Прогностическое воздействие обнаружения жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток в больных раком желудка с помощью теломеразы конкретного вирусного агента: проспективное исследование

Прогностическое воздействие обнаружения жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток в больных раком желудка с помощью теломеразы конкретного вирусного агента: проспективное исследование
Аннотация
Справочная информация
Идентификация циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в периферической крови является полезным подходом оценить прогноз, контролировать прогрессирование заболевания, и измерить результаты лечения различных злокачественных опухолей. Однако клиническая значимость ЦОК является спорным. Мы попытались обнаружить жизнеспособные CTCs в периферической крови больных раком желудка с помощью теломеразы конкретного вирусного агента.
Методы
Мы взяли 7,5 мл пробы крови от 65 лечебно-негативных больных раком желудка до операции и 10 здоровых волонтеры. Мы обнаружили жизнеспособные CTCs в образцах крови после инкубации их с теломеразы специфические, репликации, селективный онколитической аденовирусной агента, несущего зеленый флуоресцентный белок (GFP) гена (ОБП-401). GFP-положительных ЦОК были определены как имеющие диаметр, по меньшей мере, 7.735 мкм; этот порог был определен приемник операционной характеристической кривой анализа. GFP-позитивные клетки подсчитывали под флуоресцентным микроскопом.
Результаты
Существовал значительная разница в общей выживаемости среди больных с 0-4 и те с ≥5 GFP-положительных ЦОК в стадии I-IV группы болезнь и этап II-IV группа запущенное заболевание. Число GFP-положительных ЦОК не был связан со стадией рака. Среди патологических данных, число GFP-положительных ЦОК был только в значительной степени связано с венозным вторжения, хотя были тенденции к более GFP-положительных ЦОК с прогрессированием заболевания (глубина опухоли, узловой метастаз лимфатический, отдаленными метастазами, лимфатической инвазии и гистологического типа ).
Выводы
был значительная взаимосвязь между количеством GFP-положительных ЦОК и общей выживаемости у больных раком желудка. Обнаружение ЦОК с использованием ОБП-401 может быть полезным для прогностической оценки.
Судебная регистрация
Университетская больница Медицинская информационная сеть в Японии, UMIN000002018.
Ключевые слова
Циркулирующие опухолевые клетки рак желудка теломеразы фон
Отдаленные метастазы солидных опухолей является сильным прогностическим фактором [1-3]. Наличие циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в периферической крови свидетельствует о том, что пациент находится в системной фазе заболевания [4]. Идентификация ЦОК в периферической крови является полезным подходом для оценки прогноза, мониторинга прогрессирования заболевания, а также измерить результаты лечения рака молочной железы, предстательной железы, кожи, толстой кишки и желудочно-кишечных злокачественных опухолей. Таким образом, различные методы были разработаны для обнаружения CTCs, и иногда используются в комбинации. Общие методы для обогащения и обнаружения ЦОК являются градиенте плотности разделения [5], прямое обогащение путем фильтрации [6, 7], иммуномагнитный разделение [8], проточной цитометрии [9], в режиме реального времени обратной транскриптазы полимеразной цепной реакции (RT- ПЦР) [10, 11], и микрочип технологии [12].
обогащение клеток путем разделения градиента плотности осуществляется с использованием коммерческих наборов, таких как OncoQuick® (Greiner, Frickenhausen, Германия) [13] и Lymphoprep® (Nycomed, Осло , Норвегия) [14]. Градиент плотности разделения основан на теории, что различные типы клеток могут быть разделены в соответствии с их плотностью. Поэтому трудно извлечь все CTCs из-за миграции клеток. ОТ-ПЦР является одним из наиболее распространенных способов обнаружения опухолевых клеток из-за его высокой чувствительности и специфичности, предполагая адекватную грунтовку и конструкция зонда. Тем не менее, ложно-положительные результаты могут возникать из-за его технической слабости и высокой чувствительностью [15, 16].
Иммуномагнитного обогащение клеток, например, что в исполнении CellSearch System® (Veridex, LLC, Raritan, Нью-Джерси, США) [ ,,,0],17], в настоящее время является наиболее часто используемым методом для обогащения и обнаружения CTCs [18-21]. Преимущество разделения иммуномагнитного клеток является то, что ЦОК можно визуализировать с помощью флуоресцентного микроскопа. Клетки, обнаруженные с антителами против эпителиальных маркеров (эпителиальных молекул адгезии клеток; EpCAMs) определяются как ЦОК. Таким образом, этот метод может дать ложноположительные результаты, основанные на нормальной эпителиальной экспрессии маркеров неспециальными опухолевых клеток, и ложно-отрицательные результаты могут возникнуть в связи с отсутствием селективного маркера экспрессии на опухолевых клетках. В результате ограничений, связанных с вышеуказанными подходами, новый метод необходим для обнаружения жизнеспособных CTCs точно.
Теломераза играет важную роль в канцерогенезе, инвазии и метастазированию [22-24]. Мы разработали методику, чтобы эксплуатировать высокой активности теломеразы в клетках. Этот метод использует теломеразы специфичную для репликации селективных модифицированного вирусного агента (ОБП-401; TelomeScan®, Oncolys BioPharma, Токио, Япония), в которых человеческий теломеразной обратной транскриптазы (TERT
), промотор гена вставляется в область Е1 , и зеленый флуоресцентный белок (GFP), ген помещается под контролем промотора цитомегаловируса в E3 области в качестве маркера вирусной репликации [25]. Сообщалось, что ОБП-401 может быть использован для обнаружения жизнеспособных CTCs среди нормальных клеток крови [26, 27].
Здесь мы применили анализа для детектирования жизнеспособных CTCs с потенциалом для метастаз в больных раком желудка. Мы обнаружили GFP-положительных CTCs. В отличие от этого, возможно, что не-раковые клетки выделяют GFP флюоресценции после ОБП-401-инфекции [28]. Таким образом, мы выбрали клетки больше, чем порог, определенный путем сравнения между здоровыми добровольцами и пациентами, так как ЦОК больше, чем нормальные клетки крови [7, 29, 30]. . Мы изучали ассоциацию GFP-положительных CTC числа с выживанием и патологическими показателями прогрессирования заболевания
Методы
больных и здоровых добровольцев
Пациенты, включенные в данном предварительном исследовании, были те, проходит плановое хирургическое лечение; пациенты, которые были пригодны для эндоскопическая резекция слизистой оболочки или эндоскопической подслизистой диссекции были исключены. Критерии включения были: (I) гистологически доказано аденокарциномы желудка с помощью эндоскопической биопсии; (Б) клинические одинокую опухоль; (III) без предварительной эндоскопическая резекция, химиотерапия, или лучевая терапия; (IV) в возрасте 20-80 лет; (V) общее состояние Eastern Cooperative Oncology Group [31] 0 или 1; (VI) достаточной функции органов; и (VII) письменное информированное согласие. Критерии исключения: (I) синхронным или метахронного злокачественности; (II) беременным и кормящим женщинам; (III) активный или хронический вирусный гепатит; (IV) активный бактериальной или грибковой инфекции; (V) сахарный диабет; (VI) системное введение кортикостероидов; и (VII) нестабильны гипертензия. Стадия заболевания у пациентов был патологически характеризуется использованием седьмое издание TNM классификации Международного союза по борьбе с раком [32]. Глубина опухоли у трех пациентов без гастрэктомии и статус регионарных лимфатических узлов пяти пациентов без достаточного лимфаденэктомии были диагностированы хирургическим путем.
Все пациенты посетили нашу больницу регулярно после операции, и были проверены каждые 3 месяца. Пациенты также проводилось эндоскопическое исследование и компьютерная томография не реже одного раза в год, в зависимости от их стадии заболевания и конечно.
Мы также набраны здоровых добровольцев, чтобы действовать в качестве контроля. Все здоровые добровольцы были сотрудниками Sysmex Corporation и включала семь мужчин (средний возраст 31,4 лет, диапазон 24-39 лет) и три женщины (средний возраст 33,7 лет, диапазон 26-48 лет). Все добровольцы прошли медицинские осмотры при поступлении на работу и ежегодно; осмотры включены медицинские интервью, выслушивание, рентгенограммы и анализы крови и мочи. Кроме того, мы провели индивидуальные собеседования до взятия пробы; любой доброволец, который в настоящее время получал медицинскую помощь, беременности или кормления грудью, или которые сдавали кровь в течение последнего месяца был исключен.
Вирус
ОБП-401, теломеразы специфические, репликация селективного аденовирусная агента, в котором TERT
промоторный элемент приводит в действие экспрессию
EIA и ЕИБ
генов, и в котором ген GFP, интегрирован, был использован в данном исследовании. Чувствительность и специфичность анализа с использованием ОБП-401 были изучены ранее Ким и др. [27]. Испытание повторяли пять раз проверить в образце в том числе 1 MDA-MB-468 (карцинома молочной железы) клеток и 7,5 мл крови, а число GFP-положительных клеток были 1, 1, 1, 2 и 3; в образце, в том числе 20 MDA-MB-468 (карцинома молочной железы) клетки, то количество GFP-позитивных клеток 15, 17, 19, 22 и 24. Вирусные образцы хранили при -80 ° С.
клеточных линий и Культура
The А549 (карцинома легких), HepG2 (гепатоцеллюлярный рак), НЕС-1 (аденокарциномы эндометрия), КАТО-III (рака желудка), и СБК-3 (мелкоклеточный рак легких), клеточные линии были получены из здравоохранения Science Research Resources Bank (Осака, Япония). LNCaP (аденокарцинома предстательной железы) и OVCAR-3 (рак яичников) клеточные линии были получены из банка клеток Riken (Tokyo, Japan). Клетки культивировали в соответствии со спецификациями поставщика. Клетки MDA-MB-468 культивировали, как описано ранее [27].
Подготовка проб и клеток подсчета
7,5 мл периферической вены образца крови получали от каждого пациента до операции и от каждого добровольца. Образцы были взяты в пробирки, содержащие лимонную кислоту, фосфорную кислоту и декстрозу, и хранят при температуре 4 ° С. Анализ был начат в течение 48 ч.
Образцы центрифугировали в течение 5 мин при 540 г и плазменная фаза была удалена. Затем клетки промывали четыре раза фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и дважды среде Институт Memorial Roswell Park. Образцы были заражены 4 × 10 8 бляшкообразующих единиц (БОЕ), в ОБП-401 вирусов путем инкубации в среде в течение 24 часов при температуре 37 ° С.
После окрашивания мертвые клетки с помощью красно-флуоресцентный реактивная краситель L23102 (Life Technologies Corporation, Карлсбад, Калифорния, США), ОБП-401 вирусы инактивируются и клетки фиксировали 2% параформальдегида (PFA) в течение 20 мин при комнатной температуре.
образцы были обработаны поверхностно-активным агент (Emalgen 2025 G; Kao Chemicals, Токио, Япония) в течение 10 мин при 40 ° с, чтобы деградировать эритроциты. И, наконец, 7,5 мл крови был использован для создания двух образцов стекла слайд для микроскопического анализа. Все GFP-положительных клеток на двух слайдах подсчитывали, используя управляемый компьютером флуоресцентного микроскопа (IX71, Olympus, Токио, Япония) и экзаменатора ослепить на образцы деталей. Общее время анализа составила 27,5 ч (рисунок 1). Рисунок 1 Протокол и процедура "GFP-CTC Анализе". Каждый 7,5 мл периферийный образец вены кровь получали от пациентов до операции и от добровольцев. Образцы были взяты в пробирки, содержащие лимонную кислоту, фосфорную кислоту и декстрозу. Образцы центрифугировали и плазменная фаза была удалена. После промывки клеток с использованием PBS и Roswell Park Memorial Institute среды, образцы были заражены 4 × 108 БОЕ вируса ОБП-401. Вирус ОБП-401 был инактивированной и клетки фиксировали 2% параформальдегида (PFA). Образцы были обработаны поверхностно-активным агентом, чтобы деградировать красных и белых клеток крови. Два образца стекла слайд из 7,5 мл крови готовили для микроскопического анализа. Все GFP-положительных клеток на двух слайдах подсчитывали с использованием управляемой компьютером флуоресцентного микроскопа.
Определение порога интенсивности флуоресценции GFP
Порог интенсивности флуоресценции GFP, определяли следующим образом. Приблизительно 30000 культивированные клетки вносили в 7,5-мл крови от здоровых добровольцев, которые были с добавленными различных линий раковых клеток: А549, HepG2, HEC-1, КАТО-III, SBC-3, LNCaP, MDA-MB-MB468 и Ястребаце -3. Образцы крови были подвергнуты реакции на обнаружение CTC, а затем обнаруживаемые клетки подсчитывали с помощью флуоресцентной микроскопии. Более 100 клеток анализировали в каждом образце. Мы определили 2,85 × 10 7 средний эквивалентный флуорохром быть порог интенсивности GFP сигнала от минимального уровня интенсивности GFP наблюдается в крови образцов с добавленными клеточных линий (рисунок 2). Данные представлены в виде числа GFP-положительных ЦОК в 7,5 мл периферической пробы крови. Рисунок 2 интенсивность сигнала GFP из различных линий раковых клеток. Низ и верх коробки являются нижний и верхний квартили, и группа из коробки является медианой. Линии на конце усов являются минимум и максимум. Ось Y представляет интенсивность сигнала GFP в логарифмическом масштабе
Иммунологическое
Фикоэритрин меченных CD45 антитела против человеческого (BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США) разводили 1: 5. И Pacific Blue-меченными анти-человеческий CD326 (ЕрСАМ) антитело (BioLegend) разбавляли в соотношении 1:10 в PBS, содержащем 2% фетальной бычьей сыворотки. Клетки инкубировали с разбавленными антителами в течение 30 мин при 25 ° C. После промывания PBS, содержащем 2% фетальной бычьей сыворотки, клетки были установлены на предметные стекла и анализировали с использованием флуоресцентного микроскопа. (IX71, Olympus)
Статистический анализ
Статистический анализ был проведен с использованием JMP статистического Discovery 9.0.2 (SAS институт, Cary, NC, USA). Для определения порогового значения диаметра ячейки, обнаруженные GFP-положительных ЦОК были проанализированы с использованием приемника операционных характеристик (ROC) кривой между образцами от больных раком желудка и тех, у добровольцев. Для множественных сравнений групп, гомогенность дисперсии оценивали с помощью теста Levene. Для параметрических сравнения мы использовали дисперсионный анализ, а также для непараметрических сравнений мы использовали Wilcoxon и тесты Крускала-Уоллиса. Мы использовали Фишера точный и χ
2 теста с 2 × 2 и таблица 4 × 2, соответственно, для сравнения символов в клинико-группе пациентов. были получены Каплана-Мейера по оценкам, выживаемости без признаков заболевания и общей выживаемости, а также сравнение между группами проводили с использованием двустороннего лог-рангового теста. P
значения ≤0.05 считались статистически значимыми.
Исследование было одобрено Советом по институциональному обзору Сева университета Северной Yokohama больницы. Мы объяснили, протокол исследования для пациентов и добровольцев, прежде чем они дали письменное информированное согласие. Это исследование было зарегистрировано в университетской больнице Медицинская информационная сеть в Японии, Количество 000002018.
Результаты
Участвующие характеристики
Шестьдесят пять пациентов с аденокарциномой желудка (46 мужчин и 19 женщин, средний возраст 58,8 лет, диапазон 33 -76 лет), которые перенесли операцию на пищеварительном заболеваний Центра Северного Иокогамы больницы Сева университета в период с сентября 2009 года по май 2011 года были включены в данное исследование. Двадцать девять были дистального гастрэктомию, 32 имели общее гастрэктомию, и четыре из них имеют лапаротомии. Характеристики пациентов приведены в таблице 1. Двадцать восемь из 65 пациентов, получавших химиотерапию после операции. Контрольную группу составили 10 здоровых volunteers.Table 1 Характеристики больных и о патологических изменениях
параметров

Число больных

Секс
Муж
46
Женский
19
Возраст (средний, диапазон)
58,8, 33-76
гастрэктомия
дистального
29
Total
32
None 4
Хирургический подход
лапароскопии
54
Открыть лапаротомию
11
излечимости
r0
57
R1
0
R2
8
TNM Этап
I
40
II
6
III
10
IV
9
Опухоль глубина инвазии
T1
36 <бр> T2
8
T3
9
T4
узла метастаза 12
лимфы
N0
39
N1 страница 5 N2 <бр> 6
N3
15
Отдаленные метастазы
M0
56
M1
9

• Терапевтический потенциал ПРЛ-3 адресности и клиническая значимость СПР-3 геномной амплификации при раке жел…
• Семейная история рака и гастроэзофагеальной расстройств и риск рака пищевода и желудка аденокарциномы: случ…