Prognostisk effekt av å påvise levedyktige sirkulerende tumorceller i mage kreftpasienter ved hjelp av en telomerase-spesifikk viral agent: en prospektiv study

prognostisk effekt av å påvise levedyktige sirkulerende tumorceller i mage kreftpasienter ved hjelp av en telomerase-spesifikk viral agent: en prospektiv studie
Abstract
Bakgrunn
identifisering av sirkulerende tumorceller (CTCs) i perifert blod er en nyttig tilnærming for å estimere prognose, overvåke sykdomsutvikling, og måle behandlingseffekter i ulike kreftformer. Imidlertid er kliniske relevansen av CTCs kontroversielt. Vi forsøkte å detektere levedyktige CTCs i perifert blod av magekreftpasienter ved anvendelse av en telomerase-spesifikt viralt middel.
Måter
Vi fant en 7,5 ml blodprøve fra 65 behandlings negativ mage kreftpasienter før kirurgi og 10 friske frivillige. Vi oppdaget levedyktige CTCs i blodprøvene etter inkubering av dem med en telomerase-spesifikke, replikering-selektive, onkolytisk adenovirus middel som bærer den grønne fluorescerende protein (GFP) genet (OBP-401). GFP-positive CTCs ble definert til å ha en diameter på minst 7,735 um; denne terskelen ble bestemt ved mottakeren opererer karakteristisk kurve analyse. GFP-positive celler ble talt under et fluorescens mikroskop.
Resultater
Det var en signifikant forskjell i total overlevelse blant pasientene med 0-4 og de med ≥ 5 GFP-positive CTCs i stadium I-IV sykdomsgruppe og stadium II-IV avansert sykdomsgruppe. Antallet GFP-positive CTCs var ikke relatert til kreft stadium. Blant de patologiske funn, ble antall GFP-positive CTCs bare signifikant relatert til venøs invasjon, selv om det var tendenser til flere GFP-positive CTCs med sykdomsprogresjon (tumor dybde, lymfeknutemetastaser, fjernmetastaser, lymfatisk invasjon, og histologiske typen ).
Konklusjoner
det var en signifikant sammenheng mellom antall GFP-positive CTCs og total overlevelse hos pasienter med magekreft. Påvisning av CTCs bruker OBP-401 kan være nyttig for prognostisk vurdering.
Trial registrering
universitetssykehus Medical Information Network i Japan, UMIN000002018.
Nøkkelord
Sirkulasjonskreftceller Magekreft Telomerase Bakgrunn
fjernmetastaser av en solid svulst er en sterk prognostisk faktor [1-3]. Eksistensen av sirkulerende tumorceller (CTCs) i perifert blod antyder at en pasient er i en systemisk sykdom fase [4]. Identifiseringen av CTCs i perifert blod er en nyttig tilnærming for å estimere prognose, overvåke sykdomsutvikling, og måle behandlingseffekter i bryst, prostata, hud, tykktarm og gastrointestinale maligniteter. Derfor har forskjellige metoder blitt utviklet for å detektere CTCs, og blir noen ganger brukt i kombinasjon. Vanlige teknikker for anrikning og deteksjon av CTCs er densitetsgradienten separasjons [5], direkte anrikning ved filtrering [6, 7], immunomagnetisk separering [8], strømningscytometri [9], sanntids-revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT- PCR) [10, 11], og mikrochip teknologi [12].
Cell anrikning ved densitetsgradient separering utføres ved bruk av kommersielle sett som OncoQuick® (Greiner, Frickenhausen, Tyskland) [13] og Lymphoprep® (Nycomed, Oslo , Norge) [14]. Densitetsgradient separering er basert på teorien om at forskjellige typer av celler kan separeres i henhold til deres tetthet. Derfor er det vanskelig å trekke ut alle CTCs på grunn av cellemigrering. RT-PCR er en av de mest vanlige metodene for tumorcelle-deteksjon på grunn av sin høye følsomhet og spesifisitet, forutsatt at tilstrekkelig primer og probe-utformingen. Imidlertid kan det oppstå falske positive resultater oppstå på grunn av dens tekniske delikatesse og høy følsomhet [15, 16].
Immunomagnetisk celle berikelse, slik som den som utføres av den CellSearch System® (Veridex, LLC, Raritan, NJ, USA) [ ,,,0],17], er i dag den mest brukte teknikken til å berike og oppdage CTCs [18-21]. Fordelen med immunomagnetisk celleseparasjon, er at CTCs kan visualiseres med et fluorescerende mikroskop. Celler oppdages med antistoffer mot epiteliale markører (epitelceller celleadhesjonsmolekyler; EpCAMs) er fast bestemt på å være CTCs. Derfor kan denne teknikken gi falske positive resultater på grunnlag av normal epitelial markør ekspresjon av ikke-tumorceller, og falsk-negative resultater kan oppstå på grunnlag av mangelen på selektive markør ekspresjon på tumorceller. Som følge av de begrensninger som er knyttet til de ovennevnte metoder, er en ny teknikk for å påvise levedyktige CTCs presist.
Telomerase spiller viktige roller i karsinogenese, kreft invasjon og metastase [22-24]. Vi har utviklet en teknikk for å utnytte høy telomerase aktivitet i cellene. Denne teknikken benytter et telomerase-spesifikke, replikering-selektivt modifisert viralt middel (OBP-401; TelomeScan®, Oncolys BioPharma, Tokyo, Japan), hvor det humane telomerase revers transkriptase (TERT
) genpromoteren er satt inn i E1-regionen og grønt fluorescerende protein (GFP) genet blir plassert under kontroll av cytomegalovirus-promoteren i E3-region som en markør for viral replikasjon [25]. Det har blitt rapportert at OBP-401 kan anvendes for å påvise levedyktige CTCs blant normale blodlegemer [26, 27].
Her har vi anvendt assay for å påvise levedyktige CTCs med potensial for metastaser i magekreftpasienter. Vi oppdaget GFP-positive CTCs. I motsetning til dette, er det mulig at ikke-cancerceller avgir GFP fluorescens etter OBP-401-infeksjon [28]. Derfor valgte vi celler som er større enn en terskelverdi bestemt ved sammenligning mellom friske frivillige og pasienter, fordi CTCs er større enn normale blodceller [7, 29, 30]. . Vi studerte sammenslutning av GFP-positive CTC nummer med overlevelse og patologiske indekser av sykdomsprogresjon
Metoder
pasienter og friske frivillige Bedrifter Den pasienter inkludert i denne forstudien var de som gjennom planlagt kirurgisk behandling; pasienter som var egnet for endoskopisk mucosal reseksjon eller endoskopisk submucosal disseksjon ble ekskludert. Inklusjonskriteriene var: (i) histologisk påvist adenokarsinom i magen ved endoskopisk biopsi; (Ii) klinisk enslig svulst; (Iii) ingen tidligere endoskopisk reseksjon, cellegift eller strålebehandling; (Iv) alder 20-80 år; (V) Eastern Cooperative Oncology Group funksjonstilstand [31] 0 eller 1; (Vi) tilstrekkelig organfunksjon; og (vii) skriftlig informert samtykke. Eksklusjonskriterier var: (i) synkron eller metachronous malignitet; (Ii) gravide eller ammende kvinner; (Iii) aktiv eller kronisk viral hepatitt; (Iv) aktiv bakteriell eller soppinfeksjon; (V) diabetes mellitus; (Vi) systemisk administrasjon av kortikosteroider; og (vii) ustabil hypertensjon. Sykdommen scenen i pasienter ble patologisk karakterisert ved hjelp av den syvende utgaven av TNM klassifisering av International Union Against Cancer [32]. Dybden av svulsten i tre pasienter uten gastrektomi og regional lymfeknute status av fem pasienter uten tilstrekkelig lymphadenectomy ble diagnostisert kirurgisk.
Alle pasientene deltok på våre sykehus regelmessig etter operasjonen, og ble sjekket hver 3. måned. Pasientene gjennomgikk også endoskopi og computertomografi minst en gang i året, i henhold til deres sykdom scenen og kurs.
Vi rekrutterte også friske frivillige til å fungere som kontroller. Alle friske frivillige var ansatte i Sysmex Corporation og inkludert syv menn (gjennomsnittsalder 31,4 år, range 24-39 år) og tre kvinner (gjennomsnittsalder 33,7 år, range 26-48 år). Alle frivillige gjennomgikk legekontroll ved ansettelse og årlig; sjekk-ups inkludert medisinske intervjuer, auskultasjon, bryst røntgenbilder, og blod og urin analyser. Videre utførte vi individuelle intervjuer før prøvetaking; alle frivillige som var tiden mottar medisinsk behandling, gravid eller ammer, eller som hadde donert blod i den siste måneden ble ekskludert.
Virus
OBP-401, en telomerase-spesifikke, replikering-selektive adenovirus middel der TERT
promotorelementet driver ekspresjonen av EIA
og EIB-
gener, og i hvilken GFP-genet er integrert, ble anvendt i denne studien. Sensitivitet og spesifisitet av analysen ved hjelp av OBP-401 har tidligere blitt undersøkt av Kim et al. [27]. Forsøket ble gjentatt fem ganger teste i prøven, inkludert en MDA-MB-468 (bryst-karsinom) celler og 7,5 ml blod, og antall GFP-positive celler var 1, 1, 1, 2 og 3; i prøven, inkludert 20 MDA-MB-468 (bryst-karsinom) celler, antallet GFP-positive celler ble 15, 17, 19, 22 og 24. Virusprøvene ble lagret ved -80 ° C.
Cellelinjer og kultur
A549 (lunge karsinom), HepG2 (hepatocellulær karsinom), HEC-1 (endometrial adenokarsinom), KATO-III (gastrisk karsinom), og SBC-3 (småcellet lungekarsinom) cellelinjer ble oppnådd fra Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan). Den LNCaP (prostata adenokarsinom) og OVCAR-3 (ovarie karsinom) cellelinjer ble oppnådd fra Riken Cell Bank (Tokyo, Japan). Cellene ble dyrket i henhold til leverandørens spesifikasjoner. MDA-MB-468-celler ble dyrket som tidligere beskrevet [27].
Prøvepreparering og celletelle
En 7,5 ml perifer vene blodprøve ble oppnådd fra hver pasient før kirurgi og fra hver frivillig. Prøvene ble trukket inn i rør inneholdende sitronsyre, fosforsyre, og dekstrose, og lagret ved 4 ° C. Analysen ble startet i løpet av 48 timer.
Prøvene ble sentrifugert i 5 minutter ved 540 g, og plasmafasen ble fjernet. Cellene ble deretter vasket fire ganger med fosfatbufret saltløsning (PBS) og to ganger med Roswell Park Memorial Institute medium. Prøvene ble infisert med 4 x 10 8 plaque-dannende enheter (PFU) av OBP-401 virus ved inkubering i mediet i 24 timer ved 37 ° C.
Etter død celle farging av den rød-fluorescerende reaktive fargestoff L23102 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA), OBP-401 virus var inaktivert, og cellene ble fiksert med 2% paraformaldehyd (PFA) i 20 minutter ved romtemperatur.
prøvene ble behandlet med et overflateaktivt middel (Emalgen 2025 G; Kao Chemicals, Tokyo, Japan) i 10 minutter ved 40 ° C for å nedbryte røde blodceller. Til slutt ble 7,5 ml blod som brukes til å lage to glass glide prøver for mikroskopisk analyse. Alle GFP-positive celler på de to lysbilder ble talt, ved hjelp av en datastyrt fluorescerende mikroskop (IX71, Olympus, Tokyo, Japan) og en sensor blindet for prøve detaljer. Den totale forsøkstid var 27,5 h (figur 1). Figur 1 Protokoll og fastlagt i "GFP-CTC-analyse". Hver 7,5 ml perifer vene blodprøve ble oppnådd fra pasienter før kirurgi og fra frivillige. Prøvene ble trukket inn i rør inneholdende sitronsyre, fosforsyre og dekstrose. Prøvene ble sentrifugert, og plasmaen fase ble fjernet. Etter vasking celle ved bruk av PBS og Roswell Park Memorial Institute medium ble prøvene infisert med 4 x 108 PFU av OBP-401 viruset. OBP-401 virus var inaktivert og cellene ble fiksert med 2% paraformaldehyde (PFA). Prøvene ble behandlet med et overflateaktivt middel for å nedbryte røde og hvite blodlegemer. To glass lysbilde prøver fra 7,5 ml blod ble forberedt for mikroskopisk analyse. Alle GFP-positive celler på de to plater ble tellet ved anvendelse av en datamaskin-styrt fluorescerende mikroskop.
Bestemmelse av GFP fluorescensintensitet terskel
Terskelen for GFP fluorescensintensitet ble bestemt som følger. Omtrent 30 000 dyrkede celler ble tilsatt i 7,5 ml blodprøver fra friske frivillige, som ble tilsatt ulike kreftcellelinjer: A549, HepG2, HEC-en, KATO-III, SBC-3, LNCaP, MDA-MB-MB468 og OVCAR -3. Blodprøver ble underkastet CTC påvisningsmetode, og deretter påvisbare celler ble tellet ved fluorescens mikroskopi. Mer enn 100 celler ble analysert i hver prøve. Vi har fastslått 2.85 x 10 7 bety tilsvarende fluorokrom å være terskelen for GFP signalintensitet fra den minimale GFP intensitetsnivå observeres i blodprøver tilsatt cellelinjer (figur 2). Data er rapportert som antall GFP-positive CTCs per 7,5 ml perifer blodprøve. Figur 2 GFP signal intensiteter fra ulike kreftcellelinjer. Bunnen og toppen av boksen er nedre og øvre kvartil, og bandet merket medianen. Linjene på enden av hårkrystallene er minimum og maksimum. Y-aksen representerer GFP signalintensitet på en loggskala
Immunfarging
Phycoerythrin-merket anti-humant CD45-antistoff (BioLegend, San Diego, CA, USA) ble fortynnet 1: 5. Og Pacific Blue-merket anti-humant CD326 (EpCAM) antistoff (BioLegend) ble fortynnet 1:10 i PBS inneholdende 2% føtalt bovint serum. Celler ble inkubert med fortynnet antistoff i 30 minutter ved 25 ° C. Etter vasking med PBS inneholdende 2% føtalt bovint serum, ble cellene montert på objektglass, og analysert ved hjelp av et fluorescens mikroskop. (IX71; Olympus)
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av JMP 9.0.2 Statistiske Discovery (SAS Institute, Cary, NC, USA). For å bestemme terskel cellen diameter, ble de detekterte GFP-positive CTCs analysert ved bruk av en mottaker som opererer karakteristikk (ROC) kurve mellom prøvene fra magekreftpasienter og de fra frivillige. For multiple gruppesammenligninger, ble homogeniteten av varians bestemt ved Levene test. For para sammenligninger vi brukt variansanalyse, og for ikke-parametriske sammenligninger vi brukte Wilcoxon og Kruskal-Wallis tester. Vi brukte Fishers eksakte og χ
2 tester med en 2 x 2 og en 4 x to bord, henholdsvis, for å sammenligne clinicopathological tegnene i pasientgruppen. Kaplan-Meier-kurver av anslått sykdomsfri overlevelse og total overlevelse ble generert, og sammenligninger mellom gruppene ble utført ved hjelp av en tosidig log-rank test. P
verdier ≤0.05 ble ansett som statistisk signifikant.
Studien ble godkjent av Institutional Review Board av Showa University, Northern Yokohama Hospital. Vi forklarte studieprotokollen til pasienter og frivillige før de ga skriftlig informert samtykke. Denne studien ble registrert med University Hospital Medical Information Network i Japan, nummer 000002018.
Resultater
Deltaker egenskaper
Sekstifem pasienter med adenokarsinom i ventrikkel (46 menn og 19 kvinner, gjennomsnittsalder 58,8 år, range 33 -76 år) som gjennomgikk kirurgi på Digestive Disease Center of the Showa Universitetet i Nord-Yokohama Hospital mellom september 2009 og mai 2011 ble inkludert i denne studien. Tjueni hadde distal gastrektomi, 32 hadde total gastrektomi, og fire hadde utforsk laparotomi. Pasientenes karakteristika er oppsummert i tabell 1. Tjueåtte av de 65 pasientene fikk kjemoterapi etter operasjonen. Kontrollgruppen omfattet 10 friske volunteers.Table 1 Pasientkarakteristika og patologiske funn
Parametere
antall pasienter
Sex
Mann fra 46
Kvinne
19
Alder (gjennomsnitt, range)
58,8, 33-76
Gastrectomy
Distal
29
Total
32
Ingen
4
Kirurgisk tilnærming
laparoskopi
54
Åpne laparotomi
11
Curability
R0
57
R1
0
R2
8
TNM Stage
jeg
40
II
6
III
10
IV
9
Tumor dybden av invasjonen
T1
36
T2
8
T3
9
T4
12
lymfeknutemetastaser
N0
39
N1
5
N2
6
N3
15
Distant metastase
M0
56
M1
9 On Main histologiske typen †
Differensiert
25
Undifferentiated
40
lymfatisk invasjon
LX
4
L0
35
L1
26
venøs invasjon
VX
4
V0
35
V1-2
26
† Vel eller moderat differensiert adenokarsinom og papillær adenokarsinom ble kategorisert som differensiert type. Signet-ring cellekreft, dårlig differensiert adenokarsinom og mucinous adenokarsinom ble kategorisert som udifferensiert type.
GFP-positive CTCs i perifert blod
Ved hjelp av en fluorescens mikroskop, celler med fluorescerende utslipp ≥2.85 × 10 7 betyr tilsvar fluorochrome ble regnet som GFP-positive celler
Ulike størrelser av GFP-positive celler ble observert i hver prøve.; Derfor var det vanskelig å identifisere en celle representative blant de GFP-positive celler for sammenligning mellom pasienter og friske frivillige. Derfor, for å unngå å bruke en vilkårlig verdi, bestemte vi oss for å bruke den optimale terskelverdi avledet fra den ROC analyse basert på cellestørrelsen, det vil si 7,735 mikrometer, ettersom terskelen for å definere GFP-positive CTCs (figur 3). Figur 3 Sammenligning av cellediameter mellom pasienter og frivillige. For å bestemme terskelen, sammenlignet vi diametrene av celler fra magekreftpasienter og kontroller ved ROC analyse. Det var en signifikant forskjell mellom mage kreftpasienter og kontrollene (p
< 0.001, arealet under kurven = 0,57; 95% konfidensintervall = 0,54 til 0,60)
Ved immunhistokjemisk farging hjelp av anti-EpCAM og. anti-CD45-antistoffer, fikk vi bekreftet at GFP-positive CTCs var EpCAM-positive og CD45-negative (figur 4). Figur 4 Eksempler på mikroskopiske bilder. Representative bilder fra to magekreft prøver av GFP-positive CTCs og immuncytokjemisk analyse av anti-EpCAM- og anti-CD45-positive celler. Cellene ble telt ved hjelp av en datastyrt fluorescens mikroskop av en sensor blindet til prøven status. Målestokk, 10 um.
Tallene for GFP-positive CTCs i de perifere blodprøver er vist i figur 5. Det var ingen signifikant forskjell mellom påvisnings forekomst av GFP-positive CTCs i prøvene representerer hver kreft stadium. Figur 5 Antall GFP-positive celler. Prikkene er tallet på GFP-positive CTCs i pasientprøver. Bunnen og toppen av boksen representerer de nedre og øvre kvartil, og bandet over boksen viser medianen. De nedre og øvre barer på endene av værhår viser den laveste datapunkt innenfor 1,5 interkvartilt områder av den nedre kvartil, og det høyeste datapunkt innenfor 1,5 interkvartilt områder av øvre kvartil, henholdsvis. De grønne linjene viser gjennomsnittsverdien.
Association of GFP-positive CTCs med overlevelse
Gjennomsnittlig antall GFP-positive CTCs i prøvene fra 10 friske frivillige var 4,8. Vi delte pasientene inn i to grupper basert på antall GFP-positive CTCs: 0-4 og ≥5. De clinicopathological karakteristikk av de to gruppene er oppsummert i tabell 2. Det var ingen signifikant forskjell mellom de to gruppene, bortsett fra at det var bare én kategori av lymfatisk metastasis.Table 2 Clinicopathological tegnene i to pasientgrupper etter antall CTCs
Antall CTCs
0-4
5 ≤
P
verdi
Antall personer
41

24
TNM: Stage
0,1586
Stage jeg
29
11
Stage II
4
2
Stage III
4
6
Stage IV
4
5
TNM: T kategori
0,2753
T1
26
10
T2
5
3
T3
5
4
T4
5
7
TNM: N kategori
0,0257 *
N0
27
12
N1
5
0
N2
4
2
N3
5
10
TNM: M kategori
0,2121
M0
37
19
M1
4
5 On Main histologiske typen
0,6844
Differensiert typen
15
10
udifferensiert typen
26
14
lymfatisk invasjon
0,3177
Lx
2
2
L0
25
10
L1
14
12
venøs invasjon
0,1293
Vx
2
2
V0
26
9
V1-2
13
13
kirurgi
0,2124
kurativ reseksjon
38
19
ikke-kurativ reseksjon
1 3
Ingen reseksjon
2
2
Postoperativ kjemoterapi
0,1672
Presence
15
13
Fravær
26
11 product: * * Betydelig forskjell.
Figur 6a viser Kaplan -Meier kurver for total overlevelse i to grupper: de pasientene med 0-4 CTCs og de med ≥5. Det var en signifikant forskjell mellom de to gruppene (p
= 0,0021). Videre er det i de avanserte magekreft hos pasienter med stadium II-IV sykdom, var det en signifikant forskjell mellom de to gruppene (p
= 0,0126) (figur 6b). Figur 6 Total overlevelse. (A) Samlet overlevelse for alle pasienter. (B) Samlet overlevelse for pasienter med stadium II-IV sykdom. Overlevelse ble sammenlignet i henhold til antall CTCs bruker Kaplan-Meier analyse og log-rang statistikk. ** P
< 0,01, * p
< 0,05.
Association of GFP-positive CTCs med patologiske indekser
Det var ingen signifikant sammenheng mellom antall GFP-positive CTCs og kreft stadium (p
= 0,2313) (figur 5). Selv om ingen statistisk signifikans ble observert, antallet GFP-positive CTCs hadde en tendens til å øke med progresjon av primærtumor (p
= 0,1521) (figur 7a). Antallet CTCs i prøvene fra knutepunktet-positive pasienter som var større enn i node-negative pasienter (p
= 0,1752) (figur 7b). Sammenlignet med pasienter uten fjernmetastaser, de med fjernmetastaser hadde lignende antall GFP-positive CTCs (p
= 0,5655) (figur 7c). Det var ikke en signifikant forskjell mellom differensiert og udifferensiert type (p
= 0,8387) (figur 7d). Antallet CTCs var lik i de prøver fra pasienter med og uten lymfatisk invasjon (p
= 0,2054) (figur 7e). For venøs invasjon, antall CTCs i prøvene fra pasientene med invasjon var signifikant høyere enn hos pasienter uten invasjon (p
= 0,0351) (figur 7f). Figur 7 Forholdet mellom antall GFP-positive CTCs i et 7,5-ml blodprøve fra magekreftpasienter og patologiske funn hos pasientene. Prikkene er tallet på GFP-positive CTCs i pasientprøver. Bunnen og toppen av boksen representerer de nedre og øvre kvartil, og bandet over boksen viser medianen. De nedre og øvre barer på endene av værhår viser den laveste datapunkt innenfor 1,5 interkvartilt områder av den nedre kvartil, og det høyeste datapunkt innenfor 1,5 interkvartilt områder av øvre kvartil, henholdsvis. en, Tumor invasjon dybde (T1-T4 indikerer økende dybde). b, Lymfatisk metastaser (N0 = negativ, N1-3 = positiv). c, Distant metastaser (M0 = negativ, M1 = positiv). d, Histologisk type (differensiert type og udifferensiert type). e, lymfatisk invasjon (L0 = negativ, L1 = positiv). f, Venøs invasjon (V0 = negativ, V1 = positiv), * p
< 0,05. Selv om bare venøs invasjonen viste en statistisk signifikant forskjell, det var noen tendenser til en økning i CTC antall med økende sykdomsutvikling.
Diskusjon
Dette notatet rapporterer korrelasjonen mellom CTCs og magekreft, som er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis. Nytten av påvisning av CTCs ved diagnose, estimering av prognose, og evaluering av behandlingseffekt allerede er blitt rapportert for brystkreft [27, 33], prostata [34], lunge [35] og fordøyelseskanalen [11, 36, 37 ] kreft. Denne studien indikerer at den er også nyttig for magekreft.
En viktig resultat av vår undersøkelse ble en signifikant sammenheng mellom antall CTCs og prognose. Selv om vi brukte en kort oppfølgingsperiode, prognosen for pasienter som hadde ≥ 5 CTCs i sine 7,5 ml perifere blodprøver var dårlig. Pasienter med tidlig stadium sykdommen generelt har lavere tilbakefall [38], og de med stadium I sykdom faktisk hadde ingen tilbakefall i vår studie. Vi har også beregnet overlevelsesrate i avanserte magekreftpasienter med stadium II-IV sykdom, og viste at disse pasientene hadde en lignende overlevelse mønster til de med stadium I-IV sykdom. Disse resultatene tyder på at preoperativ kjemoterapi eller omfattende behandling er hensiktsmessig for langt fremskreden sykdom hos pasienter som har mange CTCs i forbehandling prøver på grunn av deres dårlige prognoser.
Blant våre patologiske funn, bare venøs invasjon hadde en signifikant sammenheng med antallet CTCs. Dette tyder på avtalen mellom tradisjonell patologi og moderne molekylær teknologi. Vi mener at mangelen på en betydelig forskjell mellom antall CTCs oppdaget av vår analyse og andre patologiske indeksene kan forklares av metodologiske problemer som for eksempel den lille størrelsen på utvalget. Vår teknikk fungerte bra som en prognostisk evalueringsverktøy - for å gi informasjon om behovet for postoperativ adjuvant behandling - og det kan være et nyttig hjelpeverktøy til patologi basert klassifikasjon
Det er ikke klart om alle oppdagede CTCs har metastatisk potensial.. Levedyktige CTCs ble påvist i prøvene fra tidlig stadium kreftpasienter i denne studien, men nesten alle trinn I gruppe pasienter overlevde uten tilbakefall [38]. Vi har til hensikt å bekrefte om resistente kreftceller, som kreft stamceller, var til stede i de oppdagede GFP-positive celler. Dessuten vil vi analysere funksjoner av levedyktige CTCs individuelt etter celle sortering, og identifisere CTCs med metastatisk potensial ved hjelp av flere verktøy som DNA ploiditetsanalysen [39, 40]. Videre vil genuttrykk profilering blant levedyktige CTCs, døde celler, primærsvulster og metastatiske svulster avsløre viktig informasjon knyttet til mekanismene for kreft metastasering.
Våre resultater må tolkes med en viss forsiktighet, med tanke på begrensningene i denne studien. For det første antall CTCs variert mye mellom individer, inkludert pasienter og friske frivillige. Dessuten ble ikke påvirket av tumorstadium eller tilstedeværelse av klinisk påvisbare metastaser. Tilsvarende, var det ingen sammenheng mellom tilstedeværelsen av metastaser (lymfeknute eller fjernt) eller invasjon og antallet CTCs, som bringer inn spørsmålet ved bruk av CTCs å forutsi metastatisk potensial. Det er imidlertid mulig at den forholdsvis lille prøvestørrelsen er begrenset mulighet for å avdekke reelle forskjeller mellom disse grupper av pasienter. Til slutt må det erkjennes at våre resultater er bare aktuelt for preoperativ, behandlingsnaive magekreft og bør ikke generaliseres til andre typer kreft.
Åpenbart flere studier i en større populasjon av pasienter, og med ulike typer kreft , er nødvendig for å klargjøre den kliniske anvendbarhet av CTC deteksjon. Vi forbereder nå en studie for å undersøke effekten av magekreft behandling på antall CTCs, som skal bidra til å etablere sitt forhold til fremtidig sykdomsutvikling og om CTC telling kan hjelpe guidetherapy valg.
Konklusjoner
Det var en signifikant forskjell i overlevelse mellom pasienter med 0-4 CTCs og de med ≥5. Det er imidlertid uklart om alle CTCs ha sann metastatisk potensial, og videre studier er nødvendig
. Erklæringer
Takk
Denne forskningen ble støttet delvis av en Grant-in-Aid for Utfordrende Utforskende forskning (23659308) fra Japan Society for Promotion of Science (JSP). Midlene kroppen spilte ingen rolle i studien design; i innsamling, analyse, eller tolkning av data; i skriving av manus; eller i beslutningen om å sende inn manuskript for publisering. Vi er takknemlige for alle pasienter og frivillige som har donert blod til denne studien. Vi ønsker å takke professor Toshiyoshi Fujiwara (Okayama Universitetet Graduate School of Medicine, Okayama, Japan) for å gi nyttige kommentarer og forslag; Mr Yasuo Urata (Oncolys BioPharma, Tokyo, Japan) for å levere OBP-401; Dr Yukio Tsujino, Dr Toshiyuki Ozawa og Dr Akinori Masago (Sysmex Corporation, Kobe, Japan) for sine nyttig støtte; og Dr. Rebecca Devon (Genetics Unit og University of Edinburgh, Edinburgh, UK) for kritisk gjennomgang og redigering av manuskriptet. Vi er også mest takknemlig for klinisk personell.
Forfatternes opprinnelige innsendte filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes opprinnelige innsendte filer for bilder. 12885_2012_3365_MOESM1_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 1 12885_2012_3365_MOESM2_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 2 12885_2012_3365_MOESM3_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 3 12885_2012_3365_MOESM4_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 4 12885_2012_3365_MOESM5_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 5 Alle forfatterne har lest og godkjent den endelige manuskriptet.

• Terapeutiske potensialet av PRL-3 målretting og kliniske betydningen av PRL-3 genomisk forsterkning i magekreft
• Familiehistorie med kreft og gastroøsofageal lidelser og risiko for esophageal og mage adenokarsinomer: en case-control studie