ZIC1 moduleert celcyclus uitkeringen en celmigratie door regulatie van sonic hedgehog, PI
3K en MAPK signaalwegen in maagkanker
Abstracte achtergrond
ZIC1, een essentiële transcriptiefactor met zinkvingerdomeinen, heeft betrokken bij het proces van neurale ontwikkeling. We toonden eerder aan dat ZIC1 kan functioneren als een tumor suppressor in maagdarmkanker. Echter, het moleculaire mechanisme onderliggende deelname ZIC1 in tumorprogressie
blijft onbekend. Methoden
De rol van ZIC1 op de proliferatie en migratie cel werd onderzocht. De regulering van sonic hedgehog (Shh), fosfoinositide 3-kinase (PI 3K) en mitogen-geactiveerd proteïne kinase (MAPK) signaalwegen na ectopische expressie van ZIC1 bij maagkanker cellen werden geëvalueerd.
Resultaten
overexpressie van ZIC1 bij aan de remming van proliferatie celmigratie celcyclus verdeling maagkanker. De modulatie van de G1 /S checkpoint door ZIC1 wordt voornamelijk gemedieerd door de regulering van de cycline-afhankelijke kinases (p21 waf1 /Cip1, p27 Kip1 en cycline D1). Bovendien kan het niveau van ZIC1 phospholated Akt en Erk1 /2 inactiveren en transcriptioneel reguleren sonic hedgehog (Shh) signalering, hetgeen leidt tot de expressie van p21 waf1 /Cip1 en cycline D1 regelen. Ten slotte hebben wij systemisch geïdentificeerd ZIC1 downstream targets door cDNA microarray-analyse en bleek dat 132 genen worden down-gereguleerd en 66 genen worden up-gereguleerd na transfectie met ZIC1 bij maagkanker cellen. Deze kandidaat-genen
cruciale rol spelen in cel proliferatie, celcyclus en celmotiliteit. Conclusies
Overexpressie van ZIC1 resulteert in inactivatie van Shh, PI 3K en MAPK signaalroutes, evenals de regulering van meerdere downstream targets die essentieel zijn voor de ontwikkeling en progressie van maagkanker is. ZIC1 dient als een potentieel therapeutisch doel voor maagkanker.
Sleutelwoorden
ZIC1 Sonic hedgehog Celcyclus tumor suppressor Achtergrond
ZIC1, een van de vijf ZIC familie genen, is betrokken bij een groot aantal ontwikkelingsprocessen, met inbegrip van neurogenese en myogenesis [1, 2]. Onlangs is ZIC1 gedocumenteerd te nemen aan de progressie van humane tumoren waaronder medulloblastoom, endometriale kanker, mesenchymale neoplasmen en liposarcoma kanker [3-6]. We hebben eerder aangetoond dat ZIC1 gen aanzienlijk maagkanker weefsels en cellijnen wordt neerwaarts gereguleerd in vergelijking met het normale gastrische weefsels. Bovendien ZIC1 dient eventueel een tumor suppressor door remming van celproliferatie in maag- en colorectale kankercellen [7, 8]. Als belangrijke transcriptiefactor ZIC1 essentieel is voor de regulatie van signalering Hedgehog (Hh), Bone morfogenetisch eiwit (BMP) en Notch signaalwegen in neurale ontwikkeling [2, 9]. Er is echter weinig bekend over hoe ZIC1 regelt signaal paden en de bijbehorende downstream targets in de progressie van kanker.
Maagkanker is de tweede belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [10, 11]. Hh signalering is een van de belangrijkste oncogene signaalwegen betrokken bij maagkanker [12, 13]. Sonic hedgehog (Shh), een lid van de zoogdier Hh familie [14], is aangetoond zowel opgereguleerd bij maagkanker weefsels door in situ hybridisatie assay en essentieel voor de progressie van maagkanker [13, 15]. Hh-signaleringsroute wordt geactiveerd door Shh binding met het Patched (Ptch) - Smoothened (Smo) membraan-receptorcomplex [16]. De activering van Shh bevordert maagkanker celdifferentiatie en proliferatie. Er werd gemeld dat expressie van de ZIC1 PTCH1 Kopen en Shh
genen in neuraal weefsel tijdens voorhersenen ontwikkeling [17] kan worden verminderd. Daarentegen heeft aangetoond aangetoond dat Shh de expressie onderdrukt van ZIC1 tijdens neurale buis ontwikkeling [18]. Toch is de invloed van ZIC1 op Hh signaleringsroute bij maagkanker blijft onbekend.
ZIC1 regelt ook talrijke doelen met inbegrip van cycline D1, p27, Wnt1 en Wnt7a tijdens neurale ontwikkeling in Xenopus ectodermale explantaten en mutante muismodellen [9, 19, 20]. We zijn vooral geïnteresseerd in celcyclus regulatoren belangrijk voor de proliferatie en differentiatie van kankercellen. We hebben eerder aangetoond dat overexpressie van ZIC1 kan G1 /S transitie in maagkanker cellen veranderen [8]. Verschillende mechanismen van cycline afhankelijke kinasen (CDK's) zijn betrokken bij de regulatie van de G1 /S controlepunt in humane kanker [21]. Tijdens de overgang van G1 naar S-fase cycline D die actieve complexen van CDK4 vormt is opgereguleerd in maagkanker [22, 23]. Verlies van cycline afhankelijke kinase-remmers, zoals p21 waf1 /Cip1 en p27 Kip 1 bevorderen CDK2 activiteit en reguleren van de G1 /S overgang [12, 24]. Recente studies hebben aangetoond dat mutant ZIC1 of kracht overexpressie van ZIC1 de expressie van p27 Kip 1 bij muizen cerebellaire weefsels en cellen liposarcoma [3, 20]. Interessant is dat de Shh signaleringsroute negatief reguleert p21 waf1 /Cip1 en cycline D1 in een GLI1-afhankelijke manier [16, 25]. Echter, of ZIC1 kan samenspel met Shh traject in de regulatie van de celcyclus distributies is niet gedefinieerd. Opheldering van deze signalering netwerk kan nader inzicht in de rol van ZIC1 bij maagkanker bieden.
In onze studie tonen we aan dat overexpressie van ZIC1 onderdrukt maagkanker celmigratie en invasie, en wijzigt de celcyclus distributies. ZIC1 kan transcriptioneel downregulate de Shh signalering en onderdrukken het niveau van phospholated Akt en Erk, dus leidt tot de regulering van de celcyclus regulator kinases p21 waf1 /Cip1, p27 Kip1 en cycline D1 bij maagkanker cellen. Bovendien blijken meerdere belangrijke ZIC1 benedenstroomse targets bij maagkanker cellen door cDNA microarray analyse.
Resultaten
ZIC1 de proliferatie, migratie en invasie van maagkanker cellen Belgique Om het effect van ZIC1 op celproliferatie te bepalen, voerden wij levensvatbaarheid van de cellen analyse door MTS assays bij maagkanker cellen. Maagkanker cellijnen (AGS, MKN28, BGC823 en SGC7901) werden met pCDNA3.1-ZIC1 of pCDNA3.1 lege vector. De transfectie-efficiëntie werd bevestigd door respectievelijk RT-PCR en Western blot (Figuur 1A). De resultaten toonden dat het aantal levensvatbare cellen werd significant onderdrukt door ectopische expressie van ZIC1 in een 5-daagse observatie BGC823 cellen (Figuur 1B). De onderdrukking van celproliferatie door ZIC1 was consistent met onze eerdere waarnemingen in AGS en MKN28 maagkanker cellen, evenals darmkankercellen [7, 8]. Figuur 1 ZIC1 onderdrukt celproliferatie en migratie bij maagkanker. (A) Maagkanker cellijnen (AGS, MKN28, BGC823 en SGC7901) werden stabiel getransfecteerd met pCDNA3.1-ZIC1 of pCDNA3.1 lege vector. De expressieniveaus van ZIC1 mRNA en eiwit werden uitgevoerd door RT-PCR (bovenste diagram) en Western blot (laag diagram). GAPDH en β-actine werden gebruikt als interne controles. (B) De cellevensvatbaarheid maagkanker cellijn (BGC823) werd bepaald door MTS celproliferatie assay. Het sterretje geeft aan statistische significantie (** p < 0. 01). (C) Celmigratie werd beoordeeld door gemodificeerde Boyden Transwell kamers testen na incubatie gedurende 16 uur. Cellen die migreerden naar de onderkant van het membraan werden gekleurd met DAPI. (D) Het aantal zichtbare migrerende cellen (gemiddelde ± S.D.) werd geschat door het tellen van vijf willekeurige high power velden (400 × vergroting). Deze experimenten werden uitgevoerd in drievoud. De representatieve gegevens worden getoond. De asterisk geeft statistische significantie (*** p < 0,001).
Bovendien hebben we de rol van ZIC1 bij celmigratie invasie bij maagkanker. Celmigratie en invasie assays werden uitgevoerd in transwell migratie en Matrigel beklede invasie assay systemen, respectievelijk. We zagen dat re-expressie van ZIC1 aanzienlijk onderdrukte cel migratie in AGS, BGC823 en SGC7901 maagkanker cellijnen (p < 0,001) (figuur 1C, D). Bovendien, re-expressie van ZIC1 vertoonden een significant lagere activiteit van cellulaire invasie in vergelijking met de lege vector transfectanten in AGS cellen (p < 0,05) (aanvullende bestandsinformatie 1: Figuur S1). Deze gegevens suggereren dat ectopische expressie van ZIC1 onderdrukt maagkanker celmigratie en invasie.
ZIC1 verandert celcyclus verdeling en de expressie van cycline-afhankelijke kinasen bij maagkanker cellen Belgique Om verder inzicht in de mechanismen verantwoordelijk voor de remming van celproliferatie door overexpressie van ZIC1 evalueerden we celcyclus verdeling bij maagkanker cellen. Wij namen een hoger percentage cellen in G1 fase AGS (42,74%) en SGC7901 (54,03%) cellijnen na overexpressie van ZIC1. Echter, in de cellen getransfecteerd met een controlevector werd het aandeel dalen, zowel AGS (32,66%) en SGC7901 (47,00%) en het percentage cellen in S fase werd relatief verhoogd (Figuur 2A). Het is algemeen aanvaard dat p21 (ook bekend als p21 waf1 /Cip1) en p27 (ook bekend als p27 Kip1), twee cycline-afhankelijke kinase inhibitors, zijn vereist voor het stoppen tijdens de toegang tot de S-fase [26]. De activering van cycline D1 is echter voornamelijk verantwoordelijk voor het reguleren van de G1-S-fase transitie [23]. We hebben aangetoond dat het expressieniveau van cycline D1 eiwit verlaagd terwijl p21 en p27 aanzienlijk werden geïnduceerd bij maagkanker cellen getransfecteerd met pCDNA3.1-ZIC1 op vergeleken met lege vector pCDNA3.1 transfectanten (figuur 2B). We evalueerden ook de cel apoptose distributies in pCDNA3.1-ZIC1 of pCDNA3.1 vector transfectanten in AGS en MKN28 cellen, maar geen duidelijke verschillen in de cel apoptose werden waargenomen (Extra file 2: Figuur S2). Derhalve ondersteunen deze resultaten dat overexpressie van ZIC1 verandert de celcyclus verdeling door regulatie van cycline-afhankelijke kinasen p21, p27 en cycline D1 bij maagkanker cellen. Figuur 2 ZIC1 verandert de celcyclus uitkeringen door regulering van p21, p27 en cycline D1 bij maagkanker cellen. (A) celcyclus verdeling werden gedetecteerd door stromingscytometrie analyse AGS en SGC7901 cellen na transiënte transfectie met pCDNA3.1-ZIC1 of lege vector pCDNA3.1 voor 24 uur. (B) De expressieniveaus van p21, p27 en cycline D1 werden bepaald door Western blot. β-actine werd gedetecteerd als een beladingscontrole. Densitometrie waarden worden uitgedrukt als fold change opzichte vector pCDNA3.1 regelwaarden genormaliseerd tot 1 (C) De expressieniveaus van phospholated Akt en Erk1 /2, en totale Akt en Erk1 /2 werden onderzocht met Western blot.
MAPK en PI 3K trajecten spelen een belangrijke rol in de regulering van de celcyclus kinasen. We evalueerden de expressie van de belangrijkste downstream effectoren van deze twee wegen, Erk1 /2 en Akt, na de invoering van stabiel pCDNA3.1-ZIC1 aan AGS, MKN28, BGC823 en SGC7901 maagkanker cellen (Figuur 1A). We vonden dat de niveaus van fosforylatie Erk1 /2 en Akt dramatisch onderdrukt door overexpressie van ZIC1 in alle hierboven geteste cellijnen (Figuur 2C). Deze resultaten suggereren dat de regulering van cel-cylce distributie door ZIC1 kunnen worden bemiddeld door PI 3K en MAPK paden en hun downstream cycline-afhankelijke kinases p21, p27 en cycline D1 bij maagkanker.
ZIC1 onderdrukt de uitdrukking van Sonic hedgehog (Shh) bij maagkanker cellen
Moleculaire karakterisering heeft aangetoond dat ZIC1
heeft zinkvinger-domeinen en GLI1 kan tegengaan door binding aan GC-rijke sequenties [2]. GLI1 is een stroomafwaarts doelwit van hedgehog (hh) signaalweg die essentieel is voor maag- kankerontwikkeling en progressie [9, 27]. Onze hypothese was dat Hh signaleringsroute betrokken kan zijn bij de regulatie van ZIC1 maagkanker celcyclus en celmigratie. Om dit probleem aan te pakken, onderzochten we de expressie van Sonic hedgehog (Shh), een belangrijk lid van Hh familie, bij maagkanker cellen na overexpressie van ZIC1. We vonden dat re-expressie van ZIC1 vermindert effectief Shh expressie in BGC823 en SGC7901 cellijnen door western blot analyse (figuur 3A). Daarnaast is de RT-PCR analyse toonde aan dat het transcriptieniveau van Shh wordt ook significant neerwaarts gereguleerd in maagkanker cellen getransfecteerd met ZIC1 opzichte lege vector transfectanten (p < 0,01) (Figuur 3B) (aanvullende bestandsinformatie 3: Figuur S3). . Samengenomen suggereren onze resultaten dat ZIC1 transcriptioneel kan de expressie van Shh bij maagkanker cellen. Figuur 3 ZIC1 remt de expressie van Sonic hedgehog (Shh). (A) De expressie van Shh eiwit werd geanalyseerd door Western blot en BGC823 SGC7901 cellen stabiel getransfecteerd met pCDNA3.1-ZIC1 of lege vector pCDNA3.1. (B) Het expressieniveau van mRNA Shh werd bepaald door real-time kwantitatieve RT-PCR analyse. De relatieve expressieniveau werd uitgedrukt als voudige verandering (gemiddelde ± SEM) in vergelijking met lege vector pCDNA3.1 genormaliseerd tot 1.
Hedgehog (Hh) signaleringsroute is betrokken bij de regulatie van ZIC1 celcyclus en celmigratie bij maagkanker cellen Belgique om het effect van Shh op celcyclus verdeling bepalen zochten we de effecten van farmacologische remmer van Hh-signalering de expressie van p21 en cycline D1 onderzoeken. AGS, BGC823 en SGC7901 maagkanker cellijnen werden behandeld met cyclopamine (10 uM), een steroïde alkaloïde dat directe interactie met Smo tot Hh signalering [28], of DMSO controle remmen gedurende 24 uur. We zagen dat het expressieniveau van p21 werd sterk opgereguleerd, terwijl cycline D1 neerwaarts gereguleerd na tumorcellen behandeld met cyclopamine (Figuur 4A). We merken op het blokkeren van de Shh signaleringsroute door toediening van cyclopamine laat de expressieniveaus van mRNA in ZIC1 BGC823 en SGC7901 cellen door RT-PCR assays (figuur 4B). De afwezige of lage expressie van ZIC1 mRNA bij maagkanker cellen werd vooral gemediteerd door promoter DNA-methylatie zoals we eerder beschreven [8]. Figuur 4 Hh-signaleringsroute is betrokken bij de expressie van p21, cycline D1 en regulatie van celmigratie. AGS, BGC823 en SGC7901 maagkanker cellen werden behandeld met cyclopamine (10 uM), een steroïde alkaloïde dat directe interactie met Smo tot Hh signalering of DMSO controle remmen gedurende 24 uur. (A) De expressie van p21 en cycline D1 werden bepaald door western blot in AGS, BGC823 en SGC7901 cellen. (B) De expressie niveau van ZIC1 mRNA werd onderzocht door middel van conventionele RT-PCR. (C) Celmigratie werd beoordeeld door gemodificeerde Boyden Transwell kamers assays. Cellen die migreerden naar de onderkant van het membraan werden gekleurd met DAPI. (D) Het gemiddelde aantal zichtbare migrerende cellen (gemiddelde ± S.D.) werd berekend vijf willekeurige hoge krachtvelden (x 400). Het sterretje geeft aan statistische significantie (*** p < 0,001).
We hebben ook onderzocht de effecten van Shh signalering op maagkanker cel migratie. Zoals getoond in figuur 4 C en D, AGS, BGC823 en SGC7901 maagkanker cellijnen significante afname in celmigratie na toediening van cyclopamine (10 uM) gedurende 24 h (p < 0,01). Gezamenlijk tonen deze resultaten aan dat ZICI de celcyclus regulatoren en celmigratie kunnen moduleren door middel Shh signalering bij maagkanker cellen.
Genexpressieprofiel veranderingen door ectopische expressie van ZIC1 Belgique Om systematisch bepalen benedenstroomse targets van ZIC1 voerden we een affymatrix oligonucleotide microarray in MKN28 maagkanker cellen met of zonder pCDNA3.1-ZIC1. Met behulp van een cut-off van > 1,5 voudig voor statistische significantie, een microarray bleek dat 132 genen worden down-gereguleerd, terwijl 66 genen up-gereguleerd door exogene expressie van ZIC1 (vertegenwoordiger genen weergegeven in figuur 5A). Vele genen zijn gerapporteerd kritische rol spelen bij celproliferatie, celcyclus en celmigratie volgens gen functionele analyse (http:.. //Www genecards org) (Figuur 5B). Bijvoorbeeld, twee belangrijke celcyclus regulatoren TP53INPI Kopen en CDKN2B
blijken te zijn gedereguleerd in MKN28 cellen getransfecteerd met pCDNA3.1-ZIC1. Onze resultaten geven aan dat ZIC1 potentieel reguleert meerdere downstream genen betrokken bij maag- tumorigenese. Figuur 5 Genexpressieprofiel veranderingen na ectopische expressie van ZIC1. (A) De genexpressieprofielen in pCDNA3.1-ZIC1 of lege vector pCDNA3.1 stabiele transfectanten werden geanalyseerd met cDNA microarray in MKN28 cellen. Representatieve genen worden geïllustreerd aan de rechterkant van de heatmap beeld met behulp van een cut-off van > 1.5 of < -1,5 Vouwen als een significant verschil ,. (B) Genen betrokken bij celcyclus, celproliferatie en celmigratie volgens gen functionele analyse (http:.. //Www genecards org) worden gepresenteerd. Relatieve voudige verandering wordt uitgedrukt verhouding van pCDNA3.1-ZIC1 pCDNA3.1 versus controle. (C) Systemische begrip van wegen voor ZIC1 regulatie van signalering en target genen in de ontwikkeling en progressie van maagkanker.
Discussie
Groeiend bewijs heeft aangetoond dat ZIC1 is betrokken bij de progressie van diverse tumoren [3-8] . Het blijkt dat ZIC1 aberrantly wordt uitgedrukt in bepaalde typen kanker en differentieel functioneert als een tumor suppressor gen of oncogene. Zo werd ZIC1 expressie gerapporteerd laag of afwezig in maag- en longkanker cellijnen te zijn en bleek maagdarmkanker celproliferatie [7, 8, 29] onderdrukken. Daarentegen overexpressie van ZIC1 in liposarcoma bleek proliferatie en invasie [3] cel. Wij en anderen hebben aangetoond dat de epigenetische modulaties zoals DNA methylering en histon remodeling en genetische mutaties kunnen bijdragen tot de differentiële expressie patronen in kanker [3, 4, 7, 8]. Het is duidelijk dat als een transcriptiefactor zinkvinger, ZIC1 kunnen meerdere downstream genen te moduleren in zenuwweefsel, colorectale kanker en liposarcoma cellen [2, 3, 7, 9]. Er is echter weinig bekend over het mechanisme onderliggende ZIC1 functie in de ontwikkeling en progressie van maagkanker. Ter onderstreping van de belangrijkste wegen en downstream targets gereguleerd door ZIC1 kunnen ons begrip van haar rol in het ontstaan van tumoren te vergemakkelijken. Hier hebben we aangetoond dat overexpressie van ZIC1 resulteert in significante remming van cel- overleving en verminderde celmigratie. ZIC1 onderdrukt het Shh, PI3K en MAPK signaalwegen die kritisch zijn voor de regulering van de celcyclus uitkeringen en celmigratie bij maagkanker zijn. Bovendien remt ZIC1 celcyclus regulerende kinase, p21, p27 en cycline D1, hetgeen leidt tot G1 /S celcyclus doorvoer maagkanker cellen. ZIC1 onderdrukt het Shh signaleringsroute die kritisch voor de regeling van celcyclus verdeling en celmigratie bij maagkanker.
MAPK en PI 3K routes cruciale rol spelen in celproliferatie, differentiatie en progressie bij verschillende humane kanker [30]. Onlangs werd ook gemeld dat de activering van beide routes zijn essentieel voor celcyclus [30, 31] induceren. Tijdens dit proces, cycline-afhankelijke kinase inhibitors p21, p27 en cycline D /E deel aan de regulatie van p53 geïnduceerde celcyclus arrestatie [24, 32]. De activering van MAPK en downstream kinase-Erk kan niet alleen leiden tot de inductie van cycline D1 en passeren G1 /S controlepunt, maar ook de accumulatie van p21 die cycline E /CDK2 complexen remt S-fase invoerblok [30] . PI 3K /Akt route kan inactiveren de GSK3-β en FOXO transcriptiefactoren, aldus remmen cycline D1, terwijl veroorzaken p27 en p21 in de regulatie van de celcyclus binnenkomst [31]. We hebben aangetoond dat re-expressie van ZIC1 effectief inactiveren gefosforyleerde Akt en Erk1 /2 in AGS, MKN28, BGC823 en SGC7901 maagkanker cellijnen. In dit verband werd de CDK1 inhibitor p21 geactiveerd, terwijl cycline D1 geïnactiveerd na overexpressie van ZIC1 bij maagkanker cellen. Hoewel de resultaten moeten worden gevalideerd in de toekomst studies, hebben onze miroarray gegevens bleek dat andere belangrijke componenten van de celcyclus kinase regelgevers waaronder TP53INPI
en CDKN2B
, worden gedereguleerd met geforceerde expressie van ZIC1 in een individuele MKN28 maagkanker cel lijn (Figuur 5 A en B). Daarom stellen wij voor dat ZIC1 regelt G1 /S doorvoer voornamelijk door middel van PI 3K en MAPK paden en downstream celcyclus regulator kinasen bij maagkanker cellen.
Een andere belangrijke bevinding in onze huidige studie is dat ZIC1 transcriptioneel regelt Sonic hedgehog (Shh) signalering bij maagkanker cellen. Afgezien van zijn centrale rol in het reguleren maagklierwerking morfogenese in menselijke maag, wordt Shh signalering ook betrokken bij de pathogenese van maagkanker [16, 33]. Shh wordt vaak geactiveerd advanced gastrische adenocarcinomen en onderworpen aan agressieve gedrag van de tumor [13, 15, 33]. Eerdere studies hebben aangetoond dat Shh signalering bevordert de beweeglijkheid en invasiviteit van maagkanker cellen door TGF-β-ALK5-Smad3 pathway [34]. Shh signalering kan ook de expressie van p21 en cycline D1 in een Gli-afhankelijke route [16, 25]. We hebben vastgesteld dat inhibitie van Shh signalering door toediening van cyclopamine onderdrukt AGS, BGC823 en SGC7901 maag migratie van kankercellen, en de expressie van p21 en cycline D1 (figuur 4). Deze resultaten zijn consistent met eerder gerapporteerde studies [25, 34]. Zo hebben we aangetoond dat ZIC1 speelt een belangrijke rol bij maagkanker progressie door regelgeving van de Shh signaleringsroute.
ZIC1 kan target genen reguleren in beide sequentie-specifieke en onafhankelijke omgangsvormen [9]. ZIC1 kon de transcriptionele expressie van doelen met inbegrip van cycline D1, p27, Wnt1 en Wnt7a reguleren en moduleren Notch en BMP-trajecten in neurale ontwikkeling [2, 9]. ZIC1 kon GLI tegen te gaan door te binden aan GC-rijke sequenties, en het onderdrukken van de expressie van GLI bindende sequentie gericht reporter genen [9, 35]. We identificeerden verschillende ZIC potentiële doelgenen bij maagkanker cellen door microarray analyse. Deze doelstellingen zijn nauw verwant aan de celcyclus, proliferatie en celmigratie (Figuur 5B). De associatie tussen ZIC en benedenstroomse targets kunnen een aanwijzing voor het begrijpen van de potentiële perspectief van ZIC eiwitten in de progressie van maagkanker is.
Conclusies
Summier, stellen we een model dat de paden waarlangs ZIC1 bijdraagt aan maagkanker vertegenwoordigt progressie (Figuur 5C). Overexpressie van ZIC1 resultaten in het onderdrukken van Hedgehog (Hh) signalering en de downstream targets, waaronder p21, p27 en cycline D1. Als zinkvinger transcriptiefactor ZIC1 ook moduleert mogelijk de transcriptionele expressie van doelgenen door directe binding aan GC-rijke sequenties [2], waardoor het als een tumor suppressor van remming van celproliferatie, celmigratie en invasie bij maagkanker.
Methods
Celkweek en behandeling
menselijke maagkanker cellijnen (AGS, MKN28, BGC823 en SGC7901) werden verkregen van Riken Gene Bank (Japan) en de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA ). Alle cellijnen werden gekweekt in RPMI 1640 medium (Invitrogen, CA, USA) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en geïncubeerd bij 5% CO 2, 37 ° C en 95% vochtigheid. Maagkanker cellijnen (AGS, BGC823 en SGC7901) werden behandeld met 10 uM van cyclopamine (Sigma, St Louis, MO, USA) in DMSO gedurende 24 uur. Het equivalent daarvan van de drager (DMSO) werd gebruikt als controle.
Celtransfectie
AGS, MKN28, BGC823 en SGC7901 cellen werden gekweekt gedurende 24 uur in een 6-wells plaat en getransfecteerd met pcDNA 3,1-ZIC1 of pCDNA 3.1 lege vector met behulp van Fugene HD (Roche) volgens de instructies van de fabrikant. Na 48 uur werden de transfectanten continu geselecteerd in RPMI 1640 medium dat G418 (200-400 ug /mL) (Merck, Duitsland) gedurende 14 dagen.
RT-PCR en kwantitatieve real-time PCR-analyse Totaal RNA
( 1 ug) werd geëxtraheerd met behulp van Trizol reagens (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant en reverse getranscribeerd in cDNA met M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit (Takara, Japan). Het transcript niveaus van ZIC1 en Shh werden bepaald door gebruikelijke RT-PCR met TaKaRa Taq polymerase (Takara, Japan) en kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) met de SYBR Green Master Mix Kit (Takara, Japan) in een ABI 7500 PCR systeem. Primers die voor ZIC1 waren F: 5'- AAACTGGTTAACCACATCCGC en R: 5'-CTCAAACTCGCACTTGAAGG. Shh waren F: 5'-GTAAGGACAAGTTGAACGCTTTG en R: 5'-GATATGTGCCTTGGACTCGTAGTA. Glyceraldehyde-3-; phosohate dehydrogenase (GAPDH) als een interne controle. Het transcript worden uitgedrukt als 2 -ΔΔCt waarden en relatieve expressie veelvoudverandering is genormaliseerd op GAPDH.
Cellevensvatbaarheid assay
cellevensvatbaarheid werd gedetecteerd met een niet-radioactieve celproliferatie assay met 3- (4,5- dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyfenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium (MTS) reagens (Promega, Madison, USA). Stabiel getransfecteerde cellen werden uitgeplaat in 96 putjes (2000 cellen /putje) gedurende 6 uur, 24 uur, 72 uur en 120 uur. De absorptie werd gemeten bij 490 nm na 1 uur incubatie met CellTiter 96 Aqueous One Solution reagens.
Celcyclus en apoptose analyse
celcyclus verdeling werden gedetecteerd door stromingscytometrie analyse. Cellen getransfecteerd met pCDNA3.1-ZIC1 of pCDNA3.1 lege vector werden geoogst en gewassen met PBS. Cellulair DNA werd gekleurd met celcyclus kleuroplossing die propidium jodide (PI) bij 4 ° C in het donker. Celcyclus werd bepaald met een FACS Calibur en geanalyseerd met software ModFitLT (Phoenix, USA).
Cel apoptose werd uitgevoerd met FITC Annexine V Apoptosis Detection Kit II (BD Pharmingen) door flowcytometrie analyse. Transient getransfecteerde cellen werden gesuspendeerd in annexine V Binding Buffer. Daarna werden FITC Annexine V en PI oplossingen achtereenvolgens toegevoegd. Na incubatie gedurende 15 min, FACScan de gekleurde cellen werden door stroomcytometrie flowcytometrie (Becton Dickinson, USA).
Celmigratie invasie assays
Celmigratie werd beoordeeld door gemodificeerde Boyden Transwell kamers assay (Coring, USA). In het kort cellen werden gekweekt in serumvrij medium gedurende 24 uur en 5 x 10 4 cellen werden aan de bovenste kamer in 300 ul medium met 5% FBS. Na 16 uur incubatie werden niet-migrerende cellen in de bovenste kamer zorgvuldig verwijderd met een wattenstaafje. Gemigreerd cellen werden gekleurd met DAPI kleuring Solution. De celaantallen werden willekeurig geteld in vijf velden (400 × vergroting).
Invasie werd uitgevoerd in een Millipore 24 putjes bekleed met Matrigel BD. Na verhongering in serumvrij medium gedurende 24 uur, 1 x 10 5 cellen werden aan de bovenste kamer in 300 ul van medium dat 5% FBS, terwijl de onderste kamer werd gevuld met 600 pl cultuurmedium met 15% FBS. Nadat zij gedurende 30 uur werden de membranen geïncubeerd met Cell Stain Solution (Millorpore, USA). De kleurstof werd gewassen door extractie buffer en overgebracht naar een 96 putjes voor colorimetrische meting bij 560 nm.
Western blotanalyse
Totaal eiwitten uit cellen middels radio-immunoprecipitatie assay lysisbuffer aangevuld met proteaseremmer werden geëxtraheerd. Lysaten werden gescheiden op 6-12% SDS-PAGE minigels en overgebracht naar PVDF membranen (Millipore, Bedford, MA). Membranen werden geblokkeerd in 5% melk met TBST en geïncubeerd in 4 ° C gedurende de nacht met de volgende antilichamen: ZIC1 (1: 500; Abcam), fosfo-Akt (1: 1000; Cell Signaling), Akt (1: 500; Abcam), fosfo-Erk1 /2 (1: 1000; Cell Signaling), Erk1 /2 (1: 1000; Cell Signaling), p21 waf1 /Cip1 (1: 1000; Cell Signaling), p27 Kip1 (1: 500; Epitomics), cycline D1 (1: 1000; Cell Signaling) en Shh (1: 1000; Cell Signaling). Dienovereenkomstig secundaire antilichamen gekoppeld aan mierikswortel peroxidase (HRP) werden gevisualiseerd met behulp van een chemiluminescentie met Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Japan). De relatieve dichtheden van eiwitten werden gekwantificeerd met Image J. software en genormaliseerd aan P-actine. (1: 2500, Multisciences Biotech)
cDNA microarray analyse
Totaal RNA werd geïsoleerd uit MKN28-cellen die stabiel getransfecteerd met pCDNA3.1 -ZIC1 of pCDNA3.1 lege vector, en werd omgekeerd getranscribeerd naar cDNA. Gelabelde monsters werden gehybridiseerd met Agilent hele menselijke genoom met meer dan 41.000 probes (http:.....? //Www NCBI NLM nih gov /geo /vraag /acc cgi acc = GSE38924). De microarray gegevens werden geanalyseerd met behulp van Agilent Feature Extraction software. Wij selecteerden een fold change ≥1.5 of ≤ -1,5 als een significant verschil Statistische analyse
Student t Electronics Test.
Werd uitgevoerd om twee onafhankelijke gegevens te vergelijken, terwijl de Chi-kwadraat of Fisher exact test werd gebruikt om analyseren categorische variabelen. Een cut-off van p < 0,05 werd toegepast voor statistische significantie.
Notes
Jing Zhong, Shujie Chen eveneens bijgedragen aan dit werk.
Verklaringen
Erkenning
Het project werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (30.900.676, 81071961), de Nationale Basic Research Program van China (973 Program) (2012CB945004) en Wetenschap en Technologie Key project van de provincie Zhejiang in China (2009 C03012-3). De auteurs zijn dankbaar Prof. Tianhua Zhou en Prof. Lei Guo voor nuttige tips en discussie; . En Thomas R. Austin voor kritische beoordeling en bewerken van het manuscript
Electronic aanvullend materiaal
12885_2011_3201_MOESM1_ESM.tiff Extra file 1: Figuur S1. GAPDH werd gebruikt als een interne controle.
Hoe helpen gastheerfactoren zoals het longmicrobioom bij SARS-CoV‐2-infectie?
Mensen met IBS-symptomen die waarschijnlijk een laag vitamine D-gehalte hebben,
Type bovenste luchtwegbacteriën kan de ernst van astma beïnvloeden
Darmbacteriën kunnen in verband worden gebracht met depressie
Verandering van het microbioom van de bovenste luchtwegen bij kinderen in verband met gevoeligheid voor SARS-CoV-2
Aanwezigheid van bepaalde darmbacteriën bij moeders kan baby's beschermen tegen voedselallergieën
Onderzoek zegt bij SARS-CoV-2 hondeninfectie,
overdracht onwaarschijnlijk Een nieuwe studie gepubliceerd op de preprint-server bioRxiv* in september 2020 blijkt dat honden ziek zijn geworden en sterven aan een mysterieuze luchtweginfectie, vaak
Koffie helpt bij het ontwikkelen van gezonde darmmicroben en bevordert de stoelgang
Er is anekdotisch bewijs dat koffiedrinkers bij hun ochtendbeker zweren voor een normale stoelgang in de ochtend. Een nieuwe studie van onderzoekers in Texas heeft aangetoond dat koffie inderdaad help
Studie beschrijft initiële baseline gezonde darmmicrobioom-database en overvloedprofiel
Een eerste baseline-database met gezond darmmicrobioom en abundantieprofiel wordt beschreven in een onderzoek dat op 11 september is gepubliceerd, 2019 in het open-access tijdschrift PLOS ONE door Cha