Kobe, Japonsko) za ústretový podpory; a Dr. Rebecca Devon (Genetics Unit a University of Edinburgh, Edinburgh, UK) pre kritické preskúmanie a úpravy rukopisu. Sme tiež veľmi vďačný nemocničný personál.
Autorov pôvodné predloženej súbory obrazov
Nižšie sú uvedené odkazy na autorov pôvodnej predložených súborov pre obrázky. "Pôvodný súbor na obr.1 12885_2012_3365_MOESM2_ESM.tiff autorov 12885_2012_3365_MOESM1_ESM.tiff autorov pôvodný súbor" pôvodného súboru pre Obrázok 3 12885_2012_3365_MOESM4_ESM.pdf autorského Obrázok 2 12885_2012_3365_MOESM3_ESM.pdf autorského pôvodného súboru na Obrázok 4 pôvodného súboru 12885_2012_3365_MOESM5_ESM.tiff autorského na obrázku 5 Všetci autori prečítali a schválená konečná rukopis.

• Terapeutický potenciál PRL-3 zacielenie a klinický význam PRL-3 genomické zosilnenie v žalúdku cancer
• Rodinná anamnéza rakoviny a gastroesofageálny ochorenia a riziko z pažerákových a žalúdočných adenokarcinómov: a case-control study