impacto prognóstico da detecção de células tumorais circulantes viáveis ​​em pacientes com câncer gástrico utilizando um agente viral específico da telomerase: um impacto prognóstico prospectivo study

de detecção de células tumorais circulantes viáveis ​​em pacientes com câncer gástrico utilizando um agente viral específico da telomerase: um estudo prospectivo da arte abstracta
Fundo
a identificação de células tumorais (CTCs) em circulação no sangue periférico é uma abordagem útil para estimar o prognóstico, monitorar a progressão da doença, e medir os efeitos do tratamento em várias doenças malignas. No entanto, a relevância clínica de CTCs é controversa. Buscou-se detectar CTCs viáveis ​​no sangue periférico de pacientes com câncer gástrico utilizando um agente viral específico da telomerase.
Métodos
Nós levou uma amostra de sangue de 7,5 ml de 65 pacientes com câncer gástrico tratamento negativo antes da cirurgia e 10 saudáveis voluntários. Detectamos CTC viáveis ​​em amostras de sangue após a sua incubação com um, agente oncolítico replicação selectiva específica pela telomerase adenoviral transportando o gene fluorescente verde proteína (GFP) (OBP-401). GFP-positivas CTC foram definidos como tendo um diâmetro de pelo menos 7,735 m; este limiar foi determinado pelo receptor análise da curva característica de operação. GFP células positivas foram contadas sob um microscópio de fluorescência.

Resultados Houve uma diferença significativa na sobrevida global entre os pacientes com 0-4 e aqueles com ≥ 5 CTCs GFP positivas na fase I-IV grupo de doença e estágio II-IV grupo doença avançada. O número de CTCs GFP positivas não estava relacionado com o estágio do câncer. Entre os achados patológicos, o número de CTCs GFP positivas só foi significativamente relacionada com a invasão venosa, embora houvesse tendências para mais CTCs GFP positivas com a progressão da doença (profundidade do tumor, metástase linfonodal, metástases à distância, invasão linfática e tipo histológico ).
Conclusões
Houve uma relação significativa entre o número de CTCs GFP positivas e sobrevida em pacientes com câncer gástrico. A detecção de CTCs usando OBP-401 pode ser útil para avaliação prognóstica.
Registro de ensaios
Hospital University Medical Information Network no Japão, UMIN000002018.
Palavras-chave
circulação células tumorais do câncer gástrico fundo telomerase
metástases distantes de um tumor sólido é um forte factor de prognóstico [1-3]. A existência de células tumorais (CTCs) em circulação no sangue periférico sugere que um paciente está em fase de doença sistémica [4]. A identificação dos CTC no sangue periférico é uma abordagem útil para estimar prognóstico, monitorar a progressão da doença, e medir os efeitos do tratamento em mama, próstata, pele, cólon e doenças malignas gastrointestinais. Por isso, vários métodos têm sido desenvolvidos para detectar CTC, e são ocasionalmente usados ​​em combinação. As técnicas comuns para o enriquecimento e detecção de densidade são CTC separação por gradiente de [5], o enriquecimento por filtração directa [6, 7], separação imunomagnética [8], citometria de fluxo [9], em tempo real, a transcriptase inversa de reacção em cadeia da polimerase (RT- PCR) [10, 11], e microchip Technology [12].
celular enriquecimento por separação por gradiente de densidade é realizada utilizando-se kits comerciais, tais como OncoQuick® (Greiner, Frickenhausen, Alemanha) [13] e Lymphoprep® (Nycomed, Oslo , Noruega) [14]. separação por gradiente de densidade é baseada na teoria de que diferentes tipos de células pode ser separada de acordo com a sua densidade. Portanto, é difícil de extrair todos os CTC devido à migração de células. RT-PCR é um dos métodos mais comuns de detecção de células de tumor por causa da sua elevada sensibilidade e especificidade, assumindo iniciador adequada e a concepção da sonda. No entanto, resultados positivos falsos podem ocorrer devido à sua delicadeza técnica e alta sensibilidade [15, 16].
Enriquecimento de células imunomagnética, tal como a realizada pelo CellSearch System® (Veridex, LLC, Raritan, NJ, EUA) [ ,,,0],17], é atualmente a técnica mais utilizada para enriquecer e detectar CTCs [18-21]. A vantagem da separação imunomagnética célula é que CTC podem ser visualizadas com um microscópio fluorescente. Células detectadas com anticorpos contra marcadores epiteliais (moléculas de adesão de células epiteliais; EpCAMs) estão determinados a ser CTCs. Portanto, esta técnica pode fornecer resultados falso-positivas com base na expressão do marcador de epitélio normal por células que não de tumor, e os resultados falso-negativos podem surgir com base na ausência de expressão do marcador selectivo sobre as células tumorais. Como resultado das limitações associadas com as abordagens acima, é necessária uma nova técnica para detectar CTCs viáveis ​​precisamente.
Telomerase desempenha um papel importante na carcinogênese, invasão câncer e metástase [22-24]. Desenvolvemos uma técnica para explorar elevada actividade da telomerase em células. Esta técnica utiliza, um agente de modificação de replicação selectiva específica de telomerase-viral (OBP-401; TelomeScan®, Oncolys BioPharma, Tóquio, Japão), em que inverter a telomerase humana transcriptase (terc
) promotor de gene é inserido na região E1 e o gene fluorescente verde proteína (GFP) é colocado sob o controlo do promotor de citomegalovirus na região E3 como um marcador de replicação viral [25]. Tem sido relatado que a OBP-401 pode ser usado para detectar CTC viáveis ​​entre células sanguíneas normais [26, 27].
aqui, foi aplicado o ensaio para detectar CTC viáveis ​​com o potencial de metástases em doentes com cancro gástrico. Detectamos CTC GFP-positiva. Em contraste, é possível que as células não-cancerosas emitem fluorescência da GFP após a infecção OBP-401 [28]. Por isso, selecionamos células maiores do que um limite determinado pela comparação entre os voluntários saudáveis ​​e doentes, porque CTCs são maiores do que as células sanguíneas normais [7, 29, 30]. . Nós estudamos a associação de GFP-positivo número CTC com a sobrevivência e patológicos índices de progressão da doença
Métodos
doentes e voluntários saudáveis ​​
Os pacientes incluídos neste estudo preliminar foram aqueles submetidos a tratamento cirúrgico planejado; pacientes que eram adequados para ressecção endoscópica da mucosa ou dissecção submucosa endoscópica foram excluídos. Os critérios de inclusão foram: (i) histologicamente comprovada adenocarcinoma do estômago por biópsia endoscópica; (Ii) tumor solitário clínica; (Iii) não antes endoscópica ressecção, quimioterapia ou radioterapia; (Iv) 20-80 Idade anos; (V) estado de desempenho Eastern Cooperative Oncology Group [31] 0 ou 1; (Vi) a função do órgão suficiente; e (vii) consentimento informado por escrito. Os critérios de exclusão foram: (i) síncrona ou malignidade metacrônica; (Ii) as mulheres grávidas ou lactantes; (Iii) a hepatite viral ativa ou crônica; (Iv) bacteriana ativa ou infecção fúngica; (V) de diabetes mellitus; (Vi) a administração sistêmica dos corticosteróides; e (vii) a hipertensão instável. O estágio da doença nos pacientes foi patologicamente caracterizada usando a sétima edição da classificação TNM da União Internacional Contra o Cancro [32]. A profundidade do tumor em três pacientes sem gastrectomia e o estado regional de linfonodo de cinco pacientes sem linfadenectomia suficientes foram diagnosticados cirurgicamente.
Todos os pacientes atendidos nosso hospital regularmente após a cirurgia, e foram verificadas a cada 3 meses. Os pacientes também foram submetidos à endoscopia e tomografia computadorizada, pelo menos uma vez por ano, de acordo com seu estágio da doença e curso.
Nós também recrutou voluntários saudáveis ​​para atuar como controles. Todos os voluntários saudáveis ​​eram empregados da Sysmex Corporation e incluiu sete homens (idade média de 31,4 anos, variação 24-39 anos) e três mulheres (idade média de 33,7 anos, variação 26-48 anos). Todos os voluntários foram submetidos a check-ups médicos realizados aquando do emprego e por ano; check-ups incluiu entrevistas médicas, ausculta, radiografias de tórax e de sangue e análises de urina. Além disso, realizamos entrevistas individuais antes da coleta da amostra; qualquer voluntário que estava actualmente a receber tratamento médico, grávida ou amamentando, ou que havia doado sangue dentro do mês passado foi excluída.
Virus
OBP-401, um agente adenoviral replicação seletivo específico da telomerase em que o TERT
elemento promotor conduza a expressão do
EIA e BEI
genes, e no qual o gene GFP é integrado, foi utilizada neste estudo. A sensibilidade e a especificidade do ensaio usando OBP-401 têm sido estudados anteriormente por Kim et ai. [27]. O teste foi repetido cinco vezes testar na amostra incluindo um células MDA-MB-468 (carcinoma da mama) e 7,5 ml de sangue, e o número de células positivas para GFP foram de 1, 1, 1, 2 e 3; na amostra incluindo 20 células MDA-MB-468 (carcinoma da mama), o número de células positivas para GFP foram 15, 17, 19, 22 e 24. As amostras virais foram armazenados a -80 ° C. As linhas celulares e
a cultura
A549 (carcinoma do pulmão), HepG2 (carcinoma hepatocelular), HEC-1 (carcinoma do endométrio), KATO-III (carcinoma gástrico), e SBC-3 (carcinoma do pulmão de célula pequena), as linhas celulares foram obtidas a partir da Saúde ciência Research Resources Bank (Osaka, Japão). O LNCaP (adenocarcinoma da próstata) e OVCAR-3 (carcinoma do ovário) linhas celulares foram obtidas a partir da Riken Cell Bank (Tóquio, Japão). As células foram cultivadas de acordo com as especificações do fornecedor. As células MDA-MB-468 foram cultivadas como anteriormente descrito [27] A preparação das amostras e a contagem de células
Uma amostra de sangue da veia periférica de 7,5 ml.
foi obtida de cada paciente antes da cirurgia e a partir de cada voluntário. As amostras foram retiradas para tubos contendo ácido cítrico, ácido fosfórico, e de dextrose, e armazenadas a 4 ° C. O ensaio foi iniciado dentro de 48 h.
As amostras foram centrifugadas durante 5 min a 540 g e a fase de plasma foi removido. As células foram então lavadas quatro vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e duas vezes com meio de Roswell Park Memorial Institute. As amostras foram infectadas com 4 x 10 8 unidades formadoras de placas (PFU) de vírus OBP-401 por incubação no meio durante 24 horas a 37 ° C.
Após a coloração de células mortas pelo vermelho fluorescente reactivo corante L23102 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, EUA), OBP-401 eram vírus inactivado e as células foram fixadas com paraformaldeído a 2% (PFA) durante 20 min à temperatura ambiente.
As amostras foram tratadas com um tensioactivo agente (Emalgen 2025 L; Kao Chemicals, Tóquio, Japão) durante 10 min a 40 ° C para degradar as células vermelhas do sangue. Finalmente, o sangue de 7,5 ml foi usada para criar duas amostras lâmina de vidro para análise microscópica. Todas as células GFP positivas sobre as duas lâminas foram contados, usando um microscópio de fluorescência, controlado por computador (IX71; Olympus, Tóquio, Japão) e um examinador que desconhecia os detalhes da amostra. O tempo total de ensaio foi de 27,5 h (Figura 1). Figura 1 Protocolo e procedimento da "GFP-CTC Ensaio". Cada amostra de sangue da veia periférica de 7,5 ml foi obtido a partir de doentes antes da cirurgia e a partir de voluntários. As amostras foram retiradas para tubos contendo ácido cítrico, ácido fosfórico e dextrose. As amostras foram centrifugadas e a fase de plasma foi removido. Depois de lavagem das células utilizando PBS e meio de Roswell Park Memorial Institute, as amostras foram infectadas com 4 x 108 PFU de vírus da OBP-401. vírus OBP-401 foi inactivado e as células foram fixadas com paraformaldeído a 2% (PFA). As amostras foram tratadas com um agente tensio-activo para degradar as células vermelhas e brancas do sangue. Duas amostras lâmina de vidro a partir do sangue de 7,5 ml foram preparados para análise microscópica. Todas as células GFP positivas sobre as duas lâminas foram contadas utilizando um microscópio de fluorescência controlado por computador.
Determinação do limiar de intensidade de fluorescência da GFP
O limiar para a intensidade de fluorescência da GFP foi determinado como se segue. Aproximadamente 30000 células cultivadas foram inoculadas em amostras de 7,5 ml de sangue de voluntários saudáveis, que foram adicionadas com várias linhas celulares de cancro: A549, HepG2, HEC-1, KATO-III, SBC-3, LNCaP, MDA-MB-MB468 e OVCAR -3. As amostras de sangue foram submetidas a ensaio de detecção CTC, e, em seguida, as células detectáveis ​​foram contadas por microscopia de fluorescência. Mais de 100 células foram analisadas em cada amostra. Determinou-se 2,85 x 10 7 significa fluorocromo equivalente a ser o limiar para a intensidade do sinal de GFP a partir do nível de intensidade de GFP mínima observada no sangue amostras inoculadas com as linhas de células (Figura 2). Os dados são apresentados como o número de CTC GFP-positiva por amostra de sangue periférico de 7,5 ml. Figura 2 sinais de intensidades de GFP a partir de várias linhas celulares de cancro. A parte inferior e superior da caixa são os quartis inferior e superior, e da banda da caixa é a mediana. As linhas no fim dos bigodes são mínimo e máximo. O eixo y representa a intensidade do sinal de GFP numa escala logarítmica
imunocoloração
ficoeritrina marcada com anticorpo CD45 anti-humano (BioLegend, San Diego, CA, EUA) foi diluída 1:. 5 e Pacífico azul-anti-humano marcado CD326 (EpCAM) anticorpo (BioLegend) foi diluído 1:10 em PBS contendo soro fetal bovino a 2%. As células foram incubadas com anticorpos diluídos durante 30 min a 25 ° C. Depois de se lavar com PBS contendo soro fetal bovino a 2%, as células foram montadas em lâminas de vidro e analisadas utilizando um microscópio de fluorescência. (IX71; Olympus)

análise estatística A análise estatística foi realizada utilizando JMP 9.0.2 Descoberta estatística (SAS Institute, Cary, NC, EUA). Para determinar o limiar de diâmetro da célula, os CTC GFP positivas detectadas foram analisadas usando uma curva receiver operating characteristic (ROC) entre as amostras de doentes com cancro gástrico e aqueles a partir de voluntários. Para múltiplas comparações entre os grupos, a homogeneidade de variância foi avaliada pelo teste de Levene. Para comparações paramétricos foi utilizado a análise de variância, e para comparações não paramétricos foi utilizado o Wilcoxon e os testes de Kruskal-Wallis. Usamos exato de Fisher e χ
2 testes com um 2 × 2 e uma mesa de 4 × 2, respectivamente, para comparar os caracteres clinicopatológicos no grupo de pacientes. As curvas de Kaplan-Meier de sobrevida livre de doença estimada e sobrevida global foram gerados, e as comparações entre os grupos foram realizadas utilizando um teste de log-rank de dois lados. P
valoriza ≤0.05 foram considerados estatisticamente significativos.
O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board da Universidade Showa, Northern Hospital Yokohama. Explicamos o protocolo de estudo para os pacientes e voluntários antes que eles assinaram consentimento informado. Este estudo foi registrado com a Rede de Informação Medical University Hospital no Japão, o número 000002018.
Resultados
As características dos participantes
Sessenta e cinco pacientes com adenocarcinoma gástrico (46 homens e 19 mulheres, com idade média 58,8 anos, faixa 33 -76 anos) submetidos à cirurgia no Centro de Doenças do Norte Yokohama Hospital Universitário Showa digestivo entre setembro de 2009 e maio de 2011 foram incluídos no estudo. Vinte e nove tiveram gastrectomia distal, 32 tinham gastrectomia total, e quatro tiveram laparotomia exploradora. As características dos pacientes estão resumidas na Tabela 1. Vinte e oito dos 65 pacientes receberam quimioterapia após a cirurgia. O grupo controle foi composto de 10 volunteers.Table 1 características saudáveis ​​do paciente e achados patológicos
Parâmetros
número de pacientes
Sexo Masculino

46
Feminino
19
Idade (média de intervalo)
58,8, 33-76
Gastrectomia distal

29
total
32
Nenhum 4
Surgical abordagem
Laparoscopia
54
Abrir laparotomia
11
curabilidade
R0
57
R1
0
R2
8
TNM Stage
I
40
II
6
III
10
IV
9
profundidade tumor de invasão
T1
36
T2
8
T3
9
T4
12
metástases linfonodais
N0
39
N1
5
N2
6
N3
15
metástases à distância
M0
56
M1
9
principal tipo histológico †
Diferenciada
25
indiferenciado
40
linfática invasão
LX 4
L0
35
L1
26
venoso invasão
VX 4
V0
35
V1-2
26
† Bem ou moderadamente adenocarcinoma diferenciado e adenocarcinoma papilar foram classificados como tipo diferenciado. carcinoma de células em anel de sinete, adenocarcinoma pouco diferenciado e adenocarcinoma mucinoso foram classificados como tipo indiferenciado. CTCs
GFP-positivas no sangue periférico
Usando um microscópio de fluorescência, células com emissões fluorescentes ≥2.85 × 10 7 médio equivalente fluorocromo foram contadas como células GFP positivas
vários tamanhos de células GFP positivas foram observadas em cada amostra.; Por isso, foi difícil de identificar uma célula representativa entre as células positivas para GFP para comparação entre os pacientes e em voluntários saudáveis. Portanto, para evitar o uso de um valor arbitrário, decidimos utilizar o limite óptimo derivada a partir da análise ROC com base no tamanho da célula, isto é, 7,735 mm, como o limiar para definir CTC positivas para GFP (Figura 3). Figura 3 Comparação de diâmetro da célula e entre pacientes voluntários. Para determinar o limiar, compararam-se os diâmetros de células de doentes com cancro gástrico e dos controlos por análise ROC. Houve diferença significativa entre os pacientes com câncer gástrico e os controles (p
< 0,001; área sob a curva = 0,57; 95% intervalo de confiança = 0,54-0,60)
por coloração imuno-histoquímica utilizando anti-EpCAM e. anticorpos anti-CD45, confirmou-se que CTC GFP-positivas foram EpCAM-positivas e CD45-negativas (Figura 4). Figura 4 Os exemplos de imagens microscópicas. Imagens representativas de duas amostras com câncer gástrico de CTCs GFP positivas e análise imunocitoquímica de anti-EpCAM- e células anti-CD45-positivos. As células foram contadas utilizando um microscópio controlado por computador de fluorescência por um experimentador cego ao estado da amostra. Barra de escala, 10 ^ m. Os números de
CTC GFP positivas nas amostras de sangue periférico são mostrados na Figura 5. Não houve diferença significativa entre as taxas de detecção de CTC GFP positivas nas amostras representativas de cada fase do cancro. Figura 5 Número de células positivas para GFP. Os pontos são os números dos CTCs GFP positivas nas amostras de pacientes. A parte inferior e superior da caixa representam os quartis inferior e superior, ea banda do outro lado da caixa mostra a mediana. As barras superiores e inferiores nas extremidades dos bigodes mostrar o menor ponto de dados a 1,5 interquartis do quartil mais baixo, e o ponto de dados mais elevado dentro 1,5 interquartis do quartil superior, respectivamente. As barras verdes indicam valor médio.
Associação de CTCs GFP positivas com a sobrevivência
O número médio de CTCs GFP positivas nas amostras de 10 voluntários saudáveis ​​foi de 4,8. Os pacientes foram divididos em dois grupos com base nos números de CTCs GFP positivas: 0-4 e ≥5. As características clinicopatológicas dos dois grupos estão resumidos na Tabela 2. Não houve diferença significativa entre os dois grupos, exceto que havia apenas uma categoria de linfáticos metastasis.Table 2 caracteres clínicopatológicos de dois grupos de pacientes por número de CTCs
Número de CTCs
0-4
5 ≤
P
valor
Número de indivíduos
41

24
TNM: Stage
0,1586
Fase I
29
11
Stage II 4
2
Stage III
4
6
Stage IV 4
5
TNM: categoria T
0,2753
T1
26
10
T2
5 Sims 3
T3
5 4
T4
5
7
TNM: categoria N
0,0257 *
N0
27
12
N1
5
0
N2 4
2
N3
5
10
TNM: categoria M
0,2121
M0
37
19
M1 4
5
tipo histológico principal
0,6844 tipo
Diferenciada
15
10
tipo indiferenciado
26
14
linfática invasão
0,3177
Lx Página 2 Página 2
L0
25
10
L1
14
12
invasão venosa
0,1293
Vx Página 2 Página 2
V0
26
9
V1-2
13
13
Cirurgia
0,2124
ressecção curativa
38
19
não-curativa ressecção
1 | 3
Sem ressecção Página 2
2
quimioterapia pós-operatória
0,1672
Presença
15
13
Ausência
26
11
* * diferença significativa.
Figura 6a mostra a Kaplan curvas -Meier para a sobrevida global em dois grupos: os pacientes com 0-4 CTCs e aqueles com ≥5. Houve diferença significativa entre os dois grupos (p = 0,0021
). Além disso, nos pacientes com câncer gástrico avançado com doença em estágio II-IV, houve uma diferença significativa entre os dois grupos (p = 0,0126
) (Figura 6b). Figura 6 A sobrevida global. (A) A sobrevivência global de todos os pacientes. (B) A sobrevida global de pacientes com doença em estágio II-IV. Sobrevivência foi comparado de acordo com o número de CTCs usando análise de Kaplan-Meier e as estatísticas de log-rank. ** P Art < 0,01, p * Art < 0,05.
Associação de CTCs GFP positivas com índices patológicos
Não houve relação significativa entre o número de CTCs GFP positivas e estágio do câncer (p = 0,2313
) (Figura 5). Embora não se observou qualquer significado estatístico, o número de CTC GFP-positivas tendem a aumentar com a progressão do tumor primário (p = 0,1521
) (Figura 7a). O número de CTC nas amostras dos pacientes com nódulos positivos era maior do que nos pacientes nó-negativo (p = 0,1752
) (Figura 7b). Em comparação com os pacientes sem metástases distantes, aqueles com metástases distantes tinham números semelhantes de CTCs GFP positivas (p = 0,5655
) (Figura 7C). Não houve uma diferença significativa entre o tipo diferenciado e indiferenciado (p = 0,8387
) (Figura 7d). Os números dos CTC foram semelhantes nas amostras de doentes com e sem invasão linfático (P = 0,2054
) (figura 7e). Para invasão venosa, o número de CTC nas amostras dos pacientes com invasão foi significativamente maior do que em pacientes sem invasão (p = 0,0351
) (Figura 7F). Figura 7 Relação entre o número de CTC positivas para GFP em uma amostra de sangue de 7,5 ml a partir de doentes com cancro gástrico e descobertas patológicas nos pacientes. Os pontos são os números dos CTCs GFP positivas nas amostras de pacientes. A parte inferior e superior da caixa representam os quartis inferior e superior, ea banda do outro lado da caixa mostra a mediana. As barras superiores e inferiores nas extremidades dos bigodes mostrar o menor ponto de dados a 1,5 interquartis do quartil mais baixo, e o ponto de dados mais elevado dentro 1,5 interquartis do quartil superior, respectivamente. um, Tumor profundidade de invasão (T1-T4 indicam o aumento da profundidade). b, linfática metástase (N0 = negativo, N1-3 = positivo). c, metástase distante (M0 = negativo, M1 = positivo). d, tipo histológico (tipo diferenciado e tipo indiferenciado). e, linfática invasão (L0 = negativo, L1 = positivo). f, invasão venosa (V0 = negativo, V1 = positivo), * p Art < 0,05. Embora apenas invasão venosa mostrou uma diferença estatisticamente significativa, houve algumas tendências para um aumento no número CTC com o aumento da progressão da doença.
Discussão
Este artigo relata a correlação entre CTCs e câncer gástrico, que é a segunda principal causa de morte no mundo relacionada ao câncer. A utilidade da detecção do CTC para o diagnóstico, a estimativa de prognóstico, e a avaliação dos efeitos do tratamento já foi relatada por mama [27, 33], da próstata [34], do pulmão [35] e do tracto digestivo [11, 36, 37 ] cancros. Este estudo indica que ele também é útil para câncer gástrico.
Um dos principais resultados do nosso estudo foi uma relação significativa entre o número de CTCs e prognóstico. Embora tenhamos usado um curto período de acompanhamento, o prognóstico de pacientes que tiveram ≥ 5 CTCs em suas amostras de sangue periférico de 7,5 ml foi pobre. Os pacientes com doença em estágio inicial geralmente têm uma menor taxa de recorrência [38], e aqueles com doença em estádio I, na verdade, não tiveram recorrência em nosso estudo. Também calculamos a taxa de sobrevivência em pacientes com câncer gástrico avançado com o estágio da doença II-IV, e mostrou que estes pacientes tinham um padrão de sobrevida semelhante àqueles com doença em estádio I-IV. Estes resultados sugerem que a quimioterapia pré ou tratamento abrangente é apropriada para pacientes com doenças avançadas que têm muitos CTCs em amostras de pré-tratamento por causa de seu mau prognóstico.
Entre os nossos achados patológicos, apenas a invasão venosa teve uma relação significativa com o número de CTCs. Isto sugere acordo entre a patologia tradicional ea tecnologia molecular moderna. Acreditamos que a falta de uma diferença significativa entre o número de CTC detectados pelo nosso ensaio e os outros índices patológicos pode ser explicada por problemas metodológicos, tais como o pequeno tamanho da amostra. Nossa técnica funcionou bem como uma ferramenta de avaliação do prognóstico - para fornecer informações sobre a necessidade de terapia adjuvante pós-operatória - e pode fornecer uma ferramenta auxiliar útil para classificação baseada em patologia
Não é claro se todas as CTCs detectados têm potencial metastático.. CTCs viáveis ​​foram detectados nas amostras de pacientes com câncer em estágio inicial no presente estudo, mas quase todos os pacientes do grupo fase I sobreviveu sem recorrência [38]. Temos a intenção de confirmar se as células cancerosas resistentes, como as células-tronco do câncer, estavam presentes nas células GFP positivas detectadas. Além disso, vamos analisar as funções de CTCs viáveis ​​individualmente após a separação de células, e identificar CTCs com potencial metastático usando ferramentas adicionais, tais como análise de DNA ploidia [39, 40]. Além disso, perfil de expressão gênica entre CTCs viáveis, células mortas, tumores primários e tumores metastáticos irá revelar informações importantes relacionadas com os mecanismos de metástase do câncer.
Nossos resultados devem ser interpretados com cautela, considerando as limitações deste estudo. Em primeiro lugar, o número de CTCs variaram amplamente entre os indivíduos, incluindo pacientes e voluntários saudáveis. Além disso, não foi influenciado pelo estágio do tumor ou a presença de metástases clinicamente detectáveis. Da mesma forma, não houve associação entre a presença de metástases (linfonodo ou distante) ou invasão e o número de CTCs, o que põe em causa a utilização de CTCs de prever potencial metastático. No entanto, é possível que o tamanho relativamente pequeno da amostra limitou o potencial para detectar diferenças reais entre estes grupos de doentes. Finalmente, deve-se reconhecer que os nossos resultados só são aplicáveis ​​ao pré-operatório, câncer gástrico virgem de tratamento e não deve ser generalizada a outros tipos de câncer.
Claramente, mais estudos em uma população maior de pacientes, e com diferentes tipos de câncer , são necessários para esclarecer a aplicabilidade clínica da detecção de CTC. Estamos agora a preparar um estudo para investigar os efeitos do tratamento do câncer gástrico sobre o número de CTCs, que deve ajudar a estabelecer a sua relação com a progressão da doença futuro e se a contagem CTC pode ajudar escolha guidetherapy.
Conclusões
Houve um diferença significativa na sobrevida entre pacientes com 0-4 CTCs e aqueles com ≥5. No entanto, não está claro se todas as CTCs tem verdadeiro potencial metastático, e mais estudos são necessários.
Declarações
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada em parte por um Grant-in-Aid para contestar Investigação exploratória (23659308) da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS). O organismo de financiamento não desempenhou nenhum papel no desenho do estudo; na recolha, análise ou interpretação dos dados; na redação do manuscrito; ou na decisão de enviar o manuscrito para publicação. Somos gratos a todos os pacientes e voluntários que doaram sangue para este estudo. Nós gostaríamos de agradecer ao Professor Toshiyoshi Fujiwara (Okayama University Graduate School of Medicine, Okayama, Japão) para fornecer comentários e sugestões úteis; Sr. Yasuo Urata (Oncolys BioPharma, Tóquio, Japão) para o fornecimento da OBP-401; Dr. Yukio Tsujino, Dr Toshiyuki Ozawa e Dr Akinori Masago (Sysmex Corporation, Kobe, Japão) pelo seu apoio útil; e Dr Rebecca Devon (Unidade de Genética e Universidade de Edimburgo, Edimburgo, Reino Unido) para análise crítica e edição do manuscrito. Nós também estamos muito gratos ao pessoal clínico.
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