Prognostische impact van het opsporen van levensvatbare circulerende tumorcellen bij maagkanker patiënten met behulp van een telomerase-specifieke virale middel: een prospectieve studie

Prognostische impact van het detecteren levensvatbare circulerende tumorcellen bij maagkanker patiënten die een telomerase-specifiek viraal middel: een prospectieve studie
Abstract achtergrond
De identificatie van circulerende tumorcellen (CTCs) in perifeer bloed een nuttige aanpak prognose schatten bewaken ziekteprogressie en behandelingseffecten in verscheidene maligniteiten meten. De klinische relevantie van CTCs is controversieel. We hebben geprobeerd om levensvatbare CTC detecteren in het perifere bloed van patiënten met maagkanker met een telomerase-specifiek viraal middel.
Methods
We namen een 7,5-ml bloedmonster van 65 behandelde negatieve maagkanker patiënten voor operatie en 10 gezonde vrijwilligers. Detecteerden we levensvatbare CTCs in bloed monsters na te incuberen met een telomerase specifieke replicatie-selectieve oncolytische adenovirale dragerorgaan voor het groen fluorescent eiwit (GFP) gen (OBP-401). GFP-positieve CTCs werden gedefinieerd als hebbende een diameter van ten minste 7,735 urn; Deze drempel werd bepaald door receiver operating characteristic curve analyse. GFP-positieve cellen werden geteld onder de fluorescentiemicroscoop.

Resultaten Er was een significant verschil in overall overleving bij patiënten met 0-4 en die met ≥5 GFP-positieve CTCs bij de fase I-IV ziektegroep en fase II-IV gevorderde ziekte groep. Het aantal GFP-positieve CTC's was niet gerelateerd aan kanker podium. Onder de pathologische bevindingen, werd het aantal GFP-positieve CTC alleen significant gerelateerd aan veneuze invasie, hoewel er trends in de richting van meer GFP-positieve CTC met ziekteprogressie (tumor diepte, lymfeklieren metastase, verre metastase, lymfatische invasie, en histologische type werden ).
Conclusies
Er is een significante relatie tussen het aantal GFP-positieve CTCs en totale overleving bij patiënten met maagkanker. De detectie van CTC's met behulp van OBP-401 kan
nuttig zijn voor prognostische evaluatie. Trial registratie &University Hospital Medical Information Network in Japan, UMIN000002018.
Sleutelwoorden
circulerende tumorcellen Maagkanker Telomerase Achtergrond
metastasen van een vaste tumor is een sterke prognostische factor [1-3]. De aanwezigheid van circulerende tumorcellen (CTCs) in het perifere bloed suggereert dat een patiënt in een systemische ziekte fase [4]. De identificatie van CTCs in perifeer bloed een nuttige benadering prognose schatten bewaken ziekteprogressie en behandelingseffecten in borst, prostaat, huid, maag en colon tumoren te meten. Daarom zijn verscheidene werkwijzen ontwikkeld om CTCs detecteren, en worden soms gebruikt in combinatie. Gebruikte technieken voor de verrijking en detectie van CTCs zijn dichtheidsgradiënt scheiding [5], direct verrijking door filtratie [6, 7], immunomagnetische scheiding [8], stromingscytometrie [9], real-time reverse transcriptase polymerasekettingreactie (RT- PCR) [10, 11] en microchiptechnologie [12].
Cell verrijking door dichtheidsgradiënt scheiding wordt uitgevoerd met behulp van commerciële kits zoals OncoQuick® (Greiner, Frickenhausen, Duitsland) [13] en Lymphoprep (Nycomed, Oslo , Noorwegen) [14]. Dichtheidsgradiënt scheiding is gebaseerd op de theorie dat verschillende soorten cellen kunnen worden gescheiden op basis van hun dichtheid. Daarom is het moeilijk om alle CTCs door celmigratie extraheren. RT-PCR is een van de meest voorkomende methoden van detectie van tumorcellen vanwege de hoge gevoeligheid en specificiteit, bij voldoende primer en probe ontwerp. Echter, kan vals-positieve resultaten optreden als gevolg van de technische delicatesse en een hoge gevoeligheid [15, 16].
Immunomagnetische cel verrijking, zoals uitgevoerd door de CellSearch System® (Veridex, LLC, Raritan, NJ, USA) [ ,,,0],17], is op dit moment de meest gebruikte techniek om te verrijken en op te sporen CTC's [18-21]. Het voordeel van immunomagnetische celscheiding dat CTCs kan worden gevisualiseerd met een fluorescentiemicroscoop. Cellen gedetecteerd met antilichamen tegen epitheliale merkers (epitheliale celadhesiemoleculen, EpCAMs) zijn bepaald om CTCs zijn. Derhalve kan deze techniek vals-positieve resultaten opleveren op basis van normale epitheliale marker expressie van niet-tumorcellen, en vals-negatieve resultaten kunnen voordoen door het gebrek aan selectieve marker expressie op tumorcellen. Als gevolg van de beperkingen verbonden aan de bovengenoemde benaderingen, is een nieuwe techniek nodig levensvatbare CTCs nauwkeurig detecteren.
Telomerase speelt belangrijke rollen bij carcinogenese, kankerinvasie en metastase [22-24]. We hebben een techniek om hoge telomerase-activiteit te exploiteren in cellen ontwikkeld. Deze techniek gebruikt een telomerase-specifieke replicatie-selectieve gemodificeerd viraal middel (OBP-401; TelomeScan®, Oncolys BioPharma, Tokyo, Japan) waarop het menselijk telomerase reverse transcriptase (TERT
) genpromotor in het E1 ingevoegd en het groen fluorescerend eiwit (GFP) gen onder controle van de cytomegalovirus promotor in het E3 geplaatst als een merker van virale replicatie [25]. Vermeld is dat OBP-401 kan worden gebruikt om levensvatbare CTCs bij normale bloedcellen [26, 27] te detecteren.
Hier hebben we de test levensvatbare CTC detecteren met het potentieel voor metastase bij maagkanker patiënten en bracht. We hebben geconstateerd GFP-positief CTCs. Daarentegen is het mogelijk dat niet-kankercellen emitteren GFP fluorescentie na OBP-401 infectie [28]. Daarom hebben we geselecteerde cellen groter is dan een drempelwaarde bepaald door vergelijking tussen gezonde vrijwilligers en patiënten, omdat CTCs zijn groter dan normale bloedcellen [7, 29, 30]. . We bestudeerden de vereniging van GFP-positieve CTC getal met overleven en pathologische indices van de progressie van de ziekte
Methoden
patiënten en gezonde vrijwilligers
De patiënten in deze voorbereidende studie omvatte waren die ondergaan geplande chirurgische behandeling; patiënten die voor endoscopische mucosale resectie of endoscopische submucosale dissectie geschikt waren werden uitgesloten. De inclusiecriteria waren: (i) histologisch bewezen adenocarcinoom van de maag door endoscopische biopsie; (Ii) klinisch solitaire tumor; (Iii) geen voorafgaande endoscopische resectie, chemotherapie of radiotherapie; (Iv) de leeftijd 20-80 jaar; (V) de prestaties Eastern Cooperative Oncology Group-status [31] 0 of 1; (Vi) voldoende orgel functie; en (vii) geschreven informed consent. De uitsluitingscriteria waren: (i) synchroon of metachrone maligniteit; (Ii) zwangere vrouwen of vrouwen die borstvoeding geven; (Iii) actieve of chronische virale hepatitis; (Iv) actieve bacteriële of schimmelinfectie; (V) diabetes mellitus; (Vi) systemische toediening van corticosteroïden; en (vii) instabiele hypertensie. De ziekte fase van de patiënten werd pathologisch gekarakteriseerd met behulp van de zevende editie van de TNM classificatie van de International Union Against Cancer [32]. De diepte van de tumor in drie patiënten zonder gastrectomie en de regionale lymfklierstatus uit vijf patiënten zonder voldoende lymfadenectomie werden chirurgisch gediagnosticeerd.
Al de patiënten aanwezig ons ziekenhuis regelmatig na de operatie en werden gecontroleerd bij elke 3 maanden. De patiënten ondergingen ook endoscopie en computertomografie minstens één keer per jaar, op basis van hun ziekte podium en natuurlijk.
We hebben ook aangeworven gezonde vrijwilligers op te treden als controles. Alle gezonde vrijwilligers waren medewerkers van Sysmex Corporation en omvatte zeven mannen (gemiddelde leeftijd 31,4 jaar, range 24-39 jaar) en drie vrouwen (gemiddelde leeftijd 33,7 jaar, range 26-48 jaar). Alle vrijwilligers ondergingen medische check-ups op de werkgelegenheid en jaarlijks; check-ups opgenomen medische interviews, auscultatie, borst röntgenfoto's, en bloed en urine-analyses. Verder voerden we individuele gesprekken voor monstername; elke vrijwilliger die momenteel ontving medische behandeling, zwanger bent of borstvoeding geeft, of die had bloed in de afgelopen maand geschonken werd uitgesloten.
Virus
OBP-401, een telomerase-specifieke, replicatie-selectieve adenovirale agent in waarin de TERT
promotorelement drijft de expressie van EIA en EIB

genen, en waarin het GFP-gen wordt geïntegreerd, werd gebruikt in deze studie. Sensitiviteit en specificiteit van de test met gebruik OBP-401 zijn eerder bestudeerd door Kim et al. [27]. De proef wordt vijfmaal herhaald testen in het monster waarvan 1 MDA-MB-468 (borst carcinoma) cellen en 7,5 ml bloed, en het aantal GFP-positieve cellen werden 1, 1, 1, 2 en 3; in het monster zoals 20 MDA-MB-468 (borst carcinoma) cellen, het aantal GFP-positieve cellen werden 15, 17, 19, 22 en 24. Virale monsters werden opgeslagen bij -80 ° C.
Cellijnen en cultuur
A549 (longcarcinoom), HepG2 (hepatocellulair carcinoom), HEC-1 (adenocarcinoom endometrium), KATO III (maagcarcinoom) en SBC-3 (kleincellig longcarcinoom) cellijnen werden verkregen van de Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan). De LNCaP (prostaat adenocarcinoom) en OVCAR-3 (ovariumcarcinoom) cellijnen werden verkregen van de Riken Cell Bank (Tokyo, Japan). De cellen werden gekweekt volgens de specificaties van de leverancier. MDA-MB-468 cellen werden gekweekt zoals eerder beschreven [27].
Monstervoorbereiding celtelling
Een 7,5-ml perifeer veneuze bloedmonster werd verkregen van elke patiënt voor de operatie en van elke vrijwilliger. De monsters werden getrokken in buizen bevattende citroenzuur, fosforzuur en dextrose, en bewaard bij 4 ° C. De test werd gestart binnen 48 uur. Ondernemingen De monsters werden gedurende 5 minuten bij 540 g en het plasma fase werd verwijderd. De cellen werden vervolgens viermaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en tweemaal met Roswell Park Memorial Institute medium. De monsters werden geïnfecteerd met 4 x 10 8 plaquevormende eenheden (PFU) van OBP-401 virussen door incubatie in het medium gedurende 24 uur bij 37 ° C. Na
dode cellen kleuring van de rode fluorescerende reactieve L23102 kleurstof (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA), OBP-401 virus dat geïnactiveerd en de cellen werden gefixeerd met 2% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Ondernemingen De monsters werden behandeld met een oppervlakte-actieve middel (Emalgen 2025 G; Kao Chemicals, Tokyo, Japan) gedurende 10 min bij 40 ° C om rode bloedcellen aantasten. Tenslotte werd 7,5 ml bloed gebruikt om twee glasplaatje monsters voor microscopische analyse creëren. Alle GFP-positieve cellen op beide schijfjes werden geteld met behulp van een computergestuurde fluorescentiemicroscoop (IX71, Olympus, Tokyo, Japan) en een onderzoeker geblindeerd aan het monster gegevens. De totale assay bedroeg 27,5 uur (figuur 1). Figuur 1 Protocol en van de "GFP-CTC Assay". Elke 7,5 ml perifere ader bloedmonster werd verkregen van patiënten voor de operatie en van vrijwilligers. De monsters werden getrokken in buizen bevattende citroenzuur, fosforzuur en dextrose. De monsters werden gecentrifugeerd en het plasma fase werd verwijderd. Na wassen van de cellen met behulp PBS en Roswell Park Memorial Institute medium werden de monsters geïnfecteerd met 4 x 108 PFU van OBP-401 virus. OBP-401 virus werd geïnactiveerd en de cellen werden gefixeerd met 2% paraformaldehyde (PFA). De monsters werden behandeld met een oppervlakte-actief middel aan rode en witte bloedcellen aantasten. Twee glasplaatje monsters van 7,5 ml bloed werden voorbereid voor microscopische analyse. Alle GFP-positieve cellen op beide objectglaasjes werden geteld met behulp van een computergestuurde fluorescentiemicroscoop.
Bepaling van GFP fluorescentie-intensiteit drempel
De drempel voor GFP fluorescentie intensiteit als volgt bepaald. Ongeveer 30.000 gekweekte cellen werden ingespoten in 7,5-ml bloedmonsters van gezonde vrijwilligers, die waren ingespoten met verschillende kanker cellijnen: A549, HepG2, HEC-1, KATO III, SBC-3, LNCaP, MDA-MB-MB468 en OVCAR -3. Bloedmonsters werden onderworpen aan CTC detectietest en vervolgens detecteerbare cellen werden geteld door fluorescentie microscopie. Meer dan 100 cellen werden geanalyseerd in elk monster. We bepaalden 2,85 x 10 7 Gemiddeld equivalent fluorochroom de drempel voor GFP signaalintensiteit van de minimale GFP intensiteit waargenomen in de bloedmonsters verrijkt met cellijnen (figuur 2) zijn. Gegevens worden gerapporteerd als het aantal GFP-positieve CTCs per 7,5 ml perifeer bloedmonster. Figuur 2 GFP signaal intensiteiten uit verschillende kanker cellijnen. De onder- en bovenkant van de box zijn de onderste en bovenste kwartielen en de band van de doos is de mediaan. De lijnen op het einde van de snorharen zijn minimum en maximum. De y-as geeft GFP signaalintensiteit op een log schaal
Immunokleuring
Phycoerythrine-gemerkt anti-humaan CD45 antilichaam (BioLegend, San Diego, CA, USA) werd verdund 1:. 5 en Pacific Blue-gemerkt anti-humaan CD326 (EpCAM) antilichaam (BioLegend) verdund 1:10 in PBS dat 2% foetaal runderserum. Cellen werden geïncubeerd met verdunde antilichamen gedurende 30 minuten bij 25 ° C. Na wassen met PBS dat 2% foetaal runderserum werden cellen aangebracht op glasplaatjes en geanalyseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop. (IX71; Olympus)
Statistische analyse
Statistische analyse werd uitgevoerd onder toepassing van JMP Statistical Discovery 9.0.2 (SAS Institute, Cary, NC, USA). De drempel celdiameter bepalen werden de gedetecteerde GFP-positieve CTCs geanalyseerd met een receiver operating characteristic (ROC) curve tussen de monsters van maagkanker patiënten en die uit vrijwilligers. Voor meerdere groep vergelijkingen, homogeniteit van de variantie werd beoordeeld door de Levene-test. Parametrische vergelijkingen die we variantieanalyse, en voor niet-parametrische vergelijkingen we de Wilcoxon en de Kruskal-Wallis test. We gebruikten Fisher's exacte en χ
2 tests met een 2 x 2 en 4 x 2 tafel, respectievelijk tot de klinische tekens te vergelijken in de patiëntengroep. Kaplan-Meier curves van geschatte ziektevrije overleving en totale overleving werden gegenereerd, en vergelijkingen tussen de groepen werden uitgevoerd met een tweezijdige logranktoets. P
waarden ≤0.05 werden beschouwd als statistisch significant. Ondernemingen De studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Showa University, Noord-Yokohama Hospital. We legden het studieprotocol aan de patiënten en vrijwilligers voordat zij informed consent gaven schriftelijk. Deze studie werd geregistreerd bij de University Hospital Medical Information Network in Japan, nummer 000002018.
Resultaten
deelnemer kenmerken
Vijfenzestig patiënten met adenocarcinoom van de maag (46 mannen en 19 vrouwen, gemiddelde leeftijd 58,8 jaar, range 33 -76 jaar) die een operatie tussen september 2009 en mei 2011 onderging aan de Digestive Disease Center van de Showa University Northern Yokohama ziekenhuis werden opgenomen in deze studie. Negenentwintig had distale gastrectomie, 32 hadden een totale gastrectomie, en vier hadden verkennende laparotomie. kenmerken van de patiënten worden samengevat in tabel 1. Achtentwintig van de 65 patiënten ontvingen chemotherapie na de operatie. De controlegroep bestond uit 10 gezonde volunteers.Table 1 patiënt kenmerken en pathologische bevindingen
Parameters
aantallen patiënten
Sex
Man
46
Female
19
Age (bedoel, bereik)
58,8, 33-76
Gastrectomie
distale
29
Totaal
32
Geen verhuur 4
Chirurgische aanpak
Laparoscopy
54 logo VPRO laparotomie
11
curability
R0
57
R1
0
R2
8
TNM Stage
I
40
II
6
III
10

• Therapeutisch potentieel van PRL-3 targeting en klinische betekenis van PRL-3 genoomamplificatie bij maagkanker
• Familiegeschiedenis van kanker en gastro-aandoeningen en risico van slokdarm en maag adenocarcinomen: een case-control study