Prognostiset vaikutus havaitsemiseksi elinkelpoisten kiertävien tuumorisolujen mahasyöpäpotilaista käyttämällä telomeraasia erityinen viruksen aine: tulevaisuutta koskeva tutkimus

Prognostiset vaikutus havaitsemiseksi elinkelpoisten kiertävien tuumorisolujen mahasyöpäpotilaista käyttämällä telomeraasia erityinen viruksen aine: ennakoiva tutkimus
tiivistelmä
tausta
tunnistaminen kiertävien tuumorisolujen (CTC) perifeerisen veren on hyödyllinen lähestymistapa arvioida ennusteen, seurata sairauden etenemistä, ja mitata hoidon vaikutuksia eri syöpäsairauksia. Kuitenkin kliininen merkitys CTC on kiistanalainen. Yritimme tunnistaa elinkelpoinen CTC perifeerisessä veressä mahalaukun syövän potilaiden käyttämällä telomeraasia tietyn viruksen ainetta.
Menetelmät
Otimme 7,5 ml verinäyte 65 käsittely-negatiivinen mahasyöpäpotilaista ennen leikkausta ja 10 tervettä vapaaehtoisia. Olemme havainneet elinkelpoinen CTC verinäytteissä inkuboinnin jälkeen ne telomeraasiestäjä-specific, replikointi-selektiivinen, onkolyyttisiä adenoviruksen ainetta kuljettavan vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) geenin (OBP-401). GFP-positiiviset CTC määriteltiin, joiden halkaisija on vähintään 7.735 um; tämä kynnys määritettiin vastaanotin toimii ominaiskäyrän analyysiä. GFP-positiiviset solut laskettiin fluoresenssimikroskoopilla.
Tulokset
oli merkitsevä ero kokonaiselossaoloaikaa keskuudessa potilailla, joilla on 0-4 ja ne, joilla ≥5 GFP-positiivisten CTC siinä vaiheessa I-IV sairaus ryhmä ja vaiheen II-IV edenneen taudin ryhmä. Lukumäärä GFP-positiivisten CTC ei liittynyt syövän vaiheessa. Niistä patologisia löydöksiä, määrä GFP-positiivisten CTC oli vain merkittävästi liittyvät laskimoiden invaasio, joskin suuntauksia kohti GFP-positiivisia CTC sairauden etenemiseen (kasvain syvyys, imusolmuke etäpesäke, etäpesäkkeiden, imusuonten invaasio, ja histologinen tyyppi ).
päätelmät
oli merkittävä suhde GFP-positiivisia CTC ja elinaika potilailla, mahalaukun syöpä. Havaitseminen CTC käyttäen OBP-401 voi olla hyödyllinen ennustetekijöiden arviointiin. Trial rekisteröinti Tampereen Hospital Medical Information Network Japanissa, UMIN000002018.
Avainsanat
Kiertävä kasvainsolujen Mahasyöpää Telomerase Background
Kaukaiset etäpesäke kiinteän kasvaimen on vahva ennustetekijä [1-3]. Olemassaolo verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) perifeerisen veren viittaa siihen, että potilas on systeeminen sairaus vaihe [4]. Tunnistaminen CTC perifeerisen veren on hyödyllinen lähestymistapa arvioida ennusteeseen, tarkkailla taudin etenemistä, ja mitata hoidon vaikutuksia rinta-, eturauhas-, iho, paksusuoli ja ruoansulatuskanavan syöpäsairauksia. Näin ollen erilaisia ​​menetelmiä on kehitetty havaitsemiseksi CTC, ja niitä käytetään joskus yhdistelmänä. Yhteiset tekniikoita rikastamiseen ja havaitseminen CTC ovat tiheys gradienttierottelua [5], suora rikastus suodattamalla [6, 7] immu- erottelu [8], virtaussytometria [9], reaaliaikainen RT-PCR (RT PCR) [10, 11], ja mikrosirun teknologia [12].
Cell rikastamiseen tiheysgradienttisentrifugoinnilla erottaminen suoritetaan käyttäen kaupallisia sarjat kuten OncoQuick® (Greiner, Frickenhausen, Saksa) [13] ja Lymphoprep® (Nycomed, Oslo , Norja) [14]. Tiheysgradientti erottaminen perustuu teoriaan, että eri solut voidaan erottaa niiden tiheyden mukaisesti. Näin ollen on vaikea poimia kaikki CTC koska solumigraation. RT-PCR: llä on yksi yleisimpiä menetelmiä tuumorisolujen havaitsemiseksi, koska se on suuri herkkyys ja spesifisyys, olettaen riittävän alukkeen ja koettimen suunnittelua. Kuitenkin vääriä positiivisia tuloksia voi ilmetä, koska sen teknisen herkku ja herkkyys [15, 16].
Immunomagneettihelmiä solurikastukseen, kuten suorittama CellSearch System® (Veridex, LLC, Raritan, NJ, USA) [ ,,,0],17], on tällä hetkellä yleisimmin käytetty tekniikka rikastuttaa ja havaita CTC [18-21]. Se etu, että immu- solujen erottaminen on, että CTC voidaan visualisoida fluoresenssimikroskoopilla. Solut havaittiin vasta-aineita epiteelin markkereita (epiteelisolujen adheesiomolekyylien; EpCAMs) ovat päättäneet olla CTC. Näin ollen, tämä tekniikka voi tarjota vääriä positiivisia tuloksia, jotka perustuvat normaaliin epiteelin markkerin ekspressiota ei-kasvainsoluja, ja väärien negatiivisten tulosten voi syntyä perustuu puute selektiomarkkeri ilmentymisen kasvainsoluissa. Seurauksena liittyvät rajoitukset yllä lähestymistavat, uusi tekniikka on tarpeen havaita elinkelpoisia CTC tarkasti.
Telomerase on merkittäviä rooleja karsinogeneesissä, syövän invaasio ja metastaasi [22-24]. Olemme kehittäneet tekniikan hyödyntämistä korkea telomeraasiaktiivisuus soluissa. Tämä tekniikka käyttää telomeraasiestäjä-specific, replikaation selektiivinen modifioitu virus agent (OBP-401; TelomeScan®, Oncolys BioPharma, Tokio, Japani), jossa ihmisen telomeraasin käänteistranskriptaasin (tert
) geenin promoottori insertoidaan E1-alueella ja vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) geeni asetetaan valvontaan sytomegaloviruksen promoottorin E3-alueen markkerina virusreplikaation [25]. On raportoitu, että OBP-401 voidaan käyttää havaitsemaan elinkelpoisia CTC joukossa normaali veren soluihin [26, 27].
Täällä käytetään määrityksessä havaita elinkelpoisia CTC jolla on kyky etäpesäkkeiden mahalaukun syöpäpotilailla. Havaitsimme GFP-positiivisia CTC. Sen sijaan on mahdollista, että ei-syöpäsolujen emittoivat GFP fluoresenssiä OBP-401-infektion hoitoon [28]. Siksi me valitut solut suurempi kuin kynnys määritetään vertaamalla terveillä ja potilaille, koska CTC ovat suurempia kuin normaalit verisolujen [7, 29, 30]. Tutkimme yhdistys GFP-positiivisten CTC numero selviytymisen ja patologinen indeksit taudin etenemisestä. Tool Menetelmät
Potilaiden ja terveiden vapaaehtoisten
potilaiden mukana tässä alustavassa tutkimuksessa olivat parhaillaan suunnitellaan leikkaushoitoa; potilailla, jotka olivat sopivia endoskooppiset limakalvon resektio tai endoskooppinen limakalvon alaista leikkelyn suljettiin pois. Sisällyttäminen olivat: (i) histologisesti todistettu adenokarsinooman mahan endoskooppinen biopsia; (Ii) kliininen yksinäinen kasvain; (Iii) ei ole aiempaa endoskooppiset resektio, kemoterapia tai sädehoito; (Iv) ikä 20-80 vuotta; (V) Eastern Cooperative Oncology Group suorituskykyluokan [31] 0 tai 1; (Vi) riittävät elintoiminnot; ja (vii) kirjallinen tietoon perustuvan suostumuksen. Poissulkukriteerit olivat: (i) synkroninen tai metachronous pahanlaatuisiksi; (Ii) raskaana olevat tai imettävät naiset; (Iii) aktiivinen tai krooninen virushepatiitti; (Iv) aktiivinen bakteeri- tai sieni-infektio; (V) diabetes mellitus; (Vi) systeemisesti kortikosteroidit; ja (vii) epävakaa verenpainetauti. Tauti vaiheessa potilailla oli patologisesti tunnusomaista käyttäen seitsemäs painos TNM luokittelu International Union syöpää vastaan ​​[32]. Syvyys kasvain kolmella potilaalla ilman gastrectomy ja alueellisen imusolmuke tilan viidestä potilaasta ilman riittäviä imusolmukkeiden diagnosoitiin kirurgisesti.
Kaikki potilaat osallistuivat meidän sairaalassa säännöllisesti leikkauksen jälkeen, ja tarkastettiin 3 kuukauden välein. Potilaat myös tehtiin tähystys ja tietokonetomografiaa vähintään kerran vuodessa, mukaan heidän sairautensa vaiheessa ja kurssi.
Myös rekrytoidaan terveillä vapaaehtoisilla toimimaan valvontaa. Kaikki terveet vapaaehtoiset olivat työntekijöitä Sysmex Corporationin ja mukana seitsemän miestä (keski-ikä 31,4 vuotta, vaihteluväli 24-39 vuotta) ja kolme naista (keski-ikä 33,7 vuotta, vaihteluväli 26-48 vuotta). Kaikki vapaaehtoiset kävivät lääkärintarkastuksiin upon työpaikkojen ja vuosittain; lääkärintarkastuksia mukana lääketieteen haastatteluja, kuuntelu, rintakehän röntgenkuvat, ja veren ja virtsan analyyseihin. Lisäksi teimme yksittäisiä haastatteluja ennen näytteen keräämistä; tahansa vapaaehtoinen joka oli juuri vastaanottaa sairaanhoidon, raskaana olevat tai imettävät, tai jotka olivat luovutetusta verestä viimeisen kuukauden suljettiin pois.
Virus
OBP-401, telomeraasiestäjä-specific, replikointi-selektiivinen adenoviruksen aine, jossa TERT
promoottorielementti ohjaa ekspressiota EIA
ja EIP
geenejä, ja johon GFP-geeni on integroitu, käytettiin tässä tutkimuksessa. Herkkyys ja spesifisyys käyttäen OBP-401 on tutkittu aiemmin Kim et al. [27]. Koe toistettiin viisi kertaa testata näytteessä, mukaan lukien 1 MDA-MB-468 (rintasyöpä) soluja ja 7,5 ml verta, ja numerot GFP-positiivisia soluja oli 1, 1, 1, 2 ja 3; näytteessä, kuten 20 MDA-MB-468 (rintasyöpä) soluja, numerot GFP-positiiviset solut 15, 17, 19, 22 ja 24 Viral näytteitä säilytettiin -80 ° C: ssa.
Solulinjat ja kulttuuri
A549 (keuhkokarsinooma), HepG2 (hepatosellulaarinen karsinooma), HEC-1 (kohdun limakalvon adenokarsinooma), KATO III (mahasyöpä) ja SBC-3 (pienisoluinen keuhkosyöpä) solulinjoja saatiin Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japani). LNCaP (eturauhanen adenokarsinooma) ja OVCAR-3 (munasarjasyövän) solulinjat saatiin Riken Cell Bank (Tokio, Japani). Soluja viljeltiin mukaan myyjän tiedot. MDA-MB-468-soluja viljeltiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [27].
Näytteiden valmistus ja solujen laskenta
7,5 ml ääreislaskimoon otettiin verinäyte kunkin potilaan ennen leikkausta ja kunkin vapaaehtoisen. Näytteet vedettiin putkiin, jotka sisältävät sitruunahappoa, fosforihappoa, ja dekstroosi, ja säilytettiin 4 ° C: ssa. Määritys aloitettiin 48 tunnin sisällä.
Näytteitä sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 540 g ja plasma faasi poistettiin. Sitten solut pestiin neljä kertaa fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kaksi kertaa Roswell Park Memorial Institute väliaineessa. Näytteet infektoitiin 4 x 10 8 plakkia muodostavaa yksikköä (PFU) ja OBP-401 viruksia inkubaatio väliaineessa 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa.
Jälkeen kuolleiden solujen värjäytyminen punainen fluoresoiva reaktiivinen väriaine L23102 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA), OBP-401 virukset olivat inaktivoituja ja solut kiinnitettiin 2% paraformaldehydillä (PFA) ja 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa.
näytteet käsiteltiin pinta-aktiivisten agentti (Emalgen 2025 G; Kao Chemicals, Tokio, Japani) 10 min 40 ° C: hajottamaan punasoluja. Lopuksi, 7,5 ml verta käytetään luomaan kaksi lasilevyllä näytteiden mikroskooppinen analyysi. Kaikki GFP-positiivisten solujen kaksi dioja laskettiin käyttäen tietokoneohjattu fluoresenssimikroskoopilla (IX71, Olympus, Tokio, Japani) ja tutkijan sokaissut näytteeseen yksityiskohtia. Yhteenlaskettu määrityksen aika oli 27,5 tuntia (kuvio 1). Kuvio 1 pöytäkirja ja menettely "GFP-CTC Assay". Kukin 7,5 ml: n ääreislaskimoon otettiin verinäyte potilailta ennen leikkausta ja vapaaehtoisilta. Näytteet vedettiin putkiin, jotka sisältävät sitruunahappoa, fosforihappoa ja dekstroosi. Näytteet sentrifugoitiin, ja plasma faasi poistettiin. Sen jälkeen solu pesun PBS ja Roswell Park Memorial Institute välineellä näytteet tartutettiin 4 × 108 PFU OBP-401 virus. OBP-401 virus oli passiivinen ja solut kiinnitettiin 2% paraformaldehydillä (PFA). Näytteet käsiteltiin pinta-aktiivisen aineen hajoaminen punaisia ​​ja valkoisia verisoluja. Kaksi lasilevyllä näytettä 7,5 ml verta valmistettiin mikroskooppista analyysiä. Kaikki GFP-positiivisten solujen kaksi diaa laskettiin käyttämällä tietokone-ohjattu fluoresenssimikroskoopilla.
Määrittäminen GFP fluoresenssi-intensiteetin raja
kynnys GFP fluoresenssi-intensiteetti määritettiin seuraavasti. Noin 30000 viljellyt solut oli lisätty 7,5 ml: n verinäytteitä terveistä vapaaehtoisista, jotka oli terästetty eri syöpäsolulinjoissa: A549, HepG2, HEC-1, KATO III, SBC-3, LNCaP, MDA-MB-MB468 ja OVCAR -3. Verinäytteet alistettiin CTC detektiomäärityksessä, ja sitten havaittavissa solut laskettiin fluoresenssimikroskopialla. Yli 100 solua analysoitiin kussakin näytteessä. Määritimme 2,85 x 10 7 tarkoittaa vastaava fluorokromista olla kynnys GFP-signaalin intensiteettiä minimaalinen GFP intensiteetin taso havaittiin verinäytteiden piikkeinä solulinjoista (kuvio 2). Tiedot ilmoitetaan numerot GFP-positiivisten CTC per 7,5 ml: n perifeerisen veren näytettä. Kuvio 2 GFP-signaali-intensiteetit eri syöpäsolulinjoissa. Pohja- ja laatikon ovat alhaisemmat ja yläkvartiilit, ja bändi laatikko on mediaani. Linjat päähän viikset ovat minimi ja maksimi. Y-akseli edustaa GFP-signaalin intensiteetin log mittakaavassa.
Immunovärjäys
fykoerytriini-leimatun anti-ihmis-CD45-vasta-ainetta (BioLegend, San Diego, CA, USA) laimennettiin 1: 5 ja Pacific Blue-leimatun anti-ihmis- CD326 (EpCAM) vasta-aine (BioLegend) laimennettiin 1:10 PBS: ssä, joka sisälsi 2% naudan sikiön seerumia. Soluja inkuboitiin laimennettiin vasta-aineita 30 min ajan 25 ° C: ssa. PBS-pesun jälkeen, joka sisälsi 2% naudan sikiön seerumia, solut asetettiin lasilevyille ja analysoitiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (IX71, Olympus).
Tilastollinen analyysi
Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen JMP Statistical Discovery 9.0.2 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Määrittää solun halkaisijan raja-arvon, havaittu GFP-positiivisia CTC analysoitiin käyttäen toimivan vastaanottimen (ROC) käyrä näytteiden välillä mahalaukun syövän potilaille ja niille vapaaehtoisilta. Useiden ryhmä vertailuja, varianssin homogeenisuudesta arvionsa Levene testi. Parametristen vertailuja käytimme varianssianalyysi, ja ei-parametriset vertailuja käytimme Wilcoxonin ja Kruskal-Wallisin testejä. Käytimme Fisherin ja χ
2 koetta, joissa 2 × 2 ja 4 × 2 taulukon vastaavasti verrata kliinis merkkiä potilasryhmässä. Kaplan-Meier käyrät arvioitu tautivapaan elinajan ja kokonaiselossaolo syntyi, ja vertailut ryhmien kesken suoritettiin käyttäen kaksipuolista log-rank-testi. P
arvot ≤0.05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.
Tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board of Showa yliopiston, Pohjois-Yokohama sairaala. Selitimme tutkimusprotokollan potilaille ja vapaaehtoisille, ennen kuin he antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksen. Tämä tutkimus on rekisteröity yliopiston Hospital Medical Information Network Japanissa, numero 000002018.
tulokset
Osallistuja ominaisuudet
Kuusikymmentäviisi mahalaukun adenokarsinoomaa sairastavien potilaiden (46 miestä ja 19 naista, keski-ikä 58,8 vuotta, vaihteluväli 33 -76 vuotta), joille leikkaus on Digestive Disease Center of Showa yliopiston Northern Yokohama sairaalan välillä syyskuuta 2009 toukokuu 2011 olivat mukana tässä tutkimuksessa. Kaksikymmentäyhdeksän oli distaalinen gastrectomy, 32 oli yhteensä gastrectomy, ja neljä oli valmisteleva laparotomy. Potilaiden ominaisuudet on esitetty taulukossa 1. Kaksikymmentäneljä kahdeksan 65 potilaat saivat kemoterapiaa leikkauksen jälkeen. Vertailuryhmä koostui 10 tervettä volunteers.Table 1 Potilaan ominaisuuksista ja patologiset löydökset
parametrit
numerot potilaiden
Sukupuoli
Mies
46
Female
19
Ikä (keskiarvo, alue) B 58,8, 33-76
gastrectomy
Distal
29
Yhteensä
32
yhtään
4
Kirurginen lähestymistapa
Laparoskopia
54
Open laparotomiaa
11
Kovetettavuus
R0
57
R1
0
R2
8
TNM Stage
I
40
II
6
III
10
IV
9
Kasvainten syvyys invaasion
T1
36
T2
8
T3
9
T4
12
Imusolmuke etäpesäke
N0
39
N1
5
N2
6
N3
15
etäpesäkkeiden
M0
56
M1
9
Main histologinen tyyppi †
Differentiated
25
eriyttämätön
40
Lymphatic invaasio
LX
4
L0
35
L1
26
Laskimoperäiset invaasio
VX
4
V0
35
V1-2
26
† No tai kohtuullisesti erilaistunut adenokarsinooma ja papillaarinen adenokarsinooma luokiteltiin eriytetty tyyppi. Signet-rengas cell carcinoma, huonosti eriytetty adenokarsinooma ja mucinous adenokarsinooma luokiteltiin erilaistumaton tyyppi.
GFP-positiivisten CTC perifeerisen veren
käyttäminen fluoresenssimikroskoopilla, solut loisteputki päästöjä ≥2.85 × 10 7 tarkoittaa vastaavaa fluorokromi laskettiin GFP-positiivisten solujen.
erikokoisia GFP-positiivisia soluja havaittiin kussakin näytteessä; Siksi oli vaikea tunnistaa yhden edustajan solun joukossa GFP-positiivisten solujen väliset vertailut potilaiden ja terveiden vapaaehtoisten. Näin ollen, välttää käyttämällä mielivaltaista arvoa, päätimme käyttää optimaalista raja johdettu ROC-analyysi, joka perustuu solun kokoon, eli 7,735 um, koska kynnysarvo määrittää GFP-positiivisia CTC (kuvio 3). Kuva 3 vertailu solun halkaisija potilaiden välillä ja vapaaehtoisia. Määrittää kynnys, vertasimme halkaisijat solujen mahalaukun syöpäpotilaiden ja valvontaa ROC analyysi. Oli merkitsevä ero mahasyövän potilaiden ja (p
< 0,001; AUC = 0,57; 95% luottamusväli = 0,54-0,60).
Immunohistokemiallisella värjäyksellä käyttäen anti-EpCAM ja anti-CD45-vasta-aineita, olemme vahvistaneet, että GFP-positiivisia CTC olivat EpCAM-positiivisia ja CD45-negatiivinen (Kuva 4). Kuva 4 Esimerkkejä mikroskooppikuvia. Kuvat ovat kahdesta mahasyöpä näytettä GFP-positiivisten CTC ja immunosytokemiallisessa analyysi anti-EpCAM- ja anti-CD45-positiivisia soluja. Solut laskettiin käyttäen tietokoneohjattua fluoresenssimikroskooppiin 'tutkinnon sokaissut näytteeseen tilan. Asteikko bar, 10 um.
Numerot GFP-positiivisten CTC perifeerisen veren näytteet on esitetty kuviossa 5. Ei ollut mitään merkittävää eroa joukossa havaitseminen hinnat GFP-positiivisten CTC näytteissä, jotka edustavat kunkin syövän vaiheessa. Kuva 5 lukumäärä GFP-positiivisten solujen. Pisteet ovat numerot GFP-positiivisten CTC potilaan näytteissä. Pohja- ja laatikon edustaa alempaa ja yläkvartiilit, ja bändi poikki ruudussa näkyy mediaani. Alempi ja ylempi baareja päissä viikset merkitty alin datapiste 1,5 kvartiiliväliä of alakvartiili, ja korkein datapiste 1,5 kvartiiliväliä on yläkvartiili, vastaavasti. Vihreät palkit osoittavat keskiarvon.
Association of GFP-positiivisten CTC pelastautumiskoulutukseen
keskimääräinen lukumäärä GFP-positiivisten CTC näytteissä 10 terveillä vapaaehtoisilla oli 4,8. Jaoimme potilaat kahteen ryhmään perustuen määrästä GFP-positiivisten CTC: 0-4 ja ≥5. Kliinis ominaisuudet kaksi ryhmää on yhteenveto taulukossa 2. Ei ollut mitään merkittävää eroa näiden kahden ryhmän välillä, mutta siinä oli vain yksi luokka, imusuonten metastasis.Table 2 kliinis merkkiä kahden potilaan ryhmien määrä CTC
lukumäärä CTC
0-4
5 ≤
P
arvo
määrä aiheita
41

24
TNM: Stage
0,1586
vaihe I
29
11
Stage II
4
2
Stage III
4
6
Vaihe IV
4
5
TNM: T-luokan
0,2753
T1
26
10
T2
5
3
T3
5
4
T4
5
7
TNM: N-luokan
0,0257 *
N0
27
12
N1
5
0
N2
4
2
N3
5
10
TNM: M-luokan
0,2121
M0
37
19
M1
4
5
Main histologinen tyyppi
0,6844
Differentiated tyyppi
15
10
eriyttämätön tyyppi
26
14
Lymphatic invaasio
0,3177
Lx
2
2
L0
25
10
L1
14
12
Laskimoperäiset invaasio
0,1293
Vx
2
2
V0
26
9
V1-2
13
13
Surgery
0.2124
parantava resektio
38
19
kuin parantava resektio
1
3
Ei resektio
2
2
Leikkauksen jälkeinen kemoterapia
0,1672
Presence
15
13
Absence
26
11
* * Merkittävä ero.
kuvassa 6a Kaplan -Meier -käyrät kokonaiseloonjäämiselle näissä kahdessa ryhmässä: potilaiden 0-4 CTC ja ne, joilla ≥5. Oli merkitsevä ero kahden ryhmän välillä (p
= 0,0021). Lisäksi kehittyneen mahasyövän potilailla, joilla on vaiheen II-IV sairaus, oli merkittävä ero näiden kahden ryhmän välillä (p
= 0,0126) (kuvio 6b). Kuva 6 Kokonaiselossaoloaika. (A) Kokonaiselossaoloaika kaikista potilaista. (B) Kokonaiselossaoloaika potilailla, joilla on vaiheen II-IV sairaus. Survival verrattiin mukaan lukumäärän CTC käyttämällä Kaplan-Meier-analyysi ja log-rank tilastoja. ** P
< 0.01, * p
< 0,05.
Association of GFP-positiivisten CTC patologisen indeksien
ei ollut merkitsevää suhdetta GFP-positiivisten CTC ja syövän vaiheessa (p
= 0,2313) (kuvio 5). Vaikka ei ole tilastollista merkitsevyyttä ei havaittu, määrä GFP-positiivisten CTC taipumus kasvaa etenemisen primaarikasvaimen (p
= 0,1521) (kuvio 7a). Määrä CTC näytteissä solmusta-positiivisista potilaista oli suurempi kuin, että solmu-negatiivisten potilaiden (p
= 0,1752) (kuvio 7b). Verrattuna potilaisiin ilman etäispesäkkeitä, joilla on etäispesäkkeitä ollut samanlaisia ​​määriä GFP-positiivisten CTC (p
= 0,5655) (kuvio 7c). Ei ollut merkittävää eroa eriytetty ja erilaistumaton tyyppi (p
= 0,8387) (kuvio 7d). Lukumäärät CTC olivat samanlaisia ​​näytteissä potilailta ja ilman imusuonten invaasio (p
= 0,2054) (kuvio 7e). Laskimoiden invaasio määrä CTC näytteissä potilailta, joilla hyökkäys oli merkittävästi suurempi kuin potilailla, joilla ei invaasio (p
= 0,0351) (kuvio 7f). Kuva 7 suhde GFP-positiivisten CTC on 7,5 ml: n verinäyte mahasyöpäpotilaista ja patologiset löydökset potilailla. Pisteet ovat numerot GFP-positiivisten CTC potilaan näytteissä. Pohja- ja laatikon edustaa alempaa ja yläkvartiilit, ja bändi poikki ruudussa näkyy mediaani. Alempi ja ylempi baareja päissä viikset merkitty alin datapiste 1,5 kvartiiliväliä of alakvartiili, ja korkein datapiste 1,5 kvartiiliväliä on yläkvartiili, vastaavasti. a, Kasvaimen invaasio syvyys (T1-T4 osoittavat Syvenevää). b, Lymphatic etäpesäkkeitä (N0 = negatiivinen, N1-3 = positiivinen). c, etäpesäkkeiden (M0 = negatiivinen, M1 = positiivinen). d, histologinen tyyppi (eriytetty tyyppi ja erilaistumaton tyyppi). e, Lymphatic invaasiota (L0 = negatiivinen, L1 = positiivinen). f, Laskimoiden invaasiota (V0 = negatiivinen, V1 = positiivinen), * p
< 0,05. Vaikka vain laskimoiden invaasio näytetään tilastollisesti merkitsevä ero oli joitakin suuntauksia kohti kasvu CTC määrän kasvaessa taudin etenemiseen.
Keskustelua
Seuraavassa käsitellään korrelaatio CTC ja mahasyövän, joka on toiseksi suurin syy syöpään liittyvä kuolema maailmanlaajuisesti. Hyödyllisyys havaitsemista CTC diagnosoinnissa, arviointi ennuste, ja arviointi hoidon vaikutuksia on jo raportoitu rintasyövän [27, 33], eturauhas- [34], keuhko [35] ja ruoansulatuskanavan [11, 36, 37 ] syöpiä. Tämä tutkimus osoittaa, että se on hyödyllinen myös mahasyövässä.
Yksi merkittävä tulos meidän tutkimus oli merkittävä suhde määrää CTC ja ennuste. Vaikka käytimme lyhyen seuranta-ajan, ennusteen potilailla, joilla oli ≥5 CTC niiden 7,5 ml aäreisverinäytteiden huono. Potilaat, joilla on varhaisen vaiheen tauti on yleensä alhaisempi toistumisen määrä [38], ja ne, joilla vaiheen I sairaus oikeastaan ​​ei ole toistuvuutta tutkimuksessamme. Olemme myös laskettu eloonjäämismahdollisuus pitkälle mahasyöpäpotilaista vaiheen II-IV sairaus, ja osoitti, että näillä potilailla oli samanlainen selviytymisen malli kuin vaiheen I-IV sairaus. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ennen leikkausta kemoterapiaa tai kokonaisvaltaista hoitoa sopii edenneen taudin potilaille, joilla on monia CTC esikäsittelyn näytteitä, koska niiden huonon ennusteen.
Joukossa patologisia löydöksiä, vain laskimoiden invaasio oli merkittävä suhde määrää CTC. Tämä viittaa välisen perinteisen patologian ja modernia molekyyli teknologia. Uskomme, että puute on merkittävä ero määrän CTC havaita määrityksessä, ja toinen patologinen indeksit voidaan selittää metodeista kuten pieni otoskoko. Meidän tekniikka toimi hyvin ennustetyövälineenä arviointityökalu - antaa tietoa tarpeesta leikkauksen jälkeisen adjuvanttihoito - ja se saattaa tarjota hyödyllisen puhkaista patologian-luokituksessa.
Ei ole selvää, onko kaikki havaitut CTC on etäpesäkkeitä potentiaalia. Elinkelpoisia CTC havaittiin näytteissä alkuvaiheen syöpäpotilaiden tässä tutkimuksessa, mutta lähes kaikki vaiheessa I ryhmä eloonjäämistä uusiutumatta [38]. Aiomme vahvistaa, onko resistenttejä syöpäsoluja, kuten syövän kantasoluja, olivat läsnä havaittiin GFP-positiiviset solut. Lisäksi analysoi toiminnot elinkelpoisten CTC yksilöllisesti jälkeen solujen lajittelun, ja tunnistaa CTC metastasoitunutta potentiaalia käyttää muita välineitä, kuten DNA ploidia analyysi [39, 40]. Lisäksi geenien ilmentymisen profilointi keskuudessa elinkelpoinen CTC, kuolleita soluja, ensisijainen kasvaimia, ja etäpesäkkeitä paljastavat tärkeitä tietoja, jotka liittyvät mekanismit syövän etäpesäkkeiden.
Tuloksemme on tulkittava varoen, kun otetaan huomioon rajoitukset tämän tutkimuksen. Ensinnäkin määrä CTC vaihtelivat suuresti yksilöiden välillä, mukaan lukien potilaat ja terveillä vapaaehtoisilla. Lisäksi ei vaikuttanut kasvaimen vaiheesta tai läsnä on kliinisesti havaittavissa etäpesäkkeitä. Vastaavasti, ei ollut yhdistyksen välillä läsnäolo etäpesäkkeitä (imusolmuke tai kaukana) tai invaasion ja määrä CTC, joka tuo kyseenalaiseksi käyttöä CTC ennustaa metastaattista potentiaalia. On kuitenkin mahdollista, että suhteellisen pieni näytteen koko rajoitti mahdollisuuksia havaita todellisia eroja näissä potilasryhmissä. Lopuksi on todettava, että tuloksemme ovat vain sovellettavissa ennen leikkausta, hoitamattomilla mahasyövän ja ei pidä yleistää muihin syöpätyyppeihin.
Selvää, lisää tutkimuksia suuremmassa potilasjoukossa, ja eri tyyppisten syöpien , tarvitaan selventämään kliininen sovellettavuus CTC havaitsemiseen. Olemme nyt valmistelemassa tutkimusta vaikutusten tutkimiseksi mahalaukun syövän hoidossa määrästä CTC, jonka pitäisi auttaa luomaan suhdettaan tuleviin taudin etenemistä ja siitä CTC määrä voi auttaa guidetherapy valinta.
Johtopäätökset
Oli merkittävää eroa potilaiden välillä 0-4 CTC ja ne, joilla ≥5. On kuitenkin epäselvää, onko kaikilla CTC on tosi metastaattista potentiaalia, ja tarvitaan lisätutkimuksia.
Julistukset
Kiitokset
tutkimus tukee osittain Grant-in-tuki Haastava kartoittava tutkimus (23659308) alkaen Japan Society for Promotion of Science (JSPS). Rahoittajan ollut mitään osuutta tutkimuksen suunnittelu; keräämiseen, analysointiin, tai tietojen tulkintaa; kirjoittamisessa käsikirjoituksen; tai päätös jättää käsikirjoituksen julkaistavaksi. Olemme kiitollisia kaikille potilaille ja vapaaehtoisille, jotka luovutetun veren tämän tutkimuksen. Haluaisimme kiittää professori Toshiyoshi Fujiwara (Okayama University Graduate School of Medicine, Okayama, Japani) tarjota hyödyllisiä kommentteja ja ehdotuksia; Mr Yasuo Urata (Oncolys BioPharma, Tokio, Japani) syöttämiseksi OBP-401; Dr Yukio Tsujino, tohtori Toshiyuki Ozawa ja tohtori Akinori Masago (Sysmex Corporation, Kobe, Japan) heidän hyödyllistä tukea; ja tohtori Rebecca Devon (genetiikan yksikkö ja University of Edinburgh, Edinburgh, UK) kriittisen tarkastelun ja muokkauksen käsikirjoituksen. Olemme myös kiitollisia kliininen henkilökunta.
Kirjoittajien alkuperäinen toimitti asiakirjat kuville
Alla linkkejä kirjoittajien alkuperäiset toimitti asiakirjat kuville. 12885_2012_3365_MOESM1_ESM.tiff Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 1 12885_2012_3365_MOESM2_ESM.tiff Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 2 12885_2012_3365_MOESM3_ESM.pdf Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 3 12885_2012_3365_MOESM4_ESM.pdf Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 4 12885_2012_3365_MOESM5_ESM.tiff Kirjoittajien alkuperäisen tiedoston luku 5 Kaikki kirjoittajat lukenut ja hyväksynyt lopullinen käsikirjoitus.

• Terapeuttinen potentiaali PRL-3 kohdentamista ja kliininen merkitys PRL-3 genomivahvistuksen mahasyövän
• Suvussa syövän ja ruokatorven häiriöt ja ruokatorven ja mahalaukun adenokarsinooman: tapaus-control study