| Stomach Health > skrandžio sveikatos >  > Stomach Knowledges > tyrimai

ZIC1 moduliuoja ląstelių ciklo paskirstymus ir ląstelių migraciją per reguliavimo sonic ežys, PI3K ir MAPK signalo perdavimo kelių skrandžio vėžio

ZIC1 moduliuoja ląstelių ciklo paskirstymus ir ląstelių migraciją per reguliavimo sonic ežys, VšĮ 3K bei MAPK signalo perdavimo kelių skrandžio vėžio
tezės
Background pervežimas ZIC1, gyvybiškai transkripcijos veiksnio cinko pirštų srityse, turi buvo susijęs neuroninio plėtros procese. Mes anksčiau parodė, kad ZIC1 gali funkcionuoti kaip naviko slopintuvas virškinimo trakto vėžio. Tačiau molekulinės mechanizmo, lemiančio ZIC1 dalyvavimas naviko progresavimo lieka nežinoma.
Metodai Viesbutis The iš ZIC1 vaidmenį ląstelių proliferaciją ir migraciją buvo nagrinėjama. buvo įvertintas Sonic ežys reglamentas (Ša), phosphoinositide 3-kinazės (PI 3k) ir mitogenas aktyvuota baltymų kinazės (MAPK) signaliniai kelius po negimdinio išraiška ZIC1 skrandžio vėžio ląsteles.
rezultatai
Padidėjusi ZIC1 prisideda prie ląstelių proliferaciją migracijos ir ląstelių ciklo paskirstymo slopinimo skrandžio vėžio. Iš G1 /S Checkpoint moduliacija ZIC1 daugiausia tarpininkavo per cikloniniai priklausoma kinazės reglamentas (p21 Waf1 /CIP1, P27 Kip1 ir cikloniniai D1). Be to, ZIC1 gali inaktyvuoti su phospholated Akt ir ERK1 /2 lygį ir transkripciškai reguliuoti sonic ežys (Shh) geležinkelių, todėl jų reguliuoti p21 Waf1 /CIP1 ir cikloniniai D1 išraiška. Galiausiai, mes turime sistemiškai identifikuoti ZIC1 pasroviui tikslus, pagal kDNR mikrogardeliq analizę ir paaiškėjo, kad 132 genai žemyn reguliuojama ir 66 genai iki reguliuojama po transfekciją su ZIC1 skrandžio vėžio ląsteles. Šios kandidatės genai vaidina svarbius vaidmenis ląstelių proliferaciją, ląstelės ciklo ir ląstelių judrumui.
Išvadas
Padidėjusi ZIC1 rezultatų nukenksminimo Ša, PI 3K bei MAPK signalizacijos kelius, taip pat reglamento keliais tolesniems tikslus kurie yra būtini kuriant ir progresavimo skrandžio vėžio. ZIC1 tarnauja kaip galimą terapinį tikslą skrandžio vėžio.
Raktiniai žodžiai
ZIC1 Sonic ežys ląstelės ciklo Naviko slopinamąjį Background
ZIC1, viena iš penkių Žic šeimos genai, dalyvauja daugelyje raidos procesuose, įskaitant neurogenesis ir įvairovė myogenesis [1, 2]. Neseniai ZIC1 buvo dokumentuota dalyvauti žmogaus navikų, įskaitant meduloblastomos, endometriumo vėžio, mezenchiminių navikais ir liposarkoma vėžio [3-6] progresavimą. Mes jau anksčiau parodė, kad ZIC1 genas yra žymiai downregulated skrandžio vėžio audinių ir ląstelių linijų, kai palyginti su normaliomis skrandžio audinius. Be to, ZIC1 potencialiai tarnauja kaip auglio slopinamojo slopinant ląstelių proliferaciją in skrandžio ir storosios žarnos vėžio ląstelių [7, 8]. Kaip svarbų transkripcijos veiksnio, ZIC1 svarbu į Ežiukas signalizacijos (HH), kaulų morfogenezės baltymo (BMP) reglamentą, ir tarpeklio signalizacijos kelius nervų plėtros [2, 9]. Tačiau mažai žinoma apie tai, kaip ZIC1 reguliuoja signalo kelius ir su jais susijusios pasroviui tikslus nuo vėžio progresavimą.
Skrandžio vėžys yra antra pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirčių visame pasaulyje [10, 11]. Hh signalizacijos yra vienas iš pagrindinių onkogeninių signaliniu keliu, dalyvaujančių skrandžio kancerogenezėje [12, 13]. Sonic ežys (Ša), iš žinduolių Hh šeimos [14] Valstybės, buvo įrodyta, kad būti tiek aktyvinama skrandžio vėžio audiniuose in situ hibridizacijos metodu ir labai svarbus skrandžio vėžio progresavimą [13, 15]. Hh signalizacijos kelias aktyvuojamas Ša kirptas lopas (Ptch) - smoothened (BRO) membranos receptorių kompleksas [16]. Iš Ša aktyvacijos skatina skrandžio vėžio ląstelių diferenciaciją ir proliferaciją. Buvo pranešta, kad ZIC1 galėtų sumažinti PTCH1
ir Ša
genų nervinio audinio išraišką per Priekšnojauta plėtros [17]. Priešingai, rezultatai parodė, kad Ša malšina į ZIC1 išraišką per nervinio vamzdelio vystymosi [18]. Nepaisant to, ZIC1 įtaka Hh signalinio kelio skrandžio vėžio lieka nežinoma.
ZIC1 taip pat reglamentuoja daug tikslų, įskaitant ciklino D1, P27, Wnt1 ir Wnt7a per neuronų vystymuisi Xenopus ectodermal eksplantuose ir mutantas pelėmis modelių [9, 19, 20]. Mes esame ypač suinteresuoti ląstelių ciklo reguliavimo svarbių vėžio ląstelių proliferaciją ir diferenciaciją. Mes jau anksčiau parodė, kad ZIC1 raiška gali pakeisti G1 /S perėjimą skrandžio vėžio ląstelių [8]. Keli mechanizmai cikloniniai priklausomų kinazės (CDKs) dalyvauja G1 /S Checkpoint žmogaus vėžiui [21] Reglamentas. perėjimo nuo G1 į S fazę, ciklino D kuris yra aktyvių kompleksus su CDK4 metu yra iki reguliuojama skrandžio vėžio [22, 23]. Praradimas cikloniniai priklausomų kinazės inhibitorių, pvz p21 Waf1 /CIP1 ir P27 Kip 1 skatinti CDK2 veiklą ir reguliuoti G1 /S perėjimą [12, 24]. Naujausi tyrimai parodė, kad mutantas ZIC1 arba jėga padidėjusią ZIC1 reguliuoja P27 išraišką Kip 1 pelėms smegenėlių audinių ir ląstelių liposarkoma [3, 20]. Įdomu tai, kad Ša signalizacijos kelias neigiamai reguliuoja p21 Waf1 /CIP1 ir cikloniniai D1 į GLI1 priklausomu būdu [16, 25]. Tačiau, ar ZIC1 gali sąveika su Ša keliu į ląstelės ciklą paskirstymo reglamentą nebuvo apibrėžta. Išaiškinimas šiuo signalizacijos tinklo gali suteikti daugiau įžvalgų į ZIC1 vaidmenį skrandžio vėžio.
Mūsų Šiame tyrime mes įrodyti, kad padidėjusią ZIC1 slopina skrandžio vėžio ląstelių migraciją ir invazija, taip pat keičia ląstelių ciklo paskirstymą. ZIC1 gali transkripciškai downregulate į Ša signalizacijos ir slopina phospholated Akt ir ERK lygį, tokiu būdu veda prie ląstelių ciklo reguliatoriaus reguliavimo kinazės p21 Waf1 /CIP1, P27 Kip1 ir cikloniniai D1 skrandžio vėžio ląsteles. Mes taip pat nustatė kelis svarbu ZIC1 pasroviui tikslus skrandžio vėžio ląstelių kDNR mikrogardeliq analizė.
Rezultatai
ZIC1 slopina proliferaciją, migraciją ir invazija skrandžio vėžio ląstelių
Norėdami nustatyti ZIC1 poveikį ląstelių proliferaciją, mes atliekame ląstelių gyvybingumas analizė MTS tyrimų skrandžio vėžio ląsteles. Skrandžio vėžio ląstelių linijas (MAA, MKN28, BGC823 ir SGC7901) buvo pernešta su pCDNA3.1-ZIC1 ar pCDNA3.1 tuščias vektorių. Transfekcija efektyvumas buvo patvirtinta RT-PGR ir Western Blot atitinkamai (1A pav). Rezultatai parodė, kad gyvybingų ląstelių skaičius buvo gerokai numalšino negimdinio išraiška ZIC1 į 5 dienų stebėjimui BGC823 ląstelių (1b pav.) Dėl ląstelių proliferacijos pagal ZIC1 slopinimas buvo atitinka mūsų ankstesnius stebėjimų AGS ir MKN28 skrandžio vėžio ląstelių, taip pat gaubtinės žarnos vėžio ląstelės [7, 8]. 1 pav ZIC1 slopina ląstelių proliferaciją ir migraciją skrandžio vėžio. (A) skrandžio vėžys ląstelių linijas (MAA, MKN28, BGC823 ir SGC7901) buvo stabiliai perkeltų su pCDNA3.1-ZIC1 ar pCDNA3.1 tuščias vektorių. Sąvoka lygiai ZIC1 mRNR ir baltymų vykdė RT-PCR (viršutinė diagramą) ir Vakarų dėmė (mažos diagramą). GAPDH ir β-aktino buvo naudojami kaip vidaus kontrolės. (B) ląstelių gyvybingumas skrandžio vėžio ląstelių linijos (BGC823) nulėmė MTS ląstelių proliferacijos tyrimu. Žvaigždute rodo statistinį reikšmingumą (** p < 0 01). (C), ląstelių migraciją buvo įvertintas keistas Boyden transwell rūmus tyrimus, atliekamus po inkubacijos 16 val. Ląstelės, kad patekę į membranos apačioje buvo tamsintas su DAPI. (D) matomų migruojančių ląstelių skaičius (vidurkis ± S.D) buvo įvertintas skaičiuojant penkis atsitiktinius didelės galios laukų (× 400 priartinimas). Šie eksperimentai buvo pakartotas tris kartus. Tipinės duomenys rodomi. Žvaigždute rodo statistinį reikšmingumą (*** p < 0,001).
Be to, mes lėmė ZIC1 vaidmenį ląstelių migracijos ir invazijos į skrandžio vėžį. Ląstelių migracija ir invazija tyrimai buvo atlikti transwell migracijos ir Matrigel dengtos invazija kiekybinės analizės pagalba sistemas, atitinkamai. Mes pastebėjo, kad iš naujo išraiška ZIC1 reikšmingai slopino ląstelių migraciją į AGS, BGC823 ir SGC7901 skrandžio vėžio ląstelių linijas (p < 0,001) (1c paveikslas, D). Be to, naujo išraiška ZIC1 rodomas gerokai mažesnė aktyvumą ląstelių invaziją, palyginti su tų tuščių vektoriaus transfectants į AGS ląstelių (p < 0,05) (papildomas failų 1: S1 paveiksle). Šie duomenys rodo, kad negimdinis išraiška ZIC1 slopina skrandžio vėžio ląstelių migraciją ir invazija.
ZIC1 keičia ląstelių ciklo paskirstymus ir reguliuoja cikloniniai priklausoma kinazės skrandžio vėžio ląstelių išraiška
dar suprasti mechanizmus, sukeliančius slopinimu ląstelių proliferacija iki Padidėjusi ZIC1, mes įvertintas ląstelių ciklo paskirstymo skrandžio vėžio ląsteles. Mes nustatėme didesnę dalį ląstelių G1 fazę AGS (42,74%) ir SGC7901 (54,03%) ląstelių linijas po Padidėjusi ZIC1. Tačiau ląstelėse transfektuotose valdymo vektorių, proporcija sumažėjo tiek AGS (32,66%) ir SGC7901 (47,00%) ir ląstelių S fazėje proporcingai buvo santykinai didesnį (2a pav.) Jis yra gerai priimtas, kad p21 (taip pat žinomas kaip p21 Waf1 /CIP1) ir p27 (taip pat žinomas kaip p27 KIP1), du pagrindiniai cikloniniai priklausoma kinazės inhibitorių, reikalingi nutraukimo metu atvykti į S fazę [26]. Iš cikloniniai D1 aktyvavimo, tačiau yra daugiausiai atsakinga už reguliuojant G1-S fazės perėjimą [23]. Mes parodė, kad pasakymas lygis ciklino D1 baltymų buvo sumažintas, o P21 ir P27 buvo gerokai sukelta skrandžio vėžio ląstelių transfektuotose pCDNA3.1-ZIC1, palyginti su tų pCDNA3.1 tuščios vektorinės transfectants (2b pav.) Mes taip pat įvertino mobiliojo apoptozę paskirstymo į pCDNA3.1-ZIC1 ar pCDNA3.1 vektorinę transfectants į AGS ir MKN28 ląstelių, tačiau nebuvo pastebėta akivaizdžių skirtumų ląstelių apoptozę (papildomas failą 2: S2 pav). Todėl šie rezultatai patvirtina, kad padidėjusią ZIC1 keičia ląstelės ciklo paskirstymą per reguliavimo ciklino priklausoma kinazės p21, p27, taip pat ciklino D1 skrandžio vėžio ląsteles. 2 pav ZIC1 keičia ląstelių ciklo paskirstymų reguliavimo P21, P27 ir ciklino D1 skrandžio vėžio ląsteles. (A) ląstelės ciklo skirstiniai buvo aptikta tėkmės citometrijos analizė AGS ir SGC7901 ląstelių po trumpalaikis transfekciją su pCDNA3.1-ZIC1 ar pCDNA3.1 tuščias vektoriaus 24 h. (B) ekspresijos lygis p21, p27 ir ciklino D1 buvo nustatomas pagal Western Blot. β-aktino buvo atpažintas kaip pakrovimo kontrolę. Densitometry vertės išreiškiamos kaip kartų kaita, palyginti su normalizuojamas 1. (C) pCDNA3.1 vektoriaus valdymo vertybių išraiška lygių phospholated Akt ir ERK1 /2, taip pat visos Akt ir ERK1 /2 išnagrinėjo Vakarų dėmė.
MAPK ir PI 3K keliai vaidmuo gyvybiškai svarbus į mobilųjį ciklo aktyvumo reguliavimas. Mes įvertino pagrindinių tolesnių vykdomuosius šių dviejų būdų išraiška, ERK1 /2 ir AKT po stabiliai įvedant pCDNA3.1-ZIC1 į AGS, MKN28, BGC823 ir SGC7901 skrandžio vėžio ląstelių (1a pav.) Mes nustatėme, kad fosforilinimo lygis ERK1 /2 ir AKT buvo smarkiai slopina padidėjusią ZIC1 visų aukščiau ląstelių linijų išbandytų (2c pav.) Šie rezultatai rodo, kad ląstelės cylce paskirstymo reguliavimas ZIC1 gali būti mediēta PI 3K ir MAPK kelius ir jų pasroviui cikloniniai priklausoma kinazės P21, P27 ir ciklino D1 skrandžio vėžio.
ZIC1 slopina išraiška Sonic ežys (Ša) skrandžio vėžio ląstelių
Molekulinė charakteristika rodo, kad ZIC1
turi cinko pirštų sritis ir gali neutralizuoti su GLI1, prisijungdamas prie GC-turtingas sekų [2]. GLI1 yra tolesnis tikslas ežys (HH) signalinio kelio, kuris yra labai svarbus skrandžio vėžio išsivystymo ir progresavimo [9, 27]. Mes iškėlė hipotezę, kad Hh signalizacijos kelias gali būti įtraukti į ZIC1 reguliavimo skrandžio vėžio ląstelių ciklo ir ląstelių migraciją. Siekiant spręsti šią problemą, mes išnagrinėjo Sonic ežys išraišką (Shh), pagrindinį narys Hh šeimoje, skrandžio vėžio ląstelių po Padidėjusi ZIC1. Mes nustatėme, kad vėl išraiška ZIC1 efektyviai sumažina Ša išraišką BGC823 ir SGC7901 ląstelių linijų Vakarų dėmė analizė (3a pav.) Be to, RT-PGR analizė parodė, kad stenograma lygis Ša taip pat žymiai downregulated skrandžio vėžio ląstelių transfektuotose ZIC1 palyginti su tuščiais vektoriaus transfectants (p < 0,01) (3b pav) (papildomas failas 3: S3 pav.) , Kartu paėmus, mūsų rezultatai rodo, kad ZIC1 gali transkripciškai reguliuoti Ša išraišką skrandžio vėžio ląsteles. 3 pav ZIC1 slopina Sonic ežys (Shh) išraiška. (A) Ša baltymo ekspresija buvo analizuojami Vakarų dėmė į BGC823 ir SGC7901 ląstelės stabiliai perkeltų su pCDNA3.1-ZIC1 ar pCDNA3.1 tuščias vektorių. (B) raiškos lygis iš Šaa mRNR buvo nustatomas pagal realaus laiko kiekybine RT-PGR metodu. Santykinis išraiška lygis buvo išreikštas kartų kaita (vidurkis ± SEM), palyginti su pCDNA3.1 tuščias vektoriaus normalizuotas iki 1.
Ežiukas (HH) signaliniai kelią dalyvauja atliekant ZIC1 reguliavimo ląstelių ciklo ir ląstelių migraciją skrandžio vėžio ląstelės
Norėdami nustatyti Ša poveikį ląstelių ciklo paskirstymo, mes siekėme išnagrinėti farmakologinio inhibitorius Hh signalizacijos dėl p21 ir ciklino D1 raiškos poveikį. AGS, BGC823 ir SGC7901 skrandžio vėžio ląstelių linijos buvo gydomi cyclopamine (10 mikromolių), steroidinės alkaloidas, kad sąveikauja tiesiogiai su SMO slopinti Hh signalizacijos [28] arba DMSO kontrolę 24 val. Matėme, kad sąvoka lygis p21 buvo gerokai iki reguliuojama, o cikloniniai D1 žemyn reguliuojama po naviko ląstelės buvo gydomi cyclopamine (4a pav.) Pažymėtina, blokuoja Ša signalizacijos kelią skiriant cyclopamine neturi įtakos išraiška lygius ZIC1 mRNR BGC823 ir SGC7901 ląstelių AT-PGR (4b pav.) Nebuvimo arba žemas išraiška ZIC1 mRNR skrandžio vėžio ląstelių buvo daugiausia meditavo iki promotoriaus DNR metilinimo kaip mes aprašyta anksčiau [8]. 4 pav Hh signalizacijos kelias yra dalyvauja p21, ciklino D1 ir reguliavimo ląstelių migracijos išraiška. AGS, BGC823 ir SGC7901 skrandžio vėžio ląstelės buvo gydomi cyclopamine (10 mikromolių), steroidinės alkaloidas, kad sąveikauja tiesiogiai su SMO slopinti Hh signalizaciją, ar DMSO kontrolę 24 val. (A) Sąvoka lygiai p21 ir ciklino D1 lėmė Vakarų dėmė į AGS, BGC823 ir SGC7901 ląsteles. (B) Sąvoka lygis ZIC1 mRNR buvo išnagrinėta per įprastinių RT-PGR. (C), ląstelių migraciją buvo įvertintas keistas Boyden transwell rūmus tyrimų. Ląstelės, kad patekę į membranos apačioje buvo tamsintas su DAPI. (D) skaičiaus vidurkis matomų migruojančių ląstelių (vidurkis ± S.D) buvo apskaičiuojamas penkių atsitiktinių didelės galios laukų (× 400). Žvaigždute rodo statistinį reikšmingumą (*** p < 0,001).
Mes taip pat įvertino Ša signalizacijos poveikį skrandžio vėžio ląstelių migraciją. Kaip parodyta 4 pav C ir D, AGS, BGC823 ir SGC7901 skrandžio vėžio ląstelių linijas parodė reikšmingai sumažėjo ląstelių migraciją po administracija su cyclopamine (10 mikromolių) 24 h (p < 0,01). Bendrai, šie rezultatai rodo, kad Hadžičių gali moduliuoti ląstelių ciklo reguliavimo ir ląstelių migraciją per Ša signalizacijos skrandžio vėžio ląsteles.
Genų ekspresijos profilis pasikeičia negimdinio išraiška ZIC1
sistemingai nustatyti tolesnius tikslus ZIC1, mes atlikome affymatrix oligonukleotidas Mikrogardelė į MKN28 skrandžio vėžio ląstelių su arba be pCDNA3.1-ZIC1. Naudojant ribinę apie > 1,5 karto už statistinio reikšmingumo A Mikrogardelė atskleidė, kad 132 genai žemyn reguliuojama, o 66 genai yra up-reguliuojami egzogeninės išraiška ZIC1 (atstovybių genų parodyta 5A pav.) Daugelis genai buvo pranešta žaisti kritinių vaidmenis ląstelių proliferaciją, ląstelės ciklo ir ląstelių migraciją pagal genų funkcinės analizės (http:.. //Www genecards org) (5b pav.) Pavyzdžiui, du pagrindiniai ląstelių ciklo reguliavimo TP53INPI parsisiųsti ir CDKN2B
yra nustatyta, kad nereguliuojama į MKN28 ląstelių tranfected su pCDNA3.1-ZIC1. Mūsų rezultatai rodo, kad ZIC1 potencialiai reguliuoja kelis tolesnius genus skrandžio Tumorigenesis. 5 paveikslas genų ekspresijos profilis pokyčiai po negimdinio išraiška ZIC1. (A) genų ekspresijos profilius pCDNA3.1-ZIC1 ar tuščių pCDNA3.1 vektoriaus stabilių transfectants buvo analizuojami kDNR microarray į MKN28 ląsteles. Tipinių genai yra pavaizduota dešinėje pusėje spalvinė diagrama vaizdą, naudojant atjungimo > 1,5 arba < -1,5 Kartus kaip reikšmingas skirtumas ,. (B) genus ląstelės ciklo, ląstelių proliferacija ir ląstelių migraciją pagal genų funkcinės analizės (http:.. //Www genecards org) pateikti. Santykinis kartų kaita išreikšta santykiu pCDNA3.1-ZIC1 palyginti pCDNA3.1 kontrolę. (C) sistemingai suprasti kelius ZIC1 reguliavimo signalų ir tikslinių genų kuriant ir progresavimo skrandžio vėžio.
Diskusijos
daugėja įrodymų, parodė, kad ZIC1 dalyvauja kelių navikų progresavimo [3-8] , Atrodo, kad ZIC1 yra nenormaliai išreikštas tam tikrų vėžio rūšių ir atskirtinai veikia kaip auglio slopinamojo arba onkogeninių geno. Pavyzdžiui, ZIC1 išraiška buvo pranešė, kad turėtų būti mažas arba jo nėra virškinimo trakto ir plaučių vėžio ląstelių linijas,, ir buvo nustatyta, kad slopinti virškinimo trakto vėžys ląstelių proliferaciją [7, 8, 29]. Priešingai, buvo nustatyta padidėjusią ZIC1 į liposarkoma skatinti ląstelių proliferaciją ir invazija [3]. Mes ir kiti įrodė, kad Epigenetiniai moduliacijos įskaitant DNR metilinimo ir Histonas rekonstruoti ir genetines mutacijas, gali prisidėti prie jos skirtumas raiškos modelių vėžio [3, 4, 7, 8]. Darosi aišku, kad kaip cinko pirštų transkripcijos faktorius, ZIC1 gali moduliuoti kelis tolesnius genus nervų audiniuose, storosios žarnos vėžio ir liposarkoma ląstelių [2, 3, 7, 9]. Tačiau mažai žinoma apie mechanizmo, lemiančio ZIC1 funkcija kuriant ir progresavimo skrandžio vėžio. Pabrėžęs, pagrindinius kelius ir tolesnius tikslus reguliuojami ZIC1 gali palengvinti mūsų supratimą apie jo vaidmenis Tumorigenesis. Čia mes parodėme, kad ZIC1 rezultatus gerokai slopina ląstelės išlikimui ir sutrikusi ląstelių migracijos raiška. ZIC1 slopina Ša, PI3K ir MAPK signalo perdavimo kelių, kurie yra itin svarbios ląstelių ciklo paskirstymo reguliavimas ir ląstelių migraciją skrandžio vėžio. Be to, ZIC1 slopina ląstelės ciklo reguliavimo kinazes, p21, p27 ir ciklino D1, todėl jų G1 /S ląstelės ciklo tranzito skrandžio vėžio ląsteles. ZIC1 slopina Ša signalizacijos kelią, kuris yra ypač svarbus ląstelių ciklo paskirstymo reguliavimas ir ląstelių migraciją skrandžio vėžio.
MAPK ir VšĮ 3K keliai žaisti kritinių vaidmenis ląstelių proliferacijos, diferenciacijos ir progresavimo iš įvairių žmogaus vėžio [30]. Neseniai, ji buvo taip pat pranešė, kad abiejų kelius aktyvavimo yra labai svarbūs, kad paskatintų ląstelių ciklo įrašą [30, 31]. Šio proceso metu, cikloniniai priklauso kinazės inhibitoriai P21, P27 ir cikloniniai D /E dalyvauti p53 sukelto ląstelių ciklo areštas [24, 32] Reglamentas. Iš MAPK ir jos vartotojų kinazės ERK aktyvinimas gali ne tik sukelti ciklino D1 indukcijos ir pro G1 /S posto, bet ir p21 kaupimas, kuris slopina cikloniniai E /CDK2 kompleksus blokuoti S fazių įrašą [30] , VšĮ 3K /AKT kelyje gali nukenksminti Gsk3-beta ir FOXO transkripcijos faktorius, todėl slopina ciklino D1, o sukelti p27 ir p21 į mobilųjį ciklo įrašą [31] Reglamentas. Mes parodė, kad naujo išraiška ZIC1 veiksmingai nukenksmina fosforilinto Akt ir ERK1 /2 AGS, MKN28, BGC823 ir SGC7901 skrandžio vėžio ląstelių linijas. Šiuo atžvilgiu CDK1 inhibitorius P21 buvo aktyvuota, o cikloniniai D1 inaktyvuotas po Padidėjusi ZIC1 skrandžio vėžio ląsteles. Nors rezultatai turi būti patvirtintas būsimoms studijoms, mūsų miroarray duomenys parodė, kad kiti pagrindiniai komponentai ląstelinio ciklo kinazės reguliavimo įskaitant TP53INPI
ir CDKN2B
, yra nereguliuojama su dirbtine išraiška ZIC1 individuali MKN28 skrandžio vėžio ląstelių linija (5 pav A ir B). Todėl mes siūlome, kad ZIC1 reguliuoja G1 /S tranzitą daugiausia per PI 3K bei MAPK kelius ir tolesniems ląstelių ciklo reguliatorius kinazės skrandžio vėžio ląsteles.
Kitas svarbus faktas mūsų Šio tyrimo yra tai, kad ZIC1 transkripciškai reguliuoja Sonic ežys (Ša) signaliniai skrandžio vėžio ląsteles. Be savo centrinę vaidmenį reguliuojant skrandžio liaukos morfogenezę žmogaus skrandžio, Ša signalizacijos yra taip pat dalyvauja skrandžio vėžio [16, 33] patogenezėje. Ša dažnai aktyvuojamas išplitusiu skrandžio adenokarcinomos ir susijęs su agresyvaus auglio elgesį [13, 15, 33]. Ankstesni tyrimai parodė, kad Ša signalizacijos skatina peristaltiką ir invaziškumo skrandžio vėžio ląsteles per TGF--Alk5-Smad3 keliu [34]. Ša signalizacijos taip pat gali reguliuoti p21 ir ciklino D1 ekspresiją Gli priklausomas keliu [16, 25]. Mes pastebėjome, kad slopinimas Ša signalizacijos administracija su cyclopamine slopina AGS, BGC823 ir SGC7901 skrandžio vėžio ląstelių migraciją ir reguliuoja p21 ir ciklino D1 (4 paveikslas) išraiška. Šie rezultatai sutampa su anksčiau pranešta tyrimų [25, 34]. Taigi, mes parodė, kad ZIC1 vaidina svarbų vaidmenį skrandžio vėžio progresavimą reguliavimo Ša signalizacijos keliu.
ZIC1 gali reguliuoti tikslines genus tiek specifinės sekos ir nepriklausomų būdų [9]. ZIC1 gali reguliuoti transkripcijos išraišką tikslus, įskaitant ciklino D1, P27, Wnt1 ir Wnt7a ir moduliuoti Notch ir BMP kelius nervų plėtros [2, 9]. ZIC1 gali neutralizuoti GLI, prisijungdamas prie GC-turtingas sekas, ir slopinti GLI privalomos sekos nukreiptas reporteris genų [9, 35] išraiška. Mes nustatė keletą Žic galimoms tikslinėms genus skrandžio vėžio ląstelių mikrogardeliq analizė. Šie tikslai yra glaudžiai susiję su ląstelės ciklo, ląstelių proliferacija ir migracija (5b pav.) Tarp ZIC ir paskesnių tikslų asociacija gali būti raktas suprasti galimą perspektyvą Žic baltymų skrandžio vėžio progresavimą.
Išvadas
trumpai, mes pasiūlyti modelį, simbolizuojanti kelius, per kurį ZIC1 prisideda prie skrandžio vėžio progresavimo (5C pav.) Padidėjusi ZIC1 rezultatų slopinant ežys (VV) signalizavimo sistema ir jos paskesnių tikslus, įskaitant p21, p27 ir ciklino D1. Kaip cinko pirštas transkripcijos veiksnio, ZIC1 taip pat potencialiai moduliuoja transkripcijos išraiška tikslinių genų tiesiogiai jungiasi prie GC-daug sekų [2], tokiu būdu veikia kaip auglio slopinamojo slopina ląstelių proliferaciją, ląstelių migracija ir invazijos skrandžio vėžio.
metodai
ląstelių kultūros ir gydymas
žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų (MAA, MKN28, BGC823 ir SGC7901) buvo gauti iš Riken genų banke (Japonija) ir American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA ). Visi ląstelių linijos buvo auginamos RPMI 1640 terpė (Invitrogen, CA, USA), papildytoje su 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS) ir inkubuojama 5% CO 2, 37 ° C ir 95% drėgnumo. Skrandžio vėžio ląstelių linijas (MAA, BGC823 ir SGC7901) buvo gydomi 10 mikromolių iš cyclopamine (Sigma, St Louis, MO, USA) DMSO 24 valandas. Lygiavertis koncentracija transporto priemonės (DMSO) buvo naudojama kaip kontrolės.
Mobilusis transfekcija
AGS, MKN28, BGC823 ir SGC7901 ląstelės buvo auginamos 24 h 6 šulinėlių plokštelės ir perkeltų su pcDNR 3,1 ZIC1 arba pcDNR 3,1 tuščias vektorius naudojant Fugene HD (Roche) pagal gamintojo instrukcijas. Po 48 h greičiu, transfectants buvo nuolat pasirinktas RPMI 1640 terpėje, turinčioje G418 (200-400 mikrogramų /ml) (Merck, Vokietija) 14 dienų.
RT-PGR ir kiekybinius realaus laiko PGR analizė
RNR ( 1 mikrogramų) buvo išgauti naudojant Trizol reagento (Invitrogen) šią gamintojo instrukcijas bei realizuojamas transkripcija į kDNR su M-MLV RTase kDNR sintezės Kit (Takara, Japonija). Stenograma lygiai ZIC1 ir Ša lėmė įprastinių RT-PGR TAKARA Taq polimerazės (Takara, Japonija) ar kiekybinis realiojo laiko PGR (KRL-PGR) su SYBR Žalioji magistras Mix Kit (Takara, Japonija) į ABI 7500 PGR sistema. Gruntai naudojami ZIC1 buvo F 5'-AAACTGGTTAACCACATCCGC ir R: 5'-CTCAAACTCGCACTTGAAGG. Ša buvo F 5'-GTAAGGACAAGTTGAACGCTTTG ir R: 5'-GATATGTGCCTTGGACTCGTAGTA. Gliceraldehido-3-; phosohate dehidrogenazės (GAPDH) buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. Stenograma lygiai išreiškiami kaip 2 -ΔΔCt vertybės ir santykinė išraiška kartų kaita yra normalizuotas GAPDH.
Mobilusis gyvybingumo tyrimą
Ląstelių gyvybingumas buvo aptiktas su nonradioactive ląstelių proliferacijos tyrimu su 3- (4,5- dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenil) -2 H-tetrazolio (MTS) reagentus (Promega, Madisonas, JAV). Stabilios transfekuotos ląstelės buvo padengtą 96 duobučių (2000 ląstelių /gerai) 6 valandas, 24 h, 72 ir 120 valandų. Absorbcija buvo matuojamas esant 490 nm po 1 h inkubacijos su CellTiter 96 Vandeninis vienas sprendimas reagento.
Mobilusis ciklo ir ląstelių apoptozė analizė
ląstelės ciklo skirstinių buvo aptikta tėkmės citometrijos analizė. Ląstelės transfektuotose pCDNA3.1-ZIC1 ar pCDNA3.1 tuščias vektorius buvo surinktos ir išplauti PBS. Korinio DNR buvo nudažomi su ląstelės ciklo dažymo tirpale, kuriame yra propidiumo jodido (PI), esant 4 ° C temperatūroje, tamsoje. Mobilusis ciklas buvo nustatoma naudojant FACS Calibur ir analizuojami su ModFitLT programinė įranga (Phoenix, JAV).
Mobilusis apoptozė buvo atliekama naudojant FITC aneksinu apoptozę nustatymo rinkinys II (BD Pharmingen) tėkmės citometrijos analizė. Laikinai Transfekuoti ląstelės buvo sustabdytas aneksinu įrišimas buferį. Tada FITC aneksinu ir PI sprendimai buvo pridėta iš eilės. Po inkubacijos 15 min, tamsintas ląstelės buvo analizuojami srauto FACScan tėkmės citometrijos (Becton Dickinson, JAV).
Ląstelių migraciją ir invazija tyrimai
Mobilusis migracija buvo įvertintas modifikuoto Boyden transwell rūmų tyrimas (Gruntinis, JAV). Trumpai, ląstelės buvo auginamos terpėje serumo neturinčioje 24 h ir 5 × 10 4 ląstelės buvo padengtą prie viršutinės kamerą 300 pL terpėje, turinčioje 5% FBS. Po 16 h inkubacijos, ne migruojančių ląstelių Aukštutiniame kambaryje buvo kruopščiai pašalinti vatos tamponu. Migravo Ląstelės buvo tamsintas su DAPI dažantį tirpalą. Mobilieji numeriai buvo atsitiktinai skaičiuojami penkių laukų (× 400 priartinimas).
Mobilusis invazija buvo atliktas miliporų 24-gerai padengtas BD Matrigel. Po to, kai badu terpėje serumo neturinčioje 24 h, 1 × 10 5 ląstelės buvo padengtą prie viršutinės kamerą 300 pL terpėje, turinčioje 5% FBS, o apatinis kamera buvo užpildyta 600 pL kultūros terpėje, turinčioje 15% FBS. Po to, kai buvo inkubuojami 30 h greičiu, membranos buvo inkubuojami su Mobilusis Stain tirpalo (Millorpore, JAV). Dažų mišinys plauti ekstrahuojant buferis ir perkeltas į 96-Na kolorimetrinę matavimo esant 560 nm bangos ilgiui.
Vakarų dėmė analizė
viso baltymai buvo paimti iš ląstelių, naudojant radijo Imunoprecipitacijos tyrimas lizės buferio papildyta proteazės inhibitorius. Lizatai išspręstas 6-12% SDS-PAGE minigels ir perkelti į PVDF membranos ( "Millipore, Bedford, MA). Membranos buvo užblokuotas 5% pieno su TBST ir inkubuojami 4 ° C naktį su šių antikūnų: ZIC1 (1: 500; Abcam), PHOSPHO-Akt (1: 1000; Mobilusis signalizacijos), Akt (1: 500; Abcam) PHOSPHO-ERK1 /2 (1: 1000; Mobilusis signalizacijos), ERK1 /2 (1: 1000; Mobilusis signalizacijos), P21 Waf1 /CIP1 (1: 1000; Mobilusis signalizacijos), P27 Kip1 (1: 500; Epitomics), cikloniniai D1 (1: 1000; Mobilusis signalizacijos) ir Ša (1: 1000; Mobilusis signalizacijos). Taigi, antriniai antikūnai suporuotos su krienų peroxidise (HRP) buvo ryškinamos naudojant liuminescencijos su Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Japonija). Santykinis tankis baltymų buvo kiekybiškai su vaizdo J. programinės įrangos ir normalizuotas beta-aktino. (1: 2500, Multisciences Biotech ")
kDNR mikrogardeliq analizė
viso RNR buvo išskirta iš MKN28 ląstelių, kurios stabiliai transfektuotose pCDNA3.1 -ZIC1 arba pCDNA3.1 tuščias vektorius, ir buvo atvirkštinis transkripcija į kDNR. Paženklinti mėginiai buvo hibridizuoj Agilent visas žmogaus genomas yra daugiau kaip 41.000 zondai (http:.....? //Www ncbi NLM NIH valst /GEO /užklausos /ACC CGI acc = GSE38924). Mikrogardeliq duomenys buvo analizuojami naudojant AGILENT požymių išskyrimas programinę įrangą. Mes pasirinkome sulankstomą pokyčius ≥ 1,5 arba ≤ -1,5 kaip reikšmingas skirtumas.
Statistinė analizė
Stjudento t pervežimas bandymas buvo atliktas palyginti dviejų nepriklausomų duomenų, o Chi-kvadrato ar žvejys tiksli bandymas buvo naudojamas analizuoti kategorinius kintamuosius. Atjungimo nuo p < 0,05 buvo taikomas statistinio reikšmingumo.
Notes
Jing Zhong, Shujie Chen prisidėjo vienodai prie šio darbo.
Deklaracijos
Padėka
Projektą parėmė Nacionalinis gamtos mokslo fondo Kinijos (30900676, 81071961), Nacionalinis pagrindinių mokslinių tyrimų programą Kinijos (973 programa) (2012CB945004) ir mokslo ir technologijų Pagrindiniai projekto Zhejiang Province, Kinija (2009 C03012-3). Autoriai dėkoja prof Tianhua Zhou ir prof Lei Guo už naudingų patarimų ir diskusijų; . Ir Tomas R. Ostinas kritiškai peržiūrėti ir redaguoti rankraščio
Elektroninės papildoma medžiaga
12885_2011_3201_MOESM1_ESM.tiff Papildoma failą 1: S1 paveiksle.
  • skrandžio straipsnis
    •   
  • skrandžio struktūra
    •   
  • Priežiūra skrandį
    •   
  • tyrimai

    • tyrimai

    tyrimai

    Other Languages

    skrandžio sveikatos © https://www.stomachillness.com/lt