| Stomach Health > žalúdok zdravie >  > Stomach Knowledges > výskumy

ZIC1 moduluje distribúcie bunkového cyklu a migráciu buniek prostredníctvom regulácie zvukové ježka, PI3K a MAPK signálnych dráh u karcinómu žalúdka

ZIC1 moduluje distribúcie bunkového cyklu a migráciu buniek prostredníctvom regulácie zvukové ježka, PI 3K a MAPK signálnych dráh u karcinómu žalúdka
abstraktné
pozadia
ZIC1, vitálny transkripčný faktor s zinkový prst domén, má sú zapojené do procesu nervového vývoja. skôr sme ukázali, že ZIC1 môže pôsobiť ako nádorový supresor gastrointestinálnych nádorov. Avšak molekulárnej mechanizmus základnej účasť ZIC1 v progresii nádoru zostáva neznámy.
Metódy
rolu ZIC1 na proliferáciu buniek a migrácia bola skúmaná. Reguláciu zvukového ježka (Pst), fosfoinositid 3-kináza (PI 3K) a mitogénom aktivovanej proteín kinázy (MAPK), signálne dráhy po ektopickej expresie ZIC1 v nádorových bunkách žalúdku boli vyhodnotené.
Výsledky
nadmerná expresia ZIC1 prispieva k inhibícii migrácie proliferácie buniek a distribúciu bunkového cyklu u karcinómu žalúdka. Modulácia G1 /S kontrolného bodu od ZIC1 je sprostredkovaný najmä prostredníctvom regulácie cyklin-dependentných kinas (p21 Waf1 /Cip1, P27 Kip1 a cyklin D1). Okrem toho ZIC1 možno deaktivovať úroveň phospholated Akt a ERK1 /2 a transkripčný regulovať sonic hedgehog (SHH) návestné, čo vedie k regulujú expresiu p21 Waf1 /Cip1 a cyklin D1. Nakoniec sme systematicky identifikované ZIC1 downstream ciele na základe analýzy cDNA microarray, a zistilo sa, že 132 gény sú down-regulované a 66 gény sú up-regulované po transfekciu s ZIC1 v nádorových bunkách žalúdka. Tieto kandidátnej gény hrajú kľúčovú úlohu v bunkovej proliferácii, bunkového cyklu a bunkovú motilitu.
Závery
nadmerná expresia ZIC1 následok inaktiváciu SHH, PI 3K a MAPK signalizačnej dráhy, ako aj regulácia, viac následných cieľov ktoré sú nevyhnutné pre rozvoj a progresiu karcinómu žalúdka. ZIC1 slúži ako potenciálny terapeutický cieľ pre rakovinu žalúdka.
Kľúčové
ZIC1 Sonic hedgehog bunkového cyklu nádor šumom pozadia
ZIC1, jeden z piatich Zic rodinných génov, je zapojená v rôznych vývojových procesov, vrátane neurogeneze a myogenesis [1, 2]. V poslednej dobe, ZIC1 bol dokumentovaný k účasti na progresiu ľudských nádorov, vrátane rakoviny endometria, meduloblastómu, mezenchymálnych nádorov a nádorov liposarkómom [3-6]. Už skôr sme ukázali, že ZIC1 gén je významne downregulated v karcinómu žalúdka tkanív a bunkových línií pri porovnaní s normálnou žalúdočné tkaniva. Okrem toho, ZIC1 prípadne slúži ako nádorový supresor inhibíciou bunkovej proliferácie vo buniek karcinómu žalúdka a kolorektálneho [7, 8]. Ako dôležitý transkripčný faktor, ZIC1 má zásadný význam pre reguláciu ježko signalizácie (hh), kostné morfogenetické proteín (BMP), a Notch signálne dráhy v nervovej vývoj [2, 9]. Avšak málo sa vie o tom, ako ZIC1 reguluje signálnych dráh a ich príbuzných downstream cieľov v progresii rakoviny.
Rakovinou žalúdka je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na nádorové ochorenie na celom svete [10, 11]. Hh signalizácia je jedným z kľúčových onkogénnych signálnych dráh zapojených do žalúdočnej karcinogenéze [12, 13]. Sonic hedgehog (Pst), člen rodiny cicavčích Hh [14], bolo preukázané, že ako up-regulované v žalúdočných rakovinových tkanivách in situ hybridizácia testu a nevyhnutné pre progresiu rakoviny žalúdka [13, 15]. Hh signalizačné dráha je aktivovaná SHH väzba s opravenou (PTCH) - vyhladená (SMO) membráne komplexu receptora [16]. Aktivácia SHH podporuje žalúdočnú diferenciáciu nádorových buniek a proliferáciu. Bolo oznámené, že ZIC1 môže znížiť expresiu PTCH1 stroje a Psst
génov v nervovom tkanive počas vývoja predného mozgu [17]. Na rozdiel od toho dôkazy ukázali, že Pst potláča expresiu ZIC1 pri vývoji neurálnej trubice [18]. Avšak, vplyv ZIC1 na Hh signálnej dráhy u rakoviny žalúdka zostáva neznámy.
ZIC1 tiež upravuje niekoľko cieľov, vrátane cyklin D1, p27, Wnt1 a Wnt7a pri nervovom vývoji v Xenopus ectodermal explantátů a mutovaných myší modely [9, 19, 20]. Máme záujem predovšetkým o regulátorov bunkového cyklu sú dôležité pre proliferáciu a diferenciáciu nádorových buniek. Už skôr sme ukázali, že nadmerná expresia ZIC1 môže zmeniť G1 /S prechod do buniek karcinómu žalúdka [8]. Niekoľko mechanizmov závislých kináz cyklin (CDK) sa podieľajú na regulácii G1 /S kontrolného bodu v ľudskej rakoviny [21]. Pri prechode z G1 do S fázy, cyklin D, ktorá tvorí aktívnu komplexy s CDK4 je up-regulovaný u rakoviny žalúdka [22, 23]. Strata cyklin závislých inhibítorov kináz, ako je p21 Waf1 /Cip1 a p27 Kip 1 propagovať CDK2 aktivitu a regulujú G1 /S prechod [12, 24]. Nedávne štúdie preukázali, že mutant ZIC1 alebo sila nadmerná expresia ZIC1 reguluje expresiu p27 Kip 1 u myší mozočku tkanív a buniek liposarkóm [3, 20]. Je zaujímavé, že Pst signálne dráhy negatívne reguluje p21 Waf1 /Cip1 a cyklin D1 spôsobom GLI1 závislé [16, 25]. Avšak to, či ZIC1 môžu úzku spoluprácu s SHH dráhy v regulácii distribúcie bunkového cyklu nebola definovaná. Objasnenie tejto signalizačnej siete môže poskytnúť ďalšie poznatky o úlohe ZIC1 v karcinómu žalúdka.
V našej štúdii sme ukazujú, že nadmerná expresia ZIC1 potláča žalúdočnú migráciu a inváziu nádorových buniek, rovnako ako distribúcia mení na fázu bunkového cyklu. ZIC1 môže Transkripční znižuje expresiu signalizáciu Psst a potlačiť úroveň phospholated Akt a Erk, čím dochádza k regulácii regulátora bunkového cyklu kinázy p21 Waf1 /Cip1, P27 Kip1 a cyklin D1 do buniek karcinómu žalúdka. Tiež sme identifikovali niekoľko dôležité ZIC1 downstream ciele v buniek karcinómu žalúdka analýzou cDNA microarray.
Výsledky
ZIC1 inhibuje proliferáciu, migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka
Pre stanovenie účinku ZIC1 na proliferáciu buniek, sme vykonali životaschopnosť buniek analýza MTS testy in buniek karcinómu žalúdka. Žalúdočné rakovina bunkové línie (AGS, MKN28, BGC823 a SGC7901) boli transfekovány pCDNA3.1-ZIC1 alebo prázdnym vektorom pCDNA3.1. Účinnosť transfekcia bola potvrdená pomocou RT-PCR a westernovým prenosom v danom poradí (obrázok 1A). Výsledky ukázali, že počet živých buniek bola významne potlačená ektopickú expresiou ZIC1 v 5-dňové pozorovanie v BGC823 bunkách (Obrázok 1B) a. Potlačenie bunkovej proliferácie ZIC1 bolo v súlade s našimi predchádzajúcimi pozorovaniami v AGS a MKN28 rakovina žalúdka bunky, rovnako ako bunky rakoviny hrubého čreva [7, 8]. Obrázok 1 ZIC1 potláča bunkovú proliferáciu a migráciu v rakoviny žalúdka. (A), rakovina žalúdka bunkové línie (AGS, MKN28, BGC823 a SGC7901) boli stabilne transfekovány pCDNA3.1-ZIC1 alebo prázdnym vektorom pCDNA3.1. Úrovne expresie mRNA a proteínu ZIC1 boli vykonané pomocou RT-PCR (horný obrázok) a Western blot (low obrázok). GAPDH a β-aktínu bol použitý ako vnútornej kontroly. (B) Životaschopnosť buniek karcinómu žalúdka bunkové línie (BGC823) bola stanovená MTS testu bunkovej proliferácie. Hviezdička označuje štatistickú významnosť (** p < 0. 01). (C) Migrácia buniek bola hodnotená upravený Boyden Transwellovy komory testy po inkubácii počas 16 hodín. Bunky, ktoré migrovali do spodnej časti membrány boli zafarbené DAPI. (D) Počet viditeľných migračných buniek (priemer ± S.D) bol odhadnutý počítaním päť náhodných vysoko výkonné pole (x 400 zväčšenie). Tieto experimenty boli vykonané v troch opakovaniach. Sú ukázané reprezentatívne údaje. Hviezdička znamená, štatistickej významnosti (*** p 0,001).
Okrem toho sme zistili úlohu ZIC1 v migrácii a invázii buniek u rakoviny žalúdka. migrácie a invázie buniek testy boli vykonávané v transwell migrácii a Matrigel potiahnuté invázie testovacích systémov, resp. Pozorovali sme, že re-expresia ZIC1 výrazne potlačená migráciu buniek v AGS, BGC823 a SGC7901 žalúdočných nádorových bunkových línií (p 0,001) (obr 1C, D). Okrem toho, re-expresia ZIC1 vykazovali významne nižšiu aktivitu bunkovej invázie pri porovnaní s tými prázdnych vektorové transfektanty v AGS bunkách (p 0,05) (ďalšie súbor 1: Obrázok S1). Tieto údaje naznačujú, že ektopická expresia ZIC1 potláča žalúdočnú migráciu a inváziu nádorových buniek.
ZIC1 mení distribúcie bunkového cyklu a reguluje expresiu cyklin-dependentných kináz vo buniek karcinómu žalúdka
Pre ďalšie pochopenie mechanizmov, na ktorých je inhibícia proliferáciu buniek nadmernou expresiou ZIC1 sme vyhodnotili distribúcie bunkového cyklu v rakovinových bunkách žalúdka. Pozorovali sme vyšší podiel buniek vo fáze G1 v AGS (42,74%) a SGC7901 (54,03%), bunkových línií po zvýšenej expresiu ZIC1. Avšak, v bunkách transfekciou kontrolnom vektorom, tento podiel bol znížený a to ako v AGS (32,66%) a SGC7901 (47,00%) a podiel buniek v S-fáze bol relatívne vyšší (obrázok 2A). Je všeobecná zhoda, že p21 (známy tiež ako p21 Waf1 /Cip1) a p27 (známy tiež ako p27 KIP1), dva hlavné inhibítory cyklin-dependentnej kinázy, sú nutné pre ukončenie pri vstupe do S-fázy [26]. Aktivácia cyklin D1, však, je hlavne zodpovedné za reguláciu G1-S fázový prechod [23]. Preukázali sme, že hladina expresie cyklín D1 proteínu bola znížená, zatiaľ čo p21 a p27 boli výrazne indukovaná v rakovinových bunkách žalúdku transfekciou pCDNA3.1-ZIC1 v porovnaní s týmito pCDNA3.1 prázdneho vektora transfektanty (obrázok 2B). Tiež sme vyhodnotili distribúcie bunkovej apoptózy v pCDNA3.1-ZIC1 alebo pCDNA3.1 vektorové transfektanty v AGS a MKN28 bunky, ale žiadne zjavné rozdiely v bunkovej apoptózy boli pozorované (dodatočný súbor 2: Obrázok S2). Preto tieto výsledky potvrdzujú, že nadmerná expresia ZIC1 mení distribúcie bunkového cyklu prostredníctvom regulácie kinázy závislé na cyklin p21, p27, rovnako ako cyklin D1 v nádorových bunkách žalúdka. Obrázok 2 ZIC1 mení distribúcie bunkového cyklu reguláciou p21, p27 a cyklín D1 v nádorových bunkách žalúdka. (A) distribúcia bunkového cyklu boli detekované analýzu prietokovou cytometriou v AGS a SGC7901 buniek po prechodnej transfekciu s pCDNA3.1-ZIC1 alebo prázdnym vektorom pCDNA3.1 po dobu 24 hodín. (B) Hladiny expresie p21, p27 a cyklin D1 boli stanovené pomocou Western Blot. β-aktínu bol prítomný ako kontrola nanášania. Hodnoty denzitometria sú vyjadrené ako násobok zmeny v porovnaní s hodnotami pCDNA3.1 vektorové riadenie normalizované na 1. (c) úrovne expresie phospholated Akt a ERK1 /2, ako aj celkový Akt a ERK1 /2 sa skúmalo pomocou Western Blot.
MAPK a PI 3K dráhy hrajú zásadnú úlohu v regulácii bunkového cyklu kináz. Hodnotili sme expresiu hlavných následných efektorov týchto dvoch ciest, ERK1 /2 a AKT, po zavedení stabilne pcDNA3.1-ZIC1 k AGS, MKN28, BGC823 a SGC7901 buniek karcinómu žalúdka (obrázok 1A). Zistili sme, že hladiny fosforylácie ERK1 /2 a Akt boli výrazne potlačená nadmernou expresiou ZIC1 vo všetkých testovaných vyššie bunkových líniách (Obr 2c). Tieto výsledky naznačujú, že regulácia distribúcie buniek cylce podľa ZIC1 možné postúpiť PI 3K a MAPK a ich následný kinázy závislé na cyklin p21, p27 a cyklín D1 pri karcinóme žalúdka.
ZIC1 potláča expresiu sonic hedgehog (Pst) v nádorových bunkách žalúdku
Molekulárna charakterizácia ukázala, že ZIC1
má zinok-prstové domény a môže pôsobiť proti s GLI1 väzbou na GC-bohaté sekvencie [2]. GLI1 je downstream cieľom ježko (hh) signálne dráhy, ktorá je nevyhnutná k rozvoju rakoviny žalúdka a progresie [9, 27]. Predpokladali sme, že Hh signálnej dráhy môže byť zapojený do regulácie ZIC1 žalúdočnej rakoviny bunkového cyklu a bunkové migrácie. Pre riešenie tohto problému sme skúmali expresiu Sonic hedgehog (SHH), čo je kľúčový člen Hh rodiny, v rakovinových bunkách žalúdku po nadmernej expresii ZIC1. Zistili sme, že re-expresia ZIC1 účinne znižuje Psst expresiu v BGC823 a SGC7901 bunkových línií analýzou Western blot (obrázok 3A). Okrem toho, analýza RT-PCR preukázané, že úroveň prepis SHH je tiež významne downregulated do buniek karcinómu žalúdka transfekciou ZIC1 vzhľadom k prázdnych vektorovej transfektanty (p 0,01) (Obrázok 3B) (Ďalší súbor 3: Obrázok S3). , Dohromady, naše výsledky naznačujú, že môžu ZIC1 transkripčný regulovať expresiu SHH do buniek karcinómu žalúdka. Obrázok 3 ZIC1 inhibuje expresiu Sonic hedgehog (SHH). (A) Expresia Psst proteínu bola analyzovaná pomocou Western Blot v BGC823 a SGC7901 bunky stabilne transfekované pCDNA3.1-ZIC1 alebo prázdnym vektorom pCDNA3.1. (B) Úroveň expresie Psst mRNA bola stanovená v reálnom čase kvantitatívnej analýzy RT-PCR. Relatívna úroveň expresie bol vyjadrený ako násobok zmeny (priemer ± SEM) v porovnaní s pCDNA3.1 prázdnym vektorom normalizovanú na hodnotu 1.
Hedgehog (Hh) signálne dráhy sa podieľa na regulácii ZIC1 bunkového cyklu a bunkové migrácie v karcinómu žalúdka bunky
pre stanovenie účinku SHH na rozdelenie bunkového cyklu, sme sa snažili preskúmať účinky inhibítora farmakologické JS signalizácie na expresiu p21 a cyklín D1. AGS, BGC823 a SGC7901 žalúdočné rakovina bunkové línie boli ošetrené cyklopaminu (10 uM), steroidné alkaloid, ktorý spolupracuje priamo s Smo inhibovať Hh signalizácia [28], alebo riadenie DMSO po dobu 24 hodín. Pozorovali sme, že hladina expresie p21 bol výrazne up-regulovaná, zatiaľ čo cyklin D1 down-regulované po nádorové bunky boli ošetrené s cyklopaminovým (obrázok 4A). Za zmienku stojí, že blokuje signálnu dráhu Psst podávaním cyklopaminu nemá vplyv na hladiny expresie mRNA v ZIC1 BGC823 a SGC7901 buniek RT-PCR (obrázok 4B). Neprítomný alebo nízka expresie mRNA v ZIC1 buniek karcinómu žalúdka bol Meditoval najmä promotorové metylácie DNA, tak ako bolo opísané skôr [8]. Obrázok 4 Hh signálnej dráhy sa podieľa na expresiu p21, cyklin D1 a reguláciu migrácie buniek. AGS, BGC823 a SGC7901 buniek karcinómu žalúdka boli ošetrené cyklopaminu (10 uM), steroidné alkaloid, ktorý spolupracuje priamo s Smo inhibovať Hh signalizácia, alebo riadenie DMSO po dobu 24 hodín. (A) expresné hladiny p21 a cyklin D1 boli stanovené westernovým prenosom v AGS, BGC823 a SGC7901 buniek. (B) hladina expresie mRNA ZIC1 bola skúmaná pomocou konvenčné RT-PCR. (C) Migrácia buniek bola hodnotená upravený Boyden Transwellovy komory testy. Bunky, ktoré migrovali do spodnej časti membrány boli zafarbené DAPI. (D) Priemerný počet viditeľných buniek sťahovavé (priemer ± S.D) bola vypočítaná v piatich náhodne vysoko energetických polí (× 400). Hviezdička označuje štatistickú významnosť (*** p 0,001).
Tiež vyhodnotené účinky SHH signalizácie na žalúdočné migráciu nádorových buniek. Ako je znázornené na obrázku 4, C a D, AGS, a BGC823 SGC7901 bunkové línie karcinómu žalúdka ukázala významný pokles bunkovej migrácie po podaní s cyklopaminu (10 uM) po dobu 24 hodín (p 0,01). Súhrnne tieto výsledky ukazujú, že môže modulovať zícii regulátory bunkového cyklu a migráciu buniek prostredníctvom Psst signalizácia v nádorových bunkách žalúdka.
Profilu génovej expresie zmení o ektopickej expresie ZIC1
Systematicky stanovenie downstream cieľa ZIC1, sme vykonali affymatrix oligonukleotid mikročipov v MKN28 žalúdočných rakovinových bunkách s alebo bez pCDNA3.1-ZIC1. Za použitie cut-off > 1,5 krát pre štatistickej významnosti, mikromaticový sa zistilo, že 132 gény sú down-regulované, zatiaľ čo 66 gény sú up-regulované exogénny expresie ZIC1 (reprezentatívnych génov je znázornené na obrázku 5A). Mnoho génov boli popísané hrať rozhodujúcu úlohu v proliferácii buniek, bunkového cyklu a bunkové migrácie v súlade s génovou funkčnú analýzu (http: .. //Www genecards org) (obrázok 5B). Napríklad, dve kľúčové regulátory bunkového cyklu TP53INPI stroje a CDKN2B
ako bolo zistené, deregulované v MKN28 bunkách tranfected s pCDNA3.1-ZIC1. Naše výsledky naznačujú, že potenciálne ZIC1 reguluje viac následných gény zapojené do žalúdka vzniku nádorov. Obrázok 5 Génové zmeny expresie profilu po ektopickej expresie ZIC1. (A) profilov génovej expresie v pCDNA3.1-ZIC1 alebo prázdnych pCDNA3.1 vektorové Stabilné transfektanty boli analyzované pomocou cDNA mikročipu v MKN28 bunkách. Reprezentatívny gény sú znázornené na pravej strane obrázku teplotný mapa pomocou cut-off > 1,5 alebo < -1,5 Zložiť ako významný rozdiel,. (B) génov zapojených do bunkového cyklu, množenia buniek a migrácia buniek podľa génu funkčnú analýzu (http: .. //Www genecards org), sú prezentované. Relatívna zmena fold je vyjadrená pomerom pCDNA3.1-ZIC1 porovnaní s kontrolou pCDNA3.1. (C) systémové pochopenie dráh pre ZIC1 reguláciu signalizácie a cieľových génov v rozvoji a progresii rakoviny žalúdka.
Diskusia
čoraz viac dôkazov ukázala, že ZIC1 sa podieľa na progresiu niektorých nádorov [3-8] , Zdá sa, že je ZIC1 aberantne vyjadruje v niektorých typov rakoviny a diferencovane funguje ako nádorový supresor alebo onkogénne génu. Napríklad, ZIC1 expresia bola hlásené nízke alebo chýba v gastrointestinálne a karcinómu pľúc bunkových línií, a zistilo sa, že potlačenie gastrointestinálnych proliferácie [7, 8, 29] rakovinových buniek. Naproti tomu bolo zistené, že zvýšená expresia ZIC1 v liposarkómom podporovať proliferáciu buniek a inváziu [3]. My a iní ukázali, že epigenetické modulácia vrátane metyláciou DNA a histónov remodelácie a genetických mutácií môže prispieť k jeho diferenciálnej expresie vzory u rakovín [3, 4, 7, 8]. Je jasné, že ako transkripčný faktor zinkové prsty, ZIC1 môže modulovať viac následných génov v nervovom tkanive, kolorektálnym karcinómom a liposarkómom bunkách [2, 3, 7, 9]. Avšak, len málo je známe o mechanizme základné ZIC1 funkcie v rozvoji a progresii rakoviny žalúdka. Podčiarkuje kľúčové dráh a ďalej ciele upravené ZIC1 môže uľahčiť pochopenie jeho úloha vo vzniku nádorov. Tu sme preukázali, že nadmerná expresia ZIC1 za následok významné inhibíciu bunkového prežitia a zníženie hodnoty migrácie buniek. ZIC1 potláča SHH, PI3K a MAPK signálnych dráh, ktoré sú kritické pre reguláciu distribúcie bunkového cyklu a migráciu buniek u rakoviny žalúdka. Okrem toho ZIC1 inhibuje bunkového cyklu regulačnej kinázy, p21, p27 a cyklin D1, čo vedie k G1 S tranzit /bunkového cyklu v rakovinových bunkách žalúdka. ZIC1 potláča signálne dráhu SHH, ktorý je rozhodujúci pre reguláciu distribúcie bunkového cyklu a migráciu buniek u rakoviny žalúdka.
MAPK a PI 3K dráhy hrajú kľúčovú úlohu v bunkovej proliferácii, diferenciácii a progresiu v rade ľudskej rakoviny [30]. V poslednej dobe bolo tiež oznámené, že aktivácia oboch dráh sú nevyhnutné pre indukciu vstup bunkového cyklu [30, 31]. V priebehu tohto procesu, cyklin závislých inhibítorov kinázy p21, p27 a cyklin D /E sa zúčastňuje na regulácii p53 indukované zastavenie bunkového cyklu [24, 32]. Aktivácia MAPK a jeho následnému kinázy-Erk by mohlo viesť nielen k indukcii cyklin D1 a prejsť G1 /S kontrolného bodu, ale aj akumulácie p21, ktorý inhibuje cyklin E /CDK2 komplexy pre blokovanie vstupu S-fáza [30] , PI 3K /Akt dráhy by mohli inaktivovať GSK-3-beta a FOXO transkripčné faktory, a tak inhibujú cyklin D1 pri indukcii p27 a p21 v regulácii vstupu bunkového cyklu [31]. Ukázali sme, že re-expresia ZIC1 účinne inaktivujú fosforylovaného Akt a ERK1 /2 v AGS, MKN28, BGC823 a SGC7901 žalúdočných nádorových bunkových línií. V tomto ohľade je p21 inhibítor CDK1 bol aktivovaný, zatiaľ čo cyklin D1 inaktivuje, potom, čo nadmernú expresiu v ZIC1 buniek karcinómu žalúdka. Hoci výsledky budú musieť byť overené v ďalších štúdiách, naša miroarray údaje ukázali, že ďalšie kľúčové komponenty bunkového cyklu regulátorov kinázy vrátane TP53INPI stroje a CDKN2B
sú deregulované s núteným výrazom ZIC1 v individuálnom MKN28 žalúdku nádorové bunky línia (Obrázok 5 a a B). Preto navrhujeme, aby ZIC1 reguluje G1 /S tranzit predovšetkým prostredníctvom PI 3K a MAPK a následní bunkového cyklu regulátora kinázy v nádorových bunkách žalúdka.
Ďalším významným nález v našej súčasnej štúdii sa, že ZIC1 transkripčný reguluje Sonic ježko (Pst) signalizácia v nádorových bunkách žalúdka. Odhliadnuc od ústrednú úlohu v regulácii žalúdočnej morfogenéze žľazy v ľudskom žalúdku, Pst signalizácia sa tiež podieľa na patogenéze rakoviny žalúdka [16, 33]. Pst je často aktivovaný v pokročilých žalúdočnej adenokarcinómov a spojená s agresívnym správaním nádoru [13, 15, 33]. Predchádzajúce štúdie ukázali, že Pst signalizácia podporuje motilitu a invazivitu buniek karcinómu žalúdka prostredníctvom TGF-p-ALK5-Smad3 dráhy [34]. Pst signalizácia by tiež regulujú expresiu p21 a cyklín D1 v Gli-dependentný dráhy [16, 25]. Pozorovali sme, že inhibícia signalizácie Psst podávaním s cyklopaminu potláča AGS, BGC823 a SGC7901 žalúdočné migráciu nádorových buniek, a reguluje expresiu p21 a cyklín D1 (obrázok 4). Tieto výsledky sú v súlade s predtým publikovaných štúdií [25, 34]. Preto sme ukázali, že ZIC1 hrá dôležitú úlohu v progresii rakoviny žalúdka u regulácia Psst signálnej dráhy.
ZIC1 môžu regulovať cieľových génov v oboch sekvenčne špecifické a nezávislé správanie [9]. ZIC1 mohol regulovať transkripčný expresiu cieľov vrátane cyklin D1, p27, Wnt1 a Wnt7a a moduláciu Notch a BMP dráhy v nervovom rozvoja [2, 9]. ZIC1 mohli pôsobiť proti GLI väzbou na GC-bohaté sekvencie, a potláčajú expresiu sekvencie smeruje reportéri gény Gli-väzby [9, 35]. Identifikovali sme niekoľko Zic potenciál cieľových génov v nádorových bunkách žalúdku analýzou mikročipov. Tieto ciele sú úzko spojené s bunkového cyklu, proliferácia a migrácia buniek (obrázok 5B). Súvislosť medzi ZIC a nadväzujúcich cieľov môže byť kľúčom pre pochopenie potenciálnych perspektívu Zic proteínov v progresii rakoviny žalúdka.
Závery
sumárne, navrhujeme model, ktorý predstavuje cesty, ktorými ZIC1 prispieva k rakovine žalúdka progresie (obrázok 5C). Nadmerná expresia výsledkov ZIC1 v potláčaní Ježek (hh) signalizácia a jej následných cieľov vrátane p21, p27 a cyklín D1. Ako zinkový prst transkripčný faktor, ZIC1 tiež potenciálne moduluje transkripčné expresiu cieľových génov priamo väzbou na GC-bohaté sekvencie [2], čím funguje ako nádorový supresor inhibíciou bunkovej proliferácie, bunkovej migrácie a invázie u karcinómu žalúdka.
Metódy
Bunková kultúra a spracovanie
rakovina žalúdka u bunkových línií (AGS, MKN28, BGC823 a SGC7901) boli získané z Riken génovej banky (Japonsko) a American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA ). Všetky bunkové línie boli kultivované v médiu RPMI 1640 (Invitrogen, CA, USA) doplneného sérom 10% fetálne bovinné (FBS) a inkubované pri 5% CO 2, 37 ° C a 95% vlhkosti. Žalúdočné rakovina bunkové línie (AGS, BGC823 a SGC7901) boli liečení 10 uM cyklopaminu (Sigma, St. Louis, MO, USA) v DMSO po dobu 24 hodín. Ekvivalentné koncentrácie nosiča (DMSO), bol použitý ako kontrola.
Prenos buniek
AGS, MKN28, BGC823 a SGC7901 bunky boli kultivované počas 24 hodín v 6-jamkové doštičky a transfekovány pCDNA 3.1-ZIC1 alebo pCDNA 3.1 prázdnym vektorom s použitím Fügen HD (Roche) podľa inštrukcií výrobcu. Po 48 hodinách sa transfektanty boli kontinuálne vybrané v médiu RPMI 1640 s obsahom G418 (200-400 ug /ml) (Merck, Nemecko) počas 14 dní.
RT-PCR a kvantitatívnej PCR v reálnom čase analýzy
celkovej RNA ( 1 ug) sa extrahuje za použitia TRIzolu činidla (Invitrogen) podľa inštrukcií výrobcu a reverznej transkripcii do cDNA s M-MLV RTAS cDNA Synthesis Kit (Takara, Japonsko). Hladiny Prepis ZIC1 a SHH boli stanovené bežným RT-PCR s Takara Taq polymerázy (Takara, Japonsko) alebo kvantitatívne PCR v reálnom čase (QRT-PCR) s SYBR Green Master Mix Kit (Takara, Japonsko) v ABI 7500 PCR systém. Primery použité pre ZIC1 boli F: 5'-AAACTGGTTAACCACATCCGC a R: 5'-CTCAAACTCGCACTTGAAGG. Psst boli F: 5'-GTAAGGACAAGTTGAACGCTTTG a R: 5'-GATATGTGCCTTGGACTCGTAGTA. Glyceraldehyd-3-; phosohate dehydrogenázy (GAPDH) bola použitá ako vnútorná kontrola. Hladiny transkriptov sú vyjadrené ako 2 -ΔΔCt hodnoty a relatívna zmena expresie fold je normalizovaný GAPDH.
Životaschopnosť buniek testu
Životaschopnosť buniek bola detekovaná pomocou nerádioaktívnych testu proliferácie buniek s 3- (4,5- dimetyl-thiazol-2-yl) -5- (3-karboxymethoxyfenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium (MTS) činidiel (Promega, Madison, USA). Stabilné transfekované bunky boli nanesené na 96-jamkové (2000 buniek /jamku) po dobu 6 h, 24 h, 72 h a 120 h. Absorbancia bola meraná pri 490 nm po 1 h inkubácie s CellTiter 96 Aqueous One Solution činidlá. Boli zistené
bunkového cyklu a apoptózu buniek analýza
distribúcie bunkového cyklu pomocou prietokovej cytometrie analýzy. Bunky transfekované pCDNA3.1-ZIC1 alebo prázdnym vektorom pCDNA3.1 zozbieraného a premyté PBS. Bunková DNA bola farbená bunkového cyklu Farbiace roztok obsahujúci propidium jodidom (PI) pri teplote 4 ° C v tme. Bunkového cyklu bola stanovená za použitia FACS Calibur a analyzované pomocou softvéru ModFitLT (Phoenix, USA).
Apoptózu buniek bola vykonávaná s použitím FITC annexinu V apoptózy Detection Kit II (BD Pharmingen) pomocou prietokovej cytometrie. Prechodne transfekované bunky boli suspendované v annexinu V pufri Binding Buffer. Potom sa pridá FITC annexin V a PI riešenia v poradí. Po inkubácii po dobu 15 min, sa zafarbené bunky boli analyzované pomocou prietokovej cytometrie FACScan prietokovom (Becton Dickinson, USA).
Migrácia a invázia testoch bunkovej migrácie
buniek bola stanovená modifikovanou Boyden Transwellovy komory testu (odoberanie jadier, USA). V stručnosti, bunky boli kultivované v médiu bez séra počas 24 hodín a 5 x 10 4 bunky boli umiestnené do hornej komory v 300 ul média obsahujúceho 5% FBS. Po 16 hodinách inkubácie, non-sťahovavé bunky v hornej komore boli starostlivo odstránené vatovým tampónom. Migrovali Bunky boli zafarbené farbením DAPI roztoku. Počty buniek boli náhodne počítajú v piatich polí (400 × zväčšenie).
Invázia buniek bola vykonávaná v pórov 24 jamiek potiahnuté BD Matrigel. Po hladovanie v médiu bez séra po dobu 24 hodín, 1 x 10 5 boli bunky umiestnené do hornej komory v 300 ul média obsahujúceho 5% FBS, zatiaľ čo spodná komora bola naplnená 600 ul kultivačného média s 15% FBS. Potom, čo bola inkubovaná po dobu 30 hodín, boli membrány inkubované s Cell Stain Solution (Millorpore, USA). Zmes farbív sa premyje extrakčného pufra a prenesené na 96-jamkové pre kolorimetrické meranie pri 560 nm.
Pomocou analýzy Westernového prenosu
Celkové proteíny boli extrahované z buniek za použitia radio-Imunoprecipitácia test lyzačného pufra doplneného inhibítorom proteázy. Lyzáty boli rozdelené na 6-12% SDS-PAGE a prenesené na minigels PVDF membrány (Millipore, Bedford, MA). Membrány boli blokované v 5% mlieku s TBST a inkubujú sa pri teplote 4 ° C cez noc s nasledujúcimi protilátkami: ZIC1 (1: 500; abca), fosfo-Akt (1: 1000, Cell Signaling), Akt (1: 500; abca), fosfo-Erk1 /2 (1: 1000, Cell Signaling), Erk1 /2 (1: 1000, Cell Signaling), p21 Waf1 /Cip1 (1: 1000, Cell Signaling), p27 Kip1 (1: 500, Epitomics), cyklin D1 (1: 1000, Cell Signaling) a Pst (1: 1000, Cell Signaling). V súlade s tým, sekundárne protilátky naviazané na chrenovou peroxidise (HRP) boli vizualizované pomocou chemiluminiscencie s Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Japonsko). Relatívna hustota proteíny boli kvantifikované pomocou obrazu J. softvérom a normalizované na beta-aktínu. (1: 2500, Multisciences Biotech)
cDNA microarray, analýzy
Celková RNA bola izolovaná z MKN28 buniek, ktoré stabilne transfekované pCDNA3.1 -ZIC1 alebo prázdnym vektorom pCDNA3.1, a bola reverzne transkribovaných na cDNA. Označené vzorky boli hybridizovány s Agilent celý ľudský genóm obsahuje viac ako 41.000 sond (http: .....? //Www NCBI NLM NIH gov /GEO /dotaz /ACC cgi acc = GSE38924). Dáta boli analyzované pomocou microarray Agilent Feature Extraction softvér. Vybrali sme si násobnú zmenu ≥ 1,5 alebo ≤ -1,5 ako významný rozdiel bol vykonaný.
Štatistická analýza
Studentov testu
porovnať dva nezávislé údaje, zatiaľ čo Chi-kvadrát alebo Fisherov presný test bol použitý na analyzovať kategorické premenné. Vypínacie P < 0,05 bola použitá pre štatistickej významnosti.
Notes
Jing Zhong, Shujie Chen prispeli rovnakou mierou k tejto práci.
Vyhlásenie
Potvrdenie
Projekt bol podporený Národnej prírodnej Science Foundation Číny (30900676, 81071961), Národné Základný výskumný program Číny (973 programov) (2012CB945004) a Science and Technology kľúč projekt provincie Zhejiang v Číne (2009 C03012-3). Autori ďakujú Prof. Tianhua Zhou a prof Lei Guo za užitočné návrhy a diskusie; . A Thomas R. Austin oponentský a editáciu rukopisu
Electronic doplnkový materiál
12885_2011_3201_MOESM1_ESM.tiff Ďalší súbor 1: Obrázok S1.
  • žalúdok článok
    •   
  • žalúdočné štruktúra
    •   
  • Starostlivosť o žalúdka
    •   
  • výskumy

    • výskumy

    výskumy

    Other Languages

    žalúdok zdravie © https://www.stomachillness.com/sk