Prognostisk betydning detektere levedygtige cirkulerende tumorceller i mavecancerpatienter ved hjælp af en telomerase-specifik viral agent: en prospektiv undersøgelse

Prognostisk betydning detektere levedygtige cirkulerende tumorceller i mavecancerpatienter ved hjælp af en telomerase-specifik viral agent: en prospektiv undersøgelse
Abstract
Baggrund
Identifikationen af ​​cirkulerende tumorceller (CTCs) i perifert blod er en nyttig metode at estimere prognose, overvåge sygdommens progression, og måle behandlingseffekt i forskellige maligniteter. Men kliniske relevans af CTCs er kontroversiel. Vi har forsøgt at påvise levedygtige CTCs i det perifere blod af mavecancerpatienter bruger telomerase-specifikt viralt middel. Salg Metoder
Vi tog en 7,5-ml blodprøve fra 65 behandlingsrelaterede negative mavecancerpatienter før kirurgi og 10 sunde frivillige. Vi har registreret levedygtige CTCs i blodprøverne efter inkubere dem med et telomerase-specifik, replikations-selektive, oncolytisk adenoviral agent bærer grønt fluorescerende protein (GFP) -gen (OBP-401). GFP-positive CTCs blev defineret som havende en diameter på mindst 7,735 um; denne grænse blev bestemt ved Receiver Operating karakteristik analyse. GFP-positive celler blev talt under et fluorescensmikroskop.
Resultater
Der var en signifikant forskel i den samlede overlevelse blandt patienterne med 0-4, og dem med ≥5 GFP-positive CTCs i fase I-IV sygdomsgruppe og stadie II-IV fremskreden sygdom gruppe. Antallet af GFP-positive CTCs var ikke relateret til kræft scenen. Blandt de patologiske fund, blev antallet af GFP-positive CTCs kun signifikant relateret til venøs invasion, selv om der var tendenser til flere GFP-positive CTCs med sygdomsprogression (tumor dybde, lymfeknude metastaser, fjernmetastaser, lymfe invasion og histologiske type, ).
konklusioner
Der var en signifikant sammenhæng mellem antallet af GFP-positive CTCs og samlet overlevelse i patienter med mavekræft. Påvisning af CTCs hjælp OBP-401 kan være nyttige for prognostisk evaluering.
Trial registrering Aalborg Universitet Hospital Medical Information Network i Japan, UMIN000002018.
Nøgleord
Cirkulerende tumorceller mavekræft Telomerase Baggrund
fjernmetastaser af en fast tumor er en stærk prognostisk faktor [1-3]. Eksistensen af ​​cirkulerende tumorceller (CTCs) i perifert blod tyder på, at en patient er i en systemisk fase sygdom [4]. Identifikationen af ​​CTCs i perifert blod er en nyttig metode til at estimere prognose, overvåge sygdommens progression, og måle behandlingseffekt i bryst, prostata, hud, kolon og gastrointestinale maligniteter. Derfor er forskellige fremgangsmåder blevet udviklet til påvisning CTCs, og er lejlighedsvis anvendes i kombination. Almindelige teknikker til berigelse og påvisning af CTCs er densitetsgradient separation [5], direkte berigelse ved filtrering [6, 7], immunomagnetisk separation [8], flowcytometri [9], real-time revers transkriptase polymerasekædereaktion (RT- PCR) [10, 11], og mikrochip teknologi [12].
Cell berigelse ved densitetsgradient separation udføres ved hjælp kommercielle kits såsom OncoQuick® (Greiner, Frickenhausen, Tyskland) [13] og Lymphoprep® (Nycomed, Oslo , Norge) [14]. Densitetsgradient separation er baseret på den teori, at forskellige typer af celler kan adskilles i henhold til deres densitet. Derfor er det vanskeligt at uddrage alle CTCs grund af celle migration. RT-PCR er en af ​​de mest almindelige metoder til tumorcelle påvisning på grund af sin høje følsomhed og specificitet, forudsat tilstrækkelig primer og probe design. Dog kan falsk-positive resultater opstå på grund af dens tekniske delikatesse og høj følsomhed [15, 16].
Immunomagnetisk celle berigelse, som den, der udføres af CellSearch System® (Veridex, LLC, Raritan, NJ, USA) [ ,,,0],17], er i øjeblikket den mest anvendte teknik til at berige og opdage CTCs [18-21]. Fordelen ved immunomagnetisk celleseparation er, at CTCs kan visualiseres med et fluorescerende mikroskop. Celler detekteres med antistoffer mod epitel markører (epitel celleadhæsionsmolekyler; EpCAMs) er fast besluttet på at være CTCs. Derfor kan denne teknik give falsk-positive resultater baseret på normal epitel markør ekspression af ikke-tumorceller, og falsk-negative resultater kan opstå baseret på manglen på selektive markør-ekspression på tumorceller. Som følge af de begrænsninger, der er forbundet med de ovennævnte tilgange, er en ny teknik er nødvendig for at opdage levedygtige CTCs præcist.
Telomerase spiller en vigtig rolle i carcinogenese, kræft invasion og metastase [22-24]. Vi har udviklet en teknik til at udnytte høj telomerase-aktivitet i celler. Denne teknik anvender en telomerase-specifikke replikation-selektive modificeret viral agent (OBP-401, TelomeScan®, Oncolys BioPharma, Tokyo, Japan), hvori det humane telomerase-revers transkriptase (TERT
) -gen promotoren indsættes i E1-regionen og det grønt fluorescerende protein (GFP) gen er placeret under kontrol af cytomegalovirus promotoren i E3-regionen som en markør af viral replikation [25]. Det er blevet rapporteret, at OBP-401 kan anvendes til at detektere levedygtige CTCs blandt normale blodceller [26, 27].
Her har vi anvendt assayet til påvisning levedygtige CTCs med potentiale for metastase i mavecancerpatienter. Vi har detekteret GFP-positive CTCs. Derimod er det muligt, at ikke-kræftceller udsender GFP-fluorescens efter OBP-401-infektion [28]. Derfor valgte vi celler større end en tærskel bestemmes ved sammenligning mellem raske frivillige og patienter, fordi CTCs er større end normale blodceller [7, 29, 30]. . Vi studerede sammenslutningen af ​​GFP-positive CTC nummer med overlevelse og patologiske indekser for sygdomsprogression
Metoder
Patienter og raske frivillige
Patienterne inkluderet i denne forundersøgelse var dem, der gennemgår planlagt kirurgisk behandling; patienter, der var egnet til endoskopisk slimhinde resektion eller endoskopisk submucosa dissektion blev udelukket. inklusionskriterierne var: (i) histologisk påvist adenocarcinom i maven ved endoskopisk biopsi; (Ii) klinisk ensomme tumor; (Iii) ingen forudgående endoskopisk resektion, kemoterapi, strålebehandling eller; (Iv) alder 20-80 år; (V) Eastern Cooperative Oncology Group performance status [31] 0 eller 1; (Vi) tilstrækkelig organfunktion; og (vii) skriftlig informeret samtykke. Udelukkelseskriterierne var: (i) synkron eller metachronous malignitet; (Ii) gravide eller ammende kvinder; (Iii) aktiv eller kronisk viral hepatitis; (Iv) aktiv bakteriel eller fungal infektion; (V) diabetes mellitus; (Vi) systemisk indgivelse af corticosteroider; og (vii) ustabil hypertension. Sygdommen stadium af patienterne var patologisk karakteriseret ved hjælp af den syvende udgave af TNM klassifikation af Den Internationale Union Against Cancer [32]. Dybden af ​​tumoren i tre patienter uden gastrektomi og den regionale lymfeknude-status på fem patienter uden tilstrækkelig lymphadenectomy blev diagnosticeret kirurgisk.
Alle patienter deltog i vores hospital regelmæssigt efter kirurgi, og blev kontrolleret hver 3. måned. Patienterne gennemgik også endoskopi og computertomografi mindst en gang om året, ifølge deres sygdom scenen og kursus.
Vi rekrutterede også raske frivillige til at fungere som kontroller. Alle raske frivillige var medarbejdere i Sysmex Corporation og omfattede syv mænd (gennemsnitsalder 31,4 år, spændvidde 24-39 år) og tre kvinder (gennemsnitsalder 33,7 år, spændvidde 26-48 år). Alle frivillige undergik lægeundersøgelser upon beskæftigelse og årligt; check-ups inkluderet medicinske interviews, auskultation, bryst røntgenbilleder, og blod og urin analyser. Desuden udførte vi individuelle samtaler før prøvetagningen; enhver frivillig, der i øjeblikket modtog medicinsk behandling, gravide eller ammer, eller som havde doneret blod inden for den sidste måned var udelukket.
Virus
OBP-401, en telomerase-specifik, replikering-selektive adenoviral middel, hvor TERT
promotorelement driver ekspressionen af ​​VVM
og EIB
gener, og ind i hvilket GFP-genet er integreret, blev anvendt i denne undersøgelse. Følsomhed og specificitet af assayet ved anvendelse af OBP-401 er tidligere blevet undersøgt af Kim et al. [27]. Testen blev gentaget fem gange teste i prøven med 1 MDA-MB-468 (bryst carcinom) -celler og 7,5 ml blod, og antallet af GFP-positive celler var 1, 1, 1, 2 og 3; i prøven inklusive 20 MDA-MB-468 (brystcarcinom) celler, antallet af GFP-positive celler blev 15, 17, 19, 22 og 24. Virale prøver blev opbevaret ved -80 ° C. Salg Cellelinier og kultur
A549 (lungecarcinom), HepG2 (hepatocellulært carcinom), HEC-1 (endometrial adenokarcinom), KATO-III (gastrisk carcinoma), og SBC-3 (småcellet lungecancer) cellelinier blev opnået fra Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan). LNCaP (prostata-adenocarcinom) og OVCAR-3 (ovariecarcinom) cellelinier blev opnået fra Riken Cell Bank (Tokyo, Japan). Cellerne blev dyrket ifølge leverandørens specifikationer. MDA-MB-468 celler blev dyrket som tidligere beskrevet [27].
Prøveforberedelse og celletælling
En 7,5-ml perifer vene blodprøve blev opnået fra hver patient før kirurgi og fra hver frivillig. Prøverne blev trukket i rør indeholdende citronsyre, phosphorsyre og dextrose, og opbevaret ved 4 ° C. Assayet blev startet inden 48 timer.
Prøverne blev centrifugeret i 5 minutter ved 540 g og plasmaet fase blev fjernet. Cellerne blev derefter vasket fire gange med phosphatbufret saltvand (PBS) og to gange med Roswell Park Memorial Institute medium. Prøverne blev inficeret med 4 x 10 8 plakdannende enheder (PFU) af OBP-401 virus ved inkubation i mediet i 24 timer ved 37 ° C.
Efter dødt cellefarvning af røde fluorescerende reaktiv farvestof L23102 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA), OBP-401 virus blev inaktiveret og cellerne blev fikseret med 2% paraformaldehyd (PFA) i 20 minutter ved stuetemperatur.
prøverne blev behandlet med et overfladeaktivt middel (Emalgen 2025 G Kao Chemicals, Tokyo, Japan) i 10 minutter ved 40 ° C for at nedbryde røde blodlegemer. Endelig blev 7,5 ml blod anvendes til at skabe to objektglas prøver til mikroskopisk analyse. Alle GFP-positive celler på de to objektglas blev talt, under anvendelse af en computerstyret fluorescensmikroskop (IX71, Olympus, Tokyo, Japan) og en undersøger blindet for prøven detaljer. Den totale assaytid var 27,5 timer (figur 1). Figur 1 Protokol og procedure af "GFP-CTC Assay". Hver 7,5 ml perifert prøve vene blod blev opnået fra patienter før kirurgi og fra frivillige. Prøverne blev trukket i rør indeholdende citronsyre, phosphorsyre og dextrose. Prøverne blev centrifugeret og plasmaet fase blev fjernet. Efter celle vask med PBS og Roswell Park Memorial Institute medium blev prøverne inficeret med 4 x 108 PFU OBP-401-virus. OBP-401 virus blev inaktiveret, og celler blev fikseret med 2% paraformaldehyd (PFA). Prøverne blev behandlet med et overfladeaktivt middel for at nedbryde røde og hvide blodlegemer. To objektglas prøver fra 7,5 ml blod blev fremstillet til mikroskopisk analyse. Alle GFP-positive celler på de to objektglas blev talt under anvendelse af et computerstyret fluorescerende mikroskop.
Bestemmelse af GFP-fluorescens intensitet tærskel
Tærsklen for GFP-fluorescensintensitet blev bestemt som følger. Ca. 30.000 dyrkede celler blev tilsat til 7,5 ml blodprøver fra raske frivillige, der fik tilsat forskellige cancercellelinier: A549, HepG2, HEC-1, KATO-III, SBC-3, LNCaP, MDA-MB-MB468 og OVCAR -3. Blodprøver blev underkastet CTC detektionsanalyse, og derefter detekterbare celler blev talt ved fluorescensmikroskopi. Mere end 100 celler blev analyseret i hver prøve. Vi bestemt 2,85 × 10 7 betyde tilsvarende fluorokrom at være grænsen for GFP signal intensitet fra minimal GFP intensitetsniveau observeret i blodet prøver tilsat de cellelinjer (figur 2). Data er rapporteret som antallet af GFP-positive CTCs pr 7,5 ml blodprøve perifere. Figur 2 GFP signalintensiteter fra forskellige cancercellelinjer. Bunden og toppen af ​​kassen er den nedre og øvre kvartiler, og båndet af boksen er medianen. Linjerne på enden af ​​knurhår er minimum og maksimum. Y-aksen repræsenterer GFP signalintensitet på en logaritmisk skala
Immunfarvning
phycoerythrin-mærket anti-humant CD45-antistof (BioLegend, San Diego, CA, USA) blev fortyndet 1:. 5 og Pacific Blue-mærket anti-humant CD326 (EpCAM) antistof (BioLegend) blev fortyndet 1:10 i PBS indeholdende 2% føtalt bovint serum. Celler blev inkuberet med fortyndede antistoffer i 30 minutter ved 25 ° C. Efter vask med PBS indeholdende 2% føtalt bovint serum blev cellerne monteret på objektglas og analyseret ved anvendelse af et fluorescensmikroskop. (IX71; Olympus)
Statistisk analyse
Statistisk analyse blev udført under anvendelse af JMP Statistisk Discovery 9.0.2 (SAS Institute, Cary, NC, USA). For at bestemme tærsklen for cellediameter, blev de detekterede GFP-positive CTCs analyseres med en receiver operating characteristic (ROC) kurve mellem prøverne fra mavecancerpatienter og dem fra frivillige. For flere gruppe sammenligninger blev varianshomogenitet vurderes af Levene test. For parametriske sammenligninger brugte vi variansanalyse, og for ikke-parametriske sammenligninger vi brugt Wilcoxon og Kruskal-Wallis test. Vi anvendte Fishers eksakte og χ
2 tests med en 2 × 2 og en 4 × 2 tabel henholdsvis at sammenligne de klinisk-patologiske tegn i patientgruppen. Kaplan-Meier-kurver for estimeret sygdomsfri overlevelse og samlet overlevelse blev genereret, og sammenligninger mellem grupperne blev udført ved anvendelse af en tosidet log-rank test. P
værdier ≤0.05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board af Showa University, Northern Yokohama Hospital. Vi forklarede forsøgsprotokollen til patienterne og frivillige, før de gav skriftligt informeret samtykke. Denne undersøgelse blev registreret med University Hospital Medical Information Network i Japan, nummer 000002018.
Resultater
Deltager egenskaber
Sixty-fem patienter med gastrisk adenocarcinom (46 mænd og 19 kvinder, gennemsnitsalder 58,8 år, interval 33 -76 år), der blev opereret på Digestive Disease center of the Showa University Northern Yokohama Hospital fra september 2009 og kan 2011 er medtaget i denne undersøgelse. Tyve-ni havde distal gastrektomi, 32 havde total gastrektomi, og fire havde sonderende laparotomi. Patienternes egenskaber er opsummeret i tabel 1. Otteogtyve af de 65 patienter modtog kemoterapi efter operationen. Kontrolgruppen bestod 10 raske volunteers.Table 1 Patient egenskaber og patologiske fund
Parametre
Antal patienter
Sex
Mand
46
Female
19
Alder (gennemsnit, rækkevidde)
58,8, 33-76
gastrektomi
Distal
29
Total
32
Ingen
4
Kirurgisk tilgang
laparoskopi
54
Open laparotomi
11
hærdelighed
R0
57
R1
0
R2
8
TNM Stage
jeg
40
II
6
III
10
IV
9
Tumor dybde invasion
T1
36
T2
8
T3
9
T4
12
lymfeknudemetastase
n0
39
N1
5 fotos N2
6
N3
15
Distant metastaser
M0
56
M1
9
Main histologisk type, †
Differentieret
25
Udifferentieret
40
lymfatisk invasion
LX
4
L0
35
L1
26
Venøs invasion
VX
4
V0
35
V1-2
26
† Nå eller moderat differentieret adenocarcinom og papillær adenocarcinom blev kategoriseret som differentieret type. Signet-ring celle karcinom, dårligt differentieret adenocarcinom og mucinøs adenocarcinom blev kategoriseret som udifferentieret type.
GFP-positive CTCs i perifert blod
Ved hjælp af en fluorescens mikroskop, celler med fluorescerende emissioner ≥2.85 × 10 7 betyder tilsvarende fluorokrom blev talt som GFP-positive celler
Forskellige størrelser af GFP-positive celler blev observeret i hver prøve.; Derfor var det vanskeligt at identificere en repræsentant celle blandt GFP-positive celler til sammenligning mellem patienter og raske frivillige. Derfor, for at undgå at bruge en arbitrær værdi, besluttede vi at bruge den optimale tærskelværdi afledt af ROC analyse baseret på cellestørrelse, dvs. 7,735 um, som tærskel for at definere GFP-positive CTCs (figur 3). Figur 3 Sammenligning af celle diameter mellem patienter og frivillige. For at bestemme den tærskel, vi sammenlignede diametre af celler fra gastrisk kræftpatienter og kontrolforanstaltninger ved ROC-analyse. Der var en signifikant forskel mellem mavens kræftpatienter og kontrollerne (p
< 0,001; arealet under kurven = 0,57; 95% konfidensinterval = 0,54-0,60)
Ved immunhistokemisk farvning hjælp af anti-EpCAM og. anti-CD45-antistoffer, bekræftede vi, at GFP-positive CTCs var EpCAM-positive og CD45-negative (figur 4). Figur 4 Eksempler på mikroskopiske billeder. Repræsentative billeder fra to mavekræft prøver af GFP-positive CTCs og immuncytokemisk analyse af anti-EpCAM- og anti-CD45-positive celler. Celler blev talt under anvendelse af et computerstyret fluorescensmikroskop ved en undersøger blindet til prøven status. Scale bar, 10 um.
Antallet af GFP-positive CTCs i perifere blodprøver er vist i figur 5. Der var ingen signifikant forskel blandt de detektionsrater af GFP-positive CTCs i prøverne repræsenterer hver kræft fase. Figur 5 Antal GFP-positive celler. Prikkerne er antallet af GFP-positive CTCs i patientprøver. Bunden og toppen af ​​kassen repræsenterer den nedre og øvre kvartiler, og båndet på tværs i feltet viser medianen. De nedre og øvre bjælker i enderne af whiskers viser den laveste datapunkt inden for 1,5 interkvartile intervaller af den laveste kvartil, og den højeste datapunkt inden for 1,5 interkvartile intervaller af den øvre kvartil hhv. De grønne søjler angiver middelværdi.
Foreningen af ​​GFP-positive CTCs med overlevelse
gennemsnitlige antal GFP-positive CTCs i prøverne fra 10 raske frivillige var 4,8. Vi delte patienterne i to grupper baseret på antallet af GFP-positive CTCs: 0-4 og ≥5. De klinisk-patologiske karakteristika for de to grupper er opsummeret i tabel 2. Der var ingen signifikant forskel mellem de to grupper, bortset fra at der var kun én kategori af lymfe metastasis.Table 2 klinisk-patologisk tegn i to patientgrupper efter antal CTCs
Antal CTCs
0 - 4
5 ≤
P Drømmeholdet værdi
Antal forsøgspersoner
41

24
TNM: Stage
0,1586
fase I
29
11
fase II
4
2
Trin III
4
6
trin IV
4
5
TNM: T kategori
0,2753
T1
26
10
T2
5
3
T3
5
4
T4
5
7
TNM: N kategori
0,0257 *
n0
27
12
N1
5
0
N2
4
2
N3
5
10
TNM: M kategori
0,2121
M0
37
19
M1
4
5
Main histologisk type,
0,6844
Differentieret typen
15
10
udifferentieret typen
26
14
lymfatisk invasion
0,3177
Lx
2
2
L0
25
10
L1
14
12
Venøs invasion
0,1293
Vx
2
2
V0
26
9
V1-2
13
13
Kirurgi
0,2124
helbredende resektion
38
19
Ikke-helbredende resektion
1
3
Ingen resektion
2
2
Postoperativ kemoterapi
0,1672
Presence
15
13
Fravær
26
11
* * Signifikant forskel.
Figur 6a viser Kaplan -Meier kurver for samlet overlevelse i de to grupper: patienter med 0-4 CTCs og dem med ≥5. Der var en signifikant forskel mellem de to grupper (p
= 0,0021). Endvidere i de avancerede mavecancerpatienter med stadie II-IV sygdom, var der en signifikant forskel mellem de to grupper (p
= 0,0126) (figur 6b). Figur 6 Samlet overlevelse. (A) Samlet overlevelse af alle patienter. (B) Samlet overlevelse af patienter med stadie II-IV sygdom. Overlevelse blev sammenlignet i forhold til antallet af CTCs vha Kaplan-Meier analyse og af log-rank statistik. ** P
< 0,01, * p
< 0.05.
Foreningen af ​​GFP-positive CTCs med patologiske indeks
Der var ingen signifikant sammenhæng mellem antallet af GFP-positive CTCs og kræft fase (p
= 0,2313) (figur 5). Selvom der ikke blev observeret nogen statistisk signifikans, antallet af GFP-positive CTCs havde tendens til at stige med progressionen af ​​den primære tumor (p
= 0,1521) (figur 7A). Antallet af CTCs i prøverne fra node-positive patienter var større end i node-negative patienter (p
= 0,1752) (figur 7b). Sammenlignet med patienter uden fjernmetastaser, dem med fjernmetastaser havde lignende antal GFP-positive CTCs (p Salg = 0,5655) (fig 7c). Der var ikke en signifikant forskel mellem den differentierede og udifferentierede type (p
= 0,8387) (Figur 7d). Antallet af CTCs var ens i prøverne fra patienter med og uden lymfatisk invasion (p
= 0,2054) (Figur 7e). For venøs invasion, at antallet af CTCs i prøverne fra patienter med invasionen var signifikant højere end hos patienter uden invasion (p
= 0,0351) (Figur 7f). Figur 7 Forholdet mellem antallet af GFP-positive CTCs i en 7,5 ml blodprøve fra gastrisk kræftpatienter og patologiske fund i patienterne. Prikkerne er antallet af GFP-positive CTCs i patientprøver. Bunden og toppen af ​​kassen repræsenterer den nedre og øvre kvartiler, og båndet på tværs i feltet viser medianen. De nedre og øvre bjælker i enderne af whiskers viser den laveste datapunkt inden for 1,5 interkvartile intervaller af den laveste kvartil, og den højeste datapunkt inden for 1,5 interkvartile intervaller af den øvre kvartil hhv. a, Tumor invasion dybde (T1-T4 indikerer stigende dybde). b lymfatisk metastaser (N0 = negativ, N1-3 = positiv). c, Distant metastaser (M0 = negativ, M1 = positiv). d, Histologisk type (differentieret type og udifferentieret type). e, lymfatisk invasion (L0 = negativ, L1 = positiv). f, Venøs invasion (V0 = negativ, V1 = positiv), * p
< 0,05. Selv om kun venøs invasion viste en statistisk signifikant forskel, der var nogle tendenser til en stigning i CTC nummer med stigende sygdomsprogression.
Diskussion
Dette papir rapporterer sammenhængen mellem CTCs og mavekræft, som er den anden hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan. Anvendeligheden af ​​påvisning af CTCs ved diagnose, estimering af prognose og evaluering af behandlingseffekt er allerede blevet rapporteret for bryst- [27, 33], prostata [34], lunge [35] og fordøjelseskanal [11, 36, 37 ] cancere. Denne undersøgelse viser, at det er også nyttigt for mavekræft. Salg One vigtigste resultat af vores undersøgelse var en signifikant sammenhæng mellem antallet af CTCs og prognose. Selvom vi brugte en kort opfølgningsperiode, prognosen for patienter, som havde ≥5 CTCs i deres 7,5-ml perifere blodprøver var dårlig. Patienter med tidlig fase sygdom generelt har en lavere recidiv rate [38], og dem med stadium I sygdom faktisk havde ingen gentagelse i vores undersøgelse. Vi beregnede også overlevelse i avancerede mavecancerpatienter med stadie II-IV sygdom, og viste, at disse patienter havde en lignende overlevelse mønster til dem med stadium I-IV sygdom. Disse resultater tyder på, at præoperativ kemoterapi eller omfattende behandling er passende for fremskreden sygdom patienter, der har mange CTCs i forbehandling prøver på grund af deres dårlig prognose.
Blandt vores patologiske fund, kun venøs invasion havde en signifikant sammenhæng med antallet af CTCs. Dette tyder aftale mellem traditionel patologi og moderne molekylær teknologi. Vi mener, at manglen på en væsentlig forskel mellem antallet af CTCs opdages af vores analyse og de andre patologiske indekser kan forklares med metodologiske spørgsmål som lille stikprøve. Vores teknik arbejdede godt som et prognostisk evaluering værktøj - til at give oplysninger om behovet for postoperativ adjuverende behandling - og det kan være et nyttigt hjælpeværktøj til patologi-baserede klassificering
Det er ikke klart, om alle registrerede CTCs har metastatisk potentiale.. Levedygtige CTCs blev fundet i prøverne fra tidlige stadier kræftpatienter i den foreliggende undersøgelse, men næsten alle gruppens patienter trin I overlevede uden recidiv [38]. Vi har til hensigt at bekræfte, om resistente cancerceller, ligesom cancer stamceller, var til stede i de detekterede GFP-positive celler. Også, vil vi analysere funktioner levedygtige CTCs individuelt efter celle sortering, og identificere CTCs med metastatisk potentiale ved hjælp af yderligere værktøjer såsom DNA ploidi analyse [39, 40]. Desuden vil genekspression profilering blandt levedygtige CTCs, døde celler, primære tumorer og metastatiske tumorer afslører vigtige oplysninger om de mekanismer i kræft metastaser.
Vores resultater skal fortolkes med en vis forsigtighed, overvejer begrænsningerne i denne undersøgelse. Det første er antallet af CTCs varierede meget mellem individer, herunder patienter og raske frivillige. Det blev desuden ikke påvirket af tumor stadie eller tilstedeværelsen af ​​klinisk påviselige metastaser. Ligeledes var der ingen sammenhæng mellem tilstedeværelsen af ​​metastaser (lymfeknude eller fjernt) eller invasion, og antallet af CTCs, som bringer spørgsmålet om anvendelsen af ​​CTCs at forudsige metastatisk potentiale. Det er imidlertid muligt, at den forholdsvis lille prøvestørrelse begrænset potentiale til at detektere reelle forskelle mellem disse grupper af patienter. Endelig må det erkendes, at vores resultater gælder kun for præoperativ, behandling-naive gastrisk kræft og bør ikke generaliseres til andre former for kræft.
Klart, flere undersøgelser i en større population af patienter, og med forskellige typer kræft er der behov for at afklare den kliniske anvendelighed CTC afsløring. Vi er nu ved at forberede en undersøgelse for at undersøge virkningerne af mavekræft behandling på antallet af CTCs, som skal bidrage til at etablere deres forhold til fremtidig sygdomsprogression og om CTC optælling kan hjælpe guidetherapy valg.
Konklusioner
Der var en signifikant forskel i overlevelse mellem patienter med 0-4 CTCs og dem med ≥5. Men det er uklart, om alle CTCs har sande metastatisk potentiale, og der er behov for yderligere undersøgelser.
Erklæringer
Tak
Denne forskning blev delvist understøttet af en Grant-in-Aid for udfordrende sonderende forskning (23659308) fra Japan Society for fremme af Science (JSP'er). Finansieringen krop spillet nogen rolle i undersøgelsen design; i indsamling, analyse eller fortolkning af data; i skrivning af manuskriptet; eller i beslutningen om at indsende manuskriptet til offentliggørelse. Vi er taknemmelige for alle de patienter og frivillige, der doneret blod til denne undersøgelse. Vi vil gerne takke professor Toshiyoshi Fujiwara (Okayama University Graduate School of Medicine, Okayama, Japan) for at levere nyttige kommentarer og forslag; Hr Yasuo Urata (Oncolys BioPharma, Tokyo, Japan) til forsyning af OBP-401; Dr. Yukio Tsujino, Dr. Toshiyuki Ozawa og Dr. Akinori Masago (Sysmex Corporation, Kobe, Japan) for deres hjælp og støtte; og Dr. Rebecca Devon (Genetics Unit og University of Edinburgh, Edinburgh, UK) for kritisk gennemgang og redigering af manuskriptet. Vi er også meget taknemmelige for klinisk personale.
Forfattere 'originale indsendte filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 12885_2012_3365_MOESM1_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 1 12885_2012_3365_MOESM2_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 2 12885_2012_3365_MOESM3_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 3 12885_2012_3365_MOESM4_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 4 12885_2012_3365_MOESM5_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 5 Alle forfattere har læst og godkendt den endelige manuskript.

• Terapeutisk potentiale PRL-3 målretning og kliniske betydning af PRL-3 genomisk forstærkning i gastrisk cancer
• Familie historie af kræft og gastroesophagale lidelser og risikoen for esophageal og gastriske adenokarcinomer: en case-kontrol study