Prognostische Bedeutung der Erfassung tragfähige zirkulierenden Tumorzellen in Magenkrebs-Patienten unter Verwendung eines Telomerase-spezifische Virusmittel: eine prospektive Studie

Prognostische Bedeutung der Erfassung tragfähige zirkulierenden Tumorzellen in Magenkrebs-Patienten unter Verwendung eines Telomerase-spezifische Virusmittel: eine prospektive Studie
Zusammenfassung
Hintergrund
Die Identifizierung von Tumorzellen (CTCs) im peripheren Blut zirkulierenden ist ein nützlicher Ansatz abzuschätzen Prognose, Krankheitsverlauf zu überwachen und Behandlungseffekte in verschiedenen malignen Erkrankungen zu messen. Allerdings klinische Relevanz von CTCs ist umstritten. Wir haben versucht, zu tragfähigen CTCs im peripheren Blut von Patienten mit Magenkrebs erkennen eine Telomerase-spezifische virale Mittel verwendet wird.
Methoden
Wir haben eine 7,5-ml-Blutprobe von 65 behandlungs negativen Magenkrebs-Patienten vor der Operation und 10 gesunden Freiwillige. Wir haben festgestellt tragfähige CTCs in den Blutproben nach ihnen mit einem Telomerase-spezifischen, Replikation selektive, onkolytische Adenovirus Mittel Inkubation des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Gen (OBP-401) trägt. GFP-positive CTCs wurden als mit einem Durchmesser von mindestens 7,735 &mgr; m definiert ist; Dieser Schwellenwert wurde durch receiver operating characteristic Kurvenanalyse bestimmt. GFP-positive Zellen wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop gezählt.
Ergebnisse
Es gab einen signifikanten Unterschied in der Gesamtüberlebenszeit unter den Patienten mit 0-4 und die mit ≥5 GFP-positiven CTCs in der Phase I-IV Krankheitsgruppe und Phase II-IV fortgeschrittenen Krankheitsgruppe. Die Anzahl der GFP-positiven CTCs war zu Krebsstadium nicht verwandt. Unter den pathologischen Befunden, wurde die Anzahl der GFP-positiven CTCs nur wesentlich zur venösen Invasion Zusammenhang, auch wenn es Trends hin zu mehr GFP-positiven CTCs mit Fortschreiten der Krankheit waren (Tumortiefe, Lymphknotenmetastasen, Fernmetastasen, lymphatische Invasion und histologischen Typ ).
Schlussfolgerungen
Es gibt eine signifikante Beziehung zwischen der Anzahl der GFP-positiven CTCs und das Gesamtüberleben bei Patienten mit Magenkrebs war. Der Nachweis von CTCs OBP-401 verwendet, kann für prognostische Bewertung nützlich sein.
Test Registrierung
University Hospital Medical Information Network in Japan, UMIN000002018.
Schlüsselwörter Zirkulierende Tumorzellen Magenkrebs Telomerase Hintergrund
Fernmetastasen eines soliden Tumors ist ein starker prognostischer Faktor [1-3]. Das Vorhandensein von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) im peripheren Blut legen nahe, dass ein Patient in einer systemischen Erkrankung Phase ist [4]. Die Identifizierung von CTCs im peripheren Blut ist ein nützlicher Ansatz Prognose abzuschätzen, den Krankheitsverlauf zu überwachen und Behandlungswirkungen in Brust, der Prostata, der Haut, des Dickdarms und gastrointestinalen Malignitäten messen. Daher wurden verschiedene Verfahren entwickelt CTCs zu erfassen, und in Kombination gelegentlich verwendet werden. Gemeinsame Techniken zur Anreicherung und Detektion von CTCs sind Dichtegradiententrennung [5], direkte Anreicherung durch Filtration [6, 7], immunomagnetischer Trennung [8], Durchflusszytometrie [9], Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT- PCR) [10, 11], und Mikrochip-Technologie [12].
Zellanreicherung durch Gradienten-Trennung Dichte wird unter Verwendung von kommerziellen Kits wie OncoQuick® (Greiner, Frickenhausen, Deutschland) [13] und Lymphoprep® (Nycomed, Oslo , Norwegen) [14]. Dichtegradienten-Trennung basiert auf der Theorie, dass verschiedene Arten von Zellen können nach ihrer Dichte getrennt werden. Daher ist es schwierig, alle CTCs zu extrahieren, da der Zellmigration. RT-PCR ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden der Tumorzelldetektion aufgrund seiner hohen Sensitivität und Spezifität, ausreichende Primer- und Sondendesign annimmt. Doch falsch-positive Ergebnisse können aufgrund ihrer technischen Delikatesse auftreten und eine hohe Empfindlichkeit [15, 16].
Immunomagnetische Zellanreicherung, wie die von der Cellsearch System® (Veridex, LLC, Raritan, NJ, USA) durchgeführt [ ,,,0],17], ist derzeit die am häufigsten verwendete Technik zu bereichern und zu erkennen CTCs [18-21]. Der Vorteil der immunomagnetischen Zelltrennung ist, dass CTCs kann mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Zellen, die mit Antikörpern gegen epithelialen Marker nachgewiesen werden (epithelialen Zell-Adhäsionsmoleküle; EpCAMs) sind entschlossen, CTCs zu sein. Daher kann diese Technik zur Verfügung stellen falsch-positive Ergebnisse basierend auf der normalen epithelialen Marker-Expression durch Nicht-Tumorzellen, und falsch-negative Ergebnisse können auf den Mangel an selektiven Marker-Expression auf Tumorzellen entstehen basiert. Als Ergebnis der mit den obigen Ansätzen zugehörigen Beschränkungen, ist eine neue Technik benötigt, um genau tragfähige CTCs detektieren.
Spielt Telomerase wichtige Rolle bei der Karzinogenese, Krebsinvasion und Metastase [22-24]. Wir haben eine Technik zur Nutzung hoher Telomerase-Aktivität in Zellen entwickelt. Diese Technik verwendet einen Telomerase-spezifischen, die Replikation selektiv modifizierten viralen Agens (OBP-401; TelomeScan®, Oncolys BioPharma, Tokyo, Japan), in dem der menschliche Telomerase-Transkriptase (TERT
) Genpromotor umkehren wird in die E1-Region eingefügt und das grün fluoreszierende Protein (GFP) -Gen unter der Kontrolle des Cytomegalovirus-Promotors in der E3-Region als Marker der viralen Replikation [25] gegeben. Es wurde berichtet, dass OBP-401 verwendet werden können tragfähige CTCs unter normalen Blutzellen zu detektieren [26, 27].
Hier haben wir das Assay lebensfähige CTCs mit dem Potential für Metastasen in Patienten mit Magenkrebs zu detektieren angewendet. Wir haben festgestellt GFP-positiven CTCs. Im Gegensatz dazu ist es möglich, dass nicht-Krebszellen GFP-Fluoreszenz nach OBP-401-Infektion emittieren [28]. Daher wählten wir Zellen größer als ein Schwellenwert durch Vergleich zwischen gesunden Probanden und Patienten bestimmt, weil CTCs größer sind als normale Blutzellen [7, 29, 30]. . Wir untersuchten die Assoziation von GFP-positive CTC-Nummer mit dem Überleben und pathologischen Indizes der Krankheitsprogression
Methoden
Patienten und gesunden Probanden
Die Patienten in dieser vorläufigen Studie waren die geplanten chirurgischen Behandlung unterziehen; Patienten, die für EMR oder endoskopische Submukosadissektion geeignet waren, wurden ausgeschlossen. Die Einschlusskriterien waren: (i) histologisch Adenokarzinom des Magens durch endoskopische Biopsie nachgewiesen wurde; (Ii) klinische solitärer Tumor; (Iii) keine vorherige endoskopische Resektion, Chemotherapie oder Strahlentherapie; (Iv) Alter von 20 bis 80 Jahren; (V) Eastern Cooperative Oncology Group Performance-Status [31] 0 oder 1; (Vi) eine ausreichende Organfunktion; und (vii) informierte Zustimmung geschrieben. Die Ausschlusskriterien waren: (i) synchron oder metachrone Malignität; (Ii) schwanger sind oder stillen Frauen; (Iii) aktive oder chronische virale Hepatitis; (Iv) aktive bakterielle oder Pilzinfektion; (V) Diabetes mellitus; (Vi) die systemische Verabreichung von Kortikosteroiden; und (vii) instabilen Bluthochdruck. Das Stadium der Erkrankung bei den Patienten wurde pathologisch charakterisiert die siebte Auflage der TNM-Klassifikation der International Union Against Cancer mit [32]. Die Tiefe des Tumors bei drei Patienten ohne Gastrektomie und der regionalen Lymphknoten-Status von fünf Patienten ohne ausreichende Lymphadenektomie wurden chirurgisch diagnostiziert.
Alle Patienten unserer Klinik regelmäßig nach der Operation besucht und wurden alle 3 Monate überprüft. Die Patienten wurden auch die Endoskopie und Computertomographie mindestens einmal im Jahr nach ihrem Krankheitsstadium und Verlauf.
Wir rekrutierten auch gesunden Probanden als Kontrollen zu handeln. Alle gesunden Probanden waren Mitarbeiter von Sysmex Corporation und enthalten sieben Männer (Durchschnittsalter 31,4 Jahre, Bereich 24-39 Jahre) und drei Frauen (mittleres Alter 33,7 Jahre, Bereich 26-48 Jahre). Alle Probanden unterzogen medizinischen Check-ups auf die Beschäftigung und jährlich; Check-ups enthalten medizinische Interviews, Auskultation, Röntgenaufnahmen der Brust, und Blut- und Urinanalysen. Darüber hinaus führten wir Einzelinterviews vor der Probensammlung; jeder Freiwilliger, wurde zur Zeit in ärztlicher Behandlung, schwanger sind oder stillen, oder die Blut innerhalb des letzten Monats gespendet hatte ausgeschlossen wurde.
Virus
OBP-401, ein Telomerase-spezifische Replikation selektive adenoviralen Mittel, in dem die TERT
Promotorelement treibt die Expression des EIA
und EIB
Gene, in die das GFP-Gen integriert ist, wurde in dieser Studie verwendet. Sensitivität und Spezifität des Assays OBP-401 unter Verwendung von zuvor durch Kim et al untersucht worden. [27]. Der Test wurde fünfmal in der Probe einschließlich 1 MDA-MB-468 (Brustkarzinom) -Zellen und 7,5 ml Blut Test wiederholt, und die Zahl der GFP-positiven Zellen waren 1, 1, 1, 2 und 3; in der Probe einschließlich 20 MDA-MB-468 (Brustkarzinom) -Zellen wurden die Anzahlen von GFP-positiven Zellen 15, 17, 19, 22 und 24 Viral Proben bei -80 ° C gelagert wurden.
Zelllinien und Kultur
die A549 (Lungenkarzinom), HepG2 (hepatozelluläres Karzinom), HEC-1 (endometrialen Adenokarzinom), KATO-III (Magenkarzinom) und SBC-3 (kleinzelliges Lungenkarzinom) Zell-Linien wurden aus der Health erhalten Wissenschaft Research Resources Bank (Osaka, Japan). Die LNCaP (Prostata-Adenokarzinom) und OVCAR-3 (Ovarialkarzinom) Zelllinien von der Riken Cell Bank (Tokyo, Japan) erhalten wurden. Die Zellen wurden nach den Angaben des Herstellers. MDA-MB-468-Zellen kultiviert wurden, wie zuvor beschrieben [27].
Probenvorbereitung und Zell
Ein 7,5-ml periphere Vene Blutprobe Zählung wurde von jedem Patienten vor der Operation und von jedem Freiwilligen erhalten. Die Proben wurden in Röhrchen gezogen Zitronensäure, Phosphorsäure und Dextrose, und bei 4 ° C gelagert. Der Test wurde innerhalb von 48 h gestartet.
Die Proben für 5 Minuten bei 540 g und die Plasmaphase zentrifugiert wurde entfernt. Die Zellen wurden dann viermal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) und zweimal mit Rpmi gewaschen. Die Proben wurden mit 4 × 10 8 plaquebildende Einheiten (PFU) von OBP-401-Viren für 24 Stunden bei 37 ° C in dem Medium durch Inkubation infiziert.
Nach toten Zellfärbung durch die roten fluoreszierenden reaktiven Farbstoff L23102 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA), OBP-401-Viren inaktiviert wurden und die Zellen wurden für 20 Minuten bei Raumtemperatur mit 2% Paraformaldehyd (PFA) fixiert.
Die Proben mit einem oberflächenaktiven behandelt wurden Mittel (Emalgen 2025 G; Kao Chemicals, Tokyo, Japan) für 10 min bei 40 ° C roten Blutzellen zu degradieren. Schließlich wurde, 7,5 ml Blut verwendet, um Proben für die mikroskopische Analyse zwei Glasobjektträger zu schaffen. Alle GFP-positiven Zellen auf den beiden Objektträger wurden gezählt, einen computergesteuerten Fluoreszenzmikroskop (IX71, Olympus, Tokyo, Japan) und eine auf die Probe Details verblendet Prüfer. Die gesamte Testzeit betrug 27,5 h (Figur 1). Abbildung 1-Protokoll und das Verfahren des "GFP-CTC-Test". Jede 7,5 ml periphere Vene Blutprobe wurde von den Patienten vor der Operation und von Freiwilligen erhalten. Die Proben wurden in Röhrchen gezogen Zitronensäure, Phosphorsäure und Dextrose. Die Proben wurden zentrifugiert und die Plasmaphase wurde entfernt. unter Verwendung von PBS und Rpmi nach Zell Waschen wurden die Proben mit 4 × 108 PFU der OBP-401-Virus infiziert. OBP-401-Virus inaktiviert wurde, und die Zellen wurden mit 2% Paraformaldehyd (PFA) fixiert. Die Proben wurden mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelt, um rote und weiße Blutzellen verschlechtern. Zwei Glasobjektträger-Proben von 7,5 ml Blut wurden für die mikroskopische Analyse vorbereitet. Alle GFP-positiven Zellen auf den beiden Folien wurden mit Hilfe eines computergesteuerten Fluoreszenzmikroskop.
Bestimmung der GFP-Fluoreszenz Intensitätsschwelle gezählt
Die Schwelle für die GFP-Fluoreszenzintensität wurde wie folgt bestimmt. Etwa 30.000 kultivierten Zellen wurden versetzt in 7,5-ml-Blutproben von gesunden Freiwilligen, die mit verschiedenen Krebszelllinien versetzt wurden: A549, HepG2, HEC-1, KATO-III, SBC-3, LNCaP, MDA-MB-MB468 und OVCAR -3. Blutproben wurden zu CTC Nachweistest unterworfen und dann detektierbar Zellen wurden durch Fluoreszenzmikroskopie gezählt. Mehr als 100 Zellen wurden in jeder Probe analysiert. Wir stellten fest, 2,85 x 10 7 Äquivalent Fluorochrom bedeuten die Schwelle für die GFP-Signalintensität von der minimalen GFP Intensitätsniveau in den Blutproben mit den Zelllinien (Abbildung 2) versetzt beobachtet werden. Die Daten werden als die Zahl der GFP-positiven CTCs berichtet pro 7,5-ml peripheren Blutprobe. Abbildung 2 GFP Signalintensitäten von verschiedenen Krebszelllinien. Der Boden und die Oberseite der Box sind die unteren und oberen Quartile und die Band der Box ist der Median. Die Linien auf dem Ende der Whisker sind Minimum und Maximum. Die y-Achse stellt GFP Signalintensität auf einer logarithmischen Skala
Immunostaining
Phycoerythrin-markiertem Anti-Human-CD45-Antikörper (BioLegend, San Diego, CA, USA) verdünnt. 1: 5 und Pacific Blue-markiertem anti-human CD326 (EpCAM) -Antikörper (BioLegend) wurde 1:10 in PBS, enthaltend 2% fötales Rinderserum verdünnt. Zellen wurden 30 min bei 25 ° C mit verdünnten Antikörper inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS, enthaltend 2% fötales Rinderserum, wurden die Zellen auf Glasobjektträger aufgebracht und analysiert, um ein Fluoreszenzmikroskop. (IX71, Olympus)
Statistical analysis
Die statistische Analyse wurde unter Verwendung von JMP 9.0.2 Statistische Entdeckung (SAS Institute, Cary, NC, USA). Zur Bestimmung der Zelldurchmesser threshold, die detektierten GFP-positiven CTCs analysiert einen Empfänger unter Verwendung von Betriebskennlinie (ROC) -Kurve zwischen den Proben von Patienten mit Magenkrebs und die von Freiwilligen. Für mehrere Gruppenvergleiche, Homogenität der Varianz wurde von der Levene-Test bewertet. Für parametrischer Vergleiche haben wir Varianzanalyse und für nicht-parametrischer Vergleiche verwendeten wir den Wilcoxon und die Kruskal-Wallis-Tests. Wir haben Fisher-und χ
2 Tests mit einem 2 × 2 und 4 × 2-Tabelle jeweils die klinisch-pathologischen Zeichen in der Patientengruppe zu vergleichen. Kaplan-Meier-Kurven von geschätzten krankheitsfreie Überleben und das Gesamtüberleben wurden erzeugt, und Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mit Hilfe eines zweiseitigen Log-Rank-Test durchgeführt. P
≤0.05 Werte wurden als statistisch signifikant betrachtet.
Die Studie wurde von der Institutional Review Board der Showa-Universität, Northern Yokohama Krankenhaus genehmigt. Wir erklärten, das Studienprotokoll für die Patienten und Freiwilligen, bevor sie informierte Einwilligung schriftlich gegeben hat. Diese Studie mit dem Universitätsklinikum Medizinische Information Network in Japan registriert wurde, Nummer 000002018.
Ergebnisse

• Therapeutische Potenzial von PRL-3-Targeting und klinische Bedeutung der PRL-3 genomischen Amplifikation in Magen cancer
• Familiengeschichte von Krebs und gastro-Erkrankungen und das Risiko von Speiseröhre und Magen-Adenokarzinome: eine Fall-Kontroll-study