Prognosztikai kimutatására életképes keringő tumorsejtek gyomorrákos betegek egy telomeráz-specifikus antivirális hatóanyag: egy prospektív vizsgálat

Prognosztikai kimutatására életképes keringő tumorsejtek gyomorrákos betegek egy telomeráz-specifikus antivirális hatóanyag: egy prospektív vizsgálat katalógusa Abstract katalógusa Háttér katalógusa azonosítása keringő tumorsejtek (CTC) a perifériás vérben hasznos megközelítés megbecsülni prognózis, monitor betegség progresszióját, és mérjük a kezelés hatását a különböző daganatok. Ugyanakkor klinikai jelentősége CTC ellentmondásos. Megkíséreltük kimutatására életképes CTC perifériás vérében gyomorrák betegek egy telomeráz-specifikus virális szerként.
Módszerek
Vettünk egy 7,5 ml-es vérmintát 65 kezelés-negatív gyomor rákos betegek műtét előtt és 10 egészséges önkéntesek. Azt észleltük, életképes CTC a vérminta inkubálása után őket egy telomeráz-specifikus, replikáció-szelektív, onkolitikus adenovirális ügynök hordozó a zöld fluoreszcens fehérje (GFP) gén (OBP-401). GFP-pozitív CTC definiáltuk, amelynek átmérője legalább 7,735 jim; ezt a küszöböt határoztuk vevő működési karakterisztika görbe analízis. GFP-pozitív sejteket megszámoltuk fluoreszcens mikroszkóp alatt.
Eredménye
szignifikáns különbség a teljes túlélés között a betegek 0-4 és azokat, ≥5 GFP-pozitív CTC a színpad I-IV betegség csoport szakasz és a II-IV előrehaladott betegség csoport. A több GFP-pozitív CTC nem kapcsolódó rák színpadon. Között a kóros elváltozásokat, a szám a GFP-pozitív CTC csak szignifikáns összefüggést a vénás invázió, bár voltak trendek felé GFP-pozitív CTC a betegség progressziója (tumor mélységi, nyirokcsomó áttét, távoli áttétek, nyirokér invázió, és a szövettani típus ).
Következtetések
szignifikáns összefüggés a több GFP-pozitív CTC és a teljes túlélés a gyomorrákos betegeknél. Kimutatására CTC segítségével OBP-401 hasznos lehet prognosztikai értékelését. Katalógusa Trial regisztrációs katalógusa University Hospital Medical Information Network Japánban UMIN000002018. Katalógusa Kulcsszavak katalógusa keringő tumorsejtek Gyomorrák Telomerase Háttér katalógusa távoli metasztázis egy szilárd tumor egy erős prognosztikai tényező [1-3]. A létezése keringő tumorsejtek (CTC) a perifériás vérből arra utal, hogy a páciens egy szisztémás betegség fázis [4]. Az azonosító CTC perifériás vérben hasznos megközelítés becslésére prognózis, monitor betegség progresszióját, és mérjük a kezelés hatását a mell, prosztata, bőr, vastagbél, gyomor-bélrendszeri daganatok. Ezért különféle módszereket fejlesztettek kimutatására CTC, és esetenként a kombinált használata. Közös technikák a dúsítási és felderítése CTC vannak sűrűség gradiens elválasztás [5], a közvetlen dúsítás szűréssel [6, 7], immunmágneses elválasztás [8], áramlási citometria, [9] a valós idejű reverz transzkriptáz polimeráz-láncreakció (RT- PCR) [10, 11], és mikrochip technológia [12].
sejtdúsításra sűrűséggradiens elválasztást végezzük kereskedelmi készletek, mint pl OncoQuick® (Greiner, Frickenhausen, Németország) [13] és Lymphoprep® (Nycomed, Oslo , Norvégia) [14]. Sűrűség gradiens elválasztás alapul az elmélet, hogy a különböző típusú sejteket elkülöníthetjük aszerint, hogy azok sűrűsége. Ezért nehéz a kivonat minden CTC miatt sejtek migrációját. RT-PCR az egyik leggyakoribb módszerek a tumorsejtek kimutatására, mert a magas érzékenysége és specificitása, feltételezve, hogy a megfelelő primer és próba tervezés. Azonban álpozitív eredmények is előfordulhatnak, mert a technikai csemege, és nagy érzékenységű [15, 16].
Immun sejtdúsításra, mint például, hogy végzett a CellSearch System® (Veridex, LLC, Raritan, NJ, USA) [ ,,,0],17], jelenleg a leggyakrabban alkalmazott technika, hogy gazdagítsa és észlelni CTC [18-21]. Az előnye immunomagnetikus sejt elválasztás az, hogy a CTC lehet láthatóvá fluoreszcens mikroszkóppal. Detektált sejtek elleni antitestekkel epithelialis markerek (hámsejt adhéziós molekulák EpCAMs) megállapíthatóan CTC. Ezért ez a technika gondoskodik hamis pozitív eredményt alapuló normál epiteliális marker expressziója a nem daganatos sejtek, és tévesen negatív eredményekhez vezethet hiánya alapján a szelektív marker expresszióját tumorsejteken. Ennek eredményeként a korlátozások kapcsolódó fenti megközelítések, egy új technika szükséges, hogy észlelni életképes CTC pontosan.
Telomerase fontos szerepet játszik a karcinogenezis, a rák terjedését, és metasztázis [22-24]. Az általunk kifejlesztett egy technikát, hogy kihasználják a nagy telomerázaktivitásra sejtekben. Ez a technika használ egy telomeráz-specifikus, replikáció-szelektív módosított virális ágens (OBP-401; TelomeScan®, Oncolys BioPharma, Tokió, Japán), amelyben az emberi telomeráz reverz transzkriptáz (Tercier
) gén promoter van behelyezve az E1 régiót , és a zöld fluoreszcens fehérje (GFP) gén szabályozása alá helyezzük, a citomegalovírus promoter az E3 régióba, mint a marker a vírusreplikáció [25]. Leírták, hogy a OBP-401 lehet használni kimutatására életképes CTC között normális vérsejtek [26, 27].
Itt alkalmaztuk az assay kimutatására életképes CTC azzal a veszéllyel metastasis gyomor rákos betegeknél. Azt észleltük, GFP-pozitív CTC. Ezzel szemben lehetőség van arra, hogy a nem rákos sejtek bocsátanak ki GFP fluoreszcenciáját OBP-401 fertőzés [28]. Ezért a kiválasztott sejtek nagyobb, mint egy küszöbérték által meghatározott összehasonlítása egészséges önkéntesekben és betegekben, mert CTC nagyobbak, mint a normális vérsejtek [7, 29, 30]. Vizsgáltuk az egyesület a GFP-pozitív CTC számot túlélés és kóros indexek a betegség progresszióját. Katalógusa Módszerek
betegek és egészséges önkéntesek katalógusa A betegek ebbe előzetes vizsgálatban kaptak, akik a tervezett műtéti kezelése; betegeknél, akik alkalmasak voltak arra, endoszkópos nyálkahártya reszekció vagy endoszkópos nyálkahártya alatti boncolás kizárták. A beválogatási kritériumok a következők voltak: (i) a szövettanilag igazolt adenocarcinoma a gyomor endoszkópos biopszia; (Ii) a klinikai magányos tumor; (Iii) nincs előzetes endoszkópos reszekció, a kemoterápia, vagy radioterápia; (Iv) életkor 20-80 év; (V) az Eastern Cooperative Oncology Group performance status [31] 0 vagy 1; (Vi) elegendő szerv funkciója; és (vii) írásos beleegyezését. A kizárási kritériumok a következők voltak: (i) szinkron vagy metakrón malignitás (Ii) a várandós vagy szoptató nők; (Iii) aktív vagy krónikus vírusos hepatitis; (Iv) aktív bakteriális vagy gombás fertőzés; (V) a diabetes mellitus; (Vi) a szisztémás kortikoszteroid; és (vii) instabil magas vérnyomás. A betegség szakaszában a betegek kórosan jellemezte a hetedik kiadása a TNM besorolás a Nemzetközi Rákellenes Unió [32]. A mélysége a tumor három beteg nélkül gastrectomia és a regionális nyirokcsomók öt beteg anélkül, hogy elegendő nyirokcsomó diagnosztizált sebészileg.
Minden beteg részt vett a kórház rendszeresen a műtét után, és ellenőrizték 3 havonta. A betegek is átesett endoszkópia és komputertomográfiás legalább évente egyszer, aszerint, hogy azok a betegség stádiuma és természetesen. Katalógusa is toborzott egészséges önkénteseken, amelyek kontrollként. Minden egészséges önkéntesek voltak alkalmazottai Sysmex Corporation és benne hét férfi (átlagéletkor 31,4 év, tartomány 24-39 év) és három nő (átlagéletkor 33,7 év, tartomány 26-48 év). Minden önkéntes résztvevők orvosi ellenőrzés a foglalkoztatásra és évente; szűrővizsgálatok benne orvosi interjúk, hallgatózás, mellkasröntgen, és a vér és a vizelet elemzéseket. Továbbá, mi végzett egyéni interjúk előtt mintavétel; minden önkéntes, aki jelenleg igénybe orvosi ellátást, terhes vagy szoptat, illetve aki levett vér a múlt hónapban volt zárva. katalógusa Virus katalógusa OBP-401, a telomeráz-specifikus, replikáció szelektív adenovírus szer, amelyben a TERT
promoter elem meghajtja a kifejezés az EIA
és az EBB-
gének és amelyben a GFP gén van beépítve, alkalmazzuk ebben a vizsgálatban. Az érzékenység és a specificitás az assay segítségével OBP-401 tanulmányozták korábban Kim et al. [27]. A vizsgálatot megismételtük ötször tesztet a minta, beleértve 1 MDA-MB-468 (mell karcinóma) sejteket és 7,5 ml vért, és a számok a GFP-pozitív sejtek 1, 1, 1, 2 és 3; A mintában a 20 MDA-MB-468 (mell karcinóma) sejtek, a számok a GFP-pozitív sejteket a 15., 17., 19., 22. és 24. vírusos mintákat -80 ° C-on.
Sejtvonalak és kultúra
A549 (tüdő karcinóma), HepG2 (hepatocelluláris karcinóma), HEC-1 (endometrium adenocarcinoma), KATO-III (gyomor karcinóma), és az SBC-3 (kissejtes tüdőkarcinóma) sejtvonalak kaptuk az egészségügyi Science Research Resources Bank (Osaka, Japán). A LNCaP (prosztata adenokarcinóma) és OVCAR-3 (petefészek-karcinóma) sejtvonalak beszerezhetők a Riken Cell Bank (Tokió, Japán). A sejteket tenyésztettük szerint a szállító előírásainak. MDA-MB-468 sejteket tenyésztettünk a korábban leírtak [27].
Minta előkészítése és a sejt számlálás
egy 7,5 ml-es perifériás véna vérmintát vettünk minden egyes páciens a műtét előtt, és minden egyes önkéntes. A mintákat húzott tartalmazó csövekbe citromsav, foszforsav, és a dextróz, és 4 ° C-on. A vizsgálatot úgy kezdjük, 48 órán belül.
A mintákat 5 percig centrifugáltuk 540 g, és a plazmát fázist eltávolítjuk. A sejteket ezután négyszer mossuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), majd kétszer Roswell Park Memorial Institute közegben. A mintákat fertőztük 4 × 10 8 plakk-képző egység (pfu) OBP-401 vírusok által inkubációs a közegben 24 órán át 37 ° C-on.
Után elhalt sejtek festődési által a vörös fluoreszcens reaktív festék L23102 (Life Technologies Corporation, Carisbad, CA, USA), OBP-401 vírusok voltak inaktivált, és a sejteket rögzítettük 2% -os paraformaldehid (PFA), 20 percig, szobahőmérsékleten.
A mintákat kezeljük felületaktív szer (Emalgen 2025 G; Kao Chemicals, Tokió, Japán) 10 percen át 40 ° C-tól bomlik vörös vérsejtek. Végül 7,5 ml vért létrehozásához használt két tárgylemezre mintát mikroszkópos elemzés. Minden GFP-pozitív sejtek a két dia megszámoltuk, egy számítógép-vezérlésű fluoreszcens mikroszkóp (IX71; Olympus, Tokió, Japán) és egy vizsgáztató vak, hogy a minta részleteit. A teljes vizsgálati idő 27,5 óra (1. ábra). 1. ábra jegyzőkönyv módosított "GFP-CTC Analitika". Minden egyes 7,5 ml-es perifériás véna vérmintát betegektől nyert műtét előtt és önkéntesek. A mintákat húzott tartalmazó csövekbe citromsav, foszforsav és a dextróz. A mintákat centrifugáljuk, és a plazmát fázist eltávolítjuk. Miután sejt mosás PBS-sel, és a Roswell Park Memorial Institute tápközeg, a mintákat fertőzött 4 × 108 PFU OBP-401 vírus. OBP-401 vírus inaktivált, és a sejteket rögzítettük 2% -os paraformaldehid (PFA). A mintákat kezeljük felületaktív anyag lebomlásának a vörös és fehér vérsejtek. Két tárgylemezre mintát 7,5 ml vért készült mikroszkópos elemzés. Minden GFP-pozitív sejtek a két dia megszámoltuk egy számítógép-vezérlésű fluoreszcens mikroszkóppal.
Meghatározása GFP fluoreszcencia intenzitás küszöb
küszöbértéke GFP fluoreszcencia intenzitás a következőképpen határozzuk meg. Mintegy 30.000 tenyésztett sejteket tüskés be 7,5 ml-es vérmintákat egészséges önkéntesektől, melyeket beoltott különböző rákos sejtvonalak: A549, HepG2, HEC-1, KATO-III, SBC-3, LNCaP, MDA-MB-MB468 és OVCAR -3. A vérmintákat vetjük alá CTC érzékelő esszé, majd kimutatható sejteket megszámoljuk fluoreszcens mikroszkópiával. Több, mint 100 sejtet analizáltunk minden mintánál. Meghatároztuk 2,85 × 10 7 azt jelenti, egyenértékű fluorokróm hogy a küszöbérték a GFP jelintenzitás a minimális GFP intenzitás szintet figyeltünk meg a vérminta beoltott sejtvonalak (2. ábra). Az adatokat, mint a számok a GFP-pozitív CTC per 7,5 ml-es perifériás vérminta. A 2. ábra a GFP jelet intenzitását a különböző rákos sejtvonalakban. Az alsó és a felső a doboz alsó és felső kvartilis, és a zenekar a doboz a medián. A vonalak a végén a bajusz minimális és maximális. Az y tengely képviseli GFP jelintenzitás egy logaritmikus skálán.
Immunfestést
fikoeritrinnel jelölt anti-humán CD45 ellenanyagot (BioLegend, San Diego, CA, USA) hígítottunk 1: 5 és Pacific Blue-jelölt anti-humán CD326 (EpCAM) antitestet (BioLegend) 1:10 arányban hígítottuk PBS-sel, amely 2% magzati borjúszérumot. A sejteket hígítjuk, antitestekkel 30 percen át 25 ° C-on. Mosás után PBS-sel, amely 2% magzati borjú szérumot, a sejteket üveg tárgylemezekre és elemeztük fluoreszcens mikroszkóppal (IX71; Olympus).
Statisztikai analízis
Statisztikai analízist JMP statisztikai Discovery 9.0.2 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Annak megállapításához, a sejt átmérőjének küszöbértéket, a detektált GFP-pozitív CTC segítségével elemeztük egy vevőt operating characteristic (ROC) görbe közötti származó minták gyomorrák betegek és azok önkéntesek. Ha több csoport összehasonlítására, homogenitása variancia értékelték a Levene teszt. Paraméteres összehasonlításokat használtuk varianciaanalízis és a nem paraméteres összehasonlítások Wilcoxon és a Kruskal-Wallis-próba. Mi használt Fisher és χ katalógusa 2 teszt egy 2 × 2 és 4 × 2 táblázat, illetve összehasonlítani a klinikopatológiai karaktereket a betegcsoportban. Kaplan-Meier görbék becsült betegségmentes túlélés és a teljes túlélés keletkeztek, és az összehasonlítások a csoportok között végeztük kétoldalas log-rank teszt. P katalógusa értékek ≤0.05 tekintettük statisztikailag szignifikánsnak.
A tanulmány által jóváhagyott intézményi Review Board a Showa Egyetem Észak Yokohama kórház. Elmondtuk a vizsgálati protokoll a betegek és az önkéntesek előtt adott írásos beleegyezését. Ez a tanulmány iktatták University Hospital Medical Information Network Japánban, több 000002018. katalógusa Eredmények katalógusa résztvevők demográfiai jellemzői
Hatvanöt beteg gyomor adenokarcinóma (46 férfi és 19 nő, átlagéletkor 58,8 év, tartomány 33 -76 év) műtéten átesett az emésztésre Disease Center a Showa Egyetem Észak Yokohama kórház között 2009 szeptembere és május 2011 vontak be a vizsgálatba. Huszonkilenc volt distalis resectio, 32 volt teljes gastrectomián és négy volt feltáró laparotómiával. A betegek jellemzőit az 1. táblázat tartalmazza Huszonnyolc a 65 beteg kapott kemoterápiát a műtét után. A kontroll csoportban 10 egészséges volunteers.Table 1 Betegjellemzők és kóros elváltozásokat katalógusa paraméterek Matton betegek száma
szex katalógusa Férfi katalógusa 46 fiatal női katalógusa 19 katalógusa Életkor (átlag, tartomány) hotelben 58,8, 33-76 katalógusa gastrectomián katalógusa distalis katalógusa 29 katalógusa Összesen katalógusa 32 katalógusa Nincs katalógusa 4 katalógusa Sebészeti megközelítés katalógusa laparoszkópia katalógusa 54 katalógusa Nyitott laparotomián katalógusa 11
gyógyíthatóság katalógusa R0 katalógusa 57 katalógusa R1 katalógusa 0 katalógusa R2 katalógusa 8 katalógusa TNM Stage katalógusa I
40 katalógusa II katalógusa 6 katalógusa III
10 katalógusa IV katalógusa 9 katalógusa Tumor mélysége invázió katalógusa T1 katalógusa 36
T2 katalógusa 8 katalógusa T3 katalógusa 9 katalógusa T4 katalógusa 12 katalógusa nyirokcsomó áttétek katalógusa N0 katalógusa 39 katalógusa N1 katalógusa 5 katalógusa N2
6 katalógusa N3 katalógusa 15 katalógusa távoli áttét katalógusa M0
56 katalógusa M1
9 katalógusa Main szövettani típus †
differenciált katalógusa 25 katalógusa differenciálatlan katalógusa 40
nyirokér invázió katalógusa LX katalógusa 4 katalógusa L0 katalógusa 35 katalógusa L1 katalógusa 26 katalógusa vénás invázió katalógusa VX katalógusa 4 katalógusa V0 katalógusa 35
V1-2 katalógusa 26 katalógusa † Nos vagy közepesen differenciált adenocarcinoma és papilláris adenokarcinóma kategorizáljuk differenciált típus. Pecsétgyûrûsejtes sejtes karcinóma, gyengén differenciált adenocarcinoma és mucinosus adenocarcinoma kategóriába soroljuk differenciálatlan típus.
GFP-pozitív CTC perifériás vérben
fluoreszcens mikroszkóppal, a sejteket fluoreszcens kibocsátás ≥2.85 × 10 7 azt jelenti, egyenértékű fluorokróm megszámoltuk a GFP-pozitív sejtek.
Különböző méretű GFP-pozitív sejtet figyeltünk meg minden minta; ezért nehéz volt azonosítani egy-egy képviselője sejt között a GFP-pozitív sejtek közötti összehasonlítást betegek és egészséges önkéntesek. Ezért, hogy ne használja egy tetszőleges értéket, úgy döntöttünk, hogy az optimális küszöbérték származó ROC analízis alapján a cella méretét, hogy van, 7,735 um, mint a küszöbérték meghatározása GFP-pozitív CTC (3. ábra). 3. ábra összehasonlítása sejtátmérővel betegek és önkéntesek. Annak megállapításához, a küszöböt, míg a átmérőjük sejtek gyomorrákos betegek és kontrollok ROC analízis. Szignifikáns különbség a gyomorrák betegek és a kontrollok (p
<0,001; a görbe alatti terület = 0,57; 95% -os megbízhatósági intervallum = 0,54-0,60).
Immunhisztokémiai festésével anti-EpCAM és anti-CD45 antitestek, azt megerősítette, hogy a GFP-pozitív CTC voltak EpCAM-pozitív és CD45-negatív (4. ábra). 4. ábra Példák mikroszkópos képeket. Reprezentatív képek két gyomorrák mintát GFP-pozitív CTC és immuncitokémiai elemzését anti-EpCAM- és anti-CD45-pozitív sejteket. A sejteket megszámoltuk egy számítógép-vezérlésű fluoreszcens mikroszkóp által egy vizsgáztató vak, hogy a minta állapotát. Skála, 10 jim.
A számok a GFP-pozitív CTC a perifériás vérmintákat az 5. ábrán látható nem volt szignifikáns különbség az észlelési arányt a GFP-pozitív CTC a mintákban képviselő minden rák szakaszban. 5. ábra száma GFP-pozitív sejtek. A pontok a számok a GFP-pozitív CTC a beteg mintákban. Az alsó és a doboz tetején képviseli az alsó és felső kvartilis, és a zenekar az egész doboz mutatja a medián. Az alsó és a felső rudak végein a bajuszát a legalacsonyabb adatpont 1,5 interkvartilis tartományok az alsó kvartilis, és a legmagasabb adatpont 1,5 interkvartilis tartományok a felső kvartilis, ill. A zöld sávok jelzik átlagértéket. Katalógusa Szövetsége GFP-pozitív CTC túlélés katalógusa átlagos száma GFP pozitív CTC a mintákban 10 egészséges önkéntest 4,8 volt. Osztottuk a betegeket két csoportra alapuló számok GFP pozitív CTC: 0-4 és ≥5. Klinikopatológiai jellemzői a két csoport foglalja össze a 2. táblázat Nem volt szignifikáns különbség a két csoport között, kivéve, hogy ott csak egy kategóriában a limfatikus metastasis.Table 2 Klinikopatológiai karakter két betegcsoport száma szerint CTC katalógusa száma CTC Matton 0-4 Matton 5 ≤ Matton P katalógusa érték Matton száma alanyok
41 katalógusa
24
TNM: Stage
0,1586 katalógusa Stage I
29 katalógusa 11
Stage II katalógusa 4 katalógusa 2

• Terápiás potenciálja a PRL-3 célzás és klinikai jelentősége PRL-3 genomi amplifikáció gyomorrák
• Családjában rákos és gyomor betegségek és a kockázat a nyelőcső és a gyomor adenocarcinoma: eset-kontroll study